Summary
לחץ תוך עיני מוגבר כרוני הנגרם באמצעות טיפול לייזר של meshwork trabecular בעיני עכבר. לחץ התוך עיני (IOP) הוא גבוה למשך מספר חודשים לאחר טיפול לייזר. הירידה של חדות ראייה ורגישות לקונטרסט של חיות ניסוי מנוטרת באמצעות בדיקת optomotor.
Abstract
גלאוקומה, קשורה לעתים קרובות עם לחץ התוך עיני גבוה (IOP), היא אחד הגורמים המובילים לעיוורון. אנחנו ביקש להקים במודל עכבר של לחץ תוך עיני מוגבר כדי לחקות אדם מתח גבוה גלאוקומה. כאן תאורת לייזר מוחלת על הקרנית לימבוס photocoagulate יצוא הימי, גרימת סגירת זווית. השינויים של IOP מנוטרים באמצעות tonometer ריבאונד לפני ואחרי הטיפול בליזר. מבחן התנהגות optomotor משמש למדידת שינויים מקבילים ביכולת ראייה. תוצאת הנציג מעכבר אחד שפיתחה העלאת לחץ תוך עיניים שנגרמה לאחר תאורת לייזר מוצגת. חדות ראייה ירדה ורגישות לעומת זאת הוא ציין בעכבר יתר לחץ דם עיני זה. יחד, המחקר שלנו מציג מערכת מודל בעל ערך לחקור ניוון עצבי והמנגנונים המולקולריים שבבסיס בעכברי גלאוקומה.
Protocol
נהלים
C57BL/6J עכברים (ג'קסון המעבדה, בר הרבור, ME) הם העלו במתקן הטיפול בבעלי החיים באוניברסיטת נורת'ווסטרן. כל בעלי החיים נמצאים בשימוש בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי טיפול באוניברסיטת נורת'ווסטרן בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש ותאם את ההנחיות בנוגע לשימוש בבעלי חיים במחקר מדעי המוח מ-NIH.
1. לייזר photocoagulation
ההליך של טיפול לייזר הוא שונה מפרוטוקולים שפורסמו בעבר 5-7.
- הרדימי עכבר 40-60 יום ישן על ידי זריקת intraperitoneal של קטמין (100 מ"ג / ק"ג, בריאות בעלי חיים שיין באטלר, OH) וxylazine (10 מ"ג / ק"ג, לויד Inc של איווה, אללי, IA).
- מרחיב את האישון של העין של בעלי החיים ניסיוני זכות על ידי טיפול מקומי עם טיפה אחת או שתיים של 1% פתרון סולפט (אטרופין אלקון Labs, Inc, פורט וורת', טקסס).
- לאחר mydriasis, לשטחקאמרי nterior כדי לשפר את האינדוקציה לייזר 6. הכנס micropipette זכוכית עם קצה חד (עולם מכשירי דיוק Inc, סרסוטה, פלורידה) אל תוך החלל הקדמי תחת מנורת הסדק (SL-3E, Topcon, אוקלנד, ניו ג'רזי) כדי לנקז את הנוזל בלשכה הקדמית.
- לרסן את העכבר בבעל חרוט פלסטיק (Braintree המדע בע"מ, MA) וקשר על פלטפורמה מתוצרת בית (ראה איור 1 א). החזק את העכבר עם עוצר וחושף את העין הימנית של העכבר למקור האור מאחורי מנורת הסדק. יישר את עינו של העכבר הרדים ממש מתחת למנורת הסדק.
- בעוד מחזיק את עוצר העכבר עם שתי ידיו, להחיל את תאורת לייזר לימבוס הקרנית באמצעות לייזר ארגון (Ultima 2000SE, קוהרנטית, סנטה קלרה, קליפורניה). לספק כ 80-100 נקודות לייזר (514 ננומטר, 100 מגה ואט, 50 אלפיות שני דופק, וספוט מיקרומטר 200) ניצב סביב ההיקף של meshwork trabecular. יש עכברי C57BL / 6 קשתית פיגמנט המשמש כמחסום לכל pאנרגיה תועה otential 7.
- להנחיל אקטואלי 0.5% moxifloxacin (אלקון Labs, Inc, פורט וורת', טקסס) על פני השטח של העין כדי לחטא את האזור שטופל בליזר ו0.5% Proparacaine (Bausch & Lomb, רוצ'סטר, ניו יורק) כדי להקל על כאב.
- שמור את החיה על כרית חימום (Sunbeam Products Inc, בוקה רטון, פלורידה) להתאוששות במשך כשעה עד שהוא ער לחלוטין.
- עין השמאל היא לא מטופל לשמש כשליטה.
2. מדידות לחצו תוך עיניות
- מניחים את העכבר ער לתוך צינור כדי לטעון לתוך מחזיק חרוט הפלסטיק ולאחר מכן לרסן אותה על הפלטפורמה (ראה איור 2 א).
- אפשר לחמש עד עשר דקות כדי לאפשר לעכבר מותאם למקבל את עמדת בעל. מתקרב tonometer הריבאונד (TonoLab, אספקה רפואית קולוניאלית, פרנקוניה, ניו המפשייר) לעין העכבר עד הקצה החללית הוא מהמשטח של קרנית 14 2-3 מ"מ.
- לחץ על לחצן מדידה כדי לאפשר הבדיקה הקצה פגע בשטח המרכזשל קרנית בעדינות. שלושה סטים רצופים של שש מדידות של לחץ תוך עיני של אותו עין ונרכשים בממוצע כIOP של העין. העין שליטת מטופל נמדדה תמיד ראשונה כדי לקבל קריאת בסיס לליזר בעיניים שטופלו שנמדדה הבא.
3. מבחן Optomotor
חדות ראייה ורגישות לניגודיות נבדקות 14,15. שתי העיניים של עכברים בודדים נבחנות בנפרד על ידי היפוך הכיוון הצורם נסחף, כלומר צורם נסחף כיוון השעון משמש לזיהוי תפקוד הראייה של עין השמאל וצורם נסחף נגד כיוון השעון לעין ימין 16. כל מבחן נמשכים כ -15 דקות וחוזר על עצמו על ידי שני משקיפים באופן עצמאי.
- מניחים את העכבר ולאפשר בעכבר כדי לנוע בחופשיות על פלטפורמה מוגבהת מוקפת בארבעה מסכי מחשב (איור 3A-B).
- להגדיר את המוניטורים בצורה אופקית, כך שהם נסחפים להציג סינוסישבכות כגירויים חזותיים עם בהירות ממוצעת של 39 cd / m 2. כיוון הזזת של הסורג צריך להחליף ברצף שבין עם כיוון שעון ונגד כיוון שעון.
- לנתח את התנועות של בעלי החיים. התנועות של בעלי החיים בקונצרט עם השבכות נסחפו נחשבות "חיובית" בתוך 15 שניות לאחר הגירוי החזותי הוא על ולאחר מכן עלה בהדרגה. התגובה-לעורר גירוי חזותי הגבוהה ביותר מוגדרת כחדות 17 של בעל החיים ויזואלי.
- לבחון את הרגישות לניגודיות בשלושה תדרים שנבחרו מראש מרחביים: 0.075, 0.16, ו 0.3 מחזורים לתואר (CPD). סף הניגוד לכל עין מוגדר כניגוד הנמוך ביותר שגורר תגובות חזותיות בתדירות הקבועה מראש. הרגישות לעומת זאת היא הדדית של הסף 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כפי שמתואר בנהלים, תאורת לייזר מכוונת לmeshwork trabecular באזור limbal לphotocoagulate יצוא הימי, גרימת סגירת זווית (איור 1). עיני lasered ביותר הציגו שום נזק פיזי משמעותי, ניתוק פיגמנט או זיהום, עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים 6. כאשר קבוצה קטנה של עכברים (פחות מ -5% מכל בעלי החיים lasered) הפגינה סימנים פיסיים של נזק חמור כגון מנוכה כדורי עין, ניתוק פיגמנט משמעותי חמור קטרקט, או דימום, אנחנו המורדמים באופן מיידי. כ -30% מעיני lasered פיתחה צלקות בקרנית קטנות, ורובם התאוששו תוך 1-2 שבועות לאחר טיפול לייזר.
מצאנו IOP הגבוה כמעט בכל עיניים שטופלו בליזר מלמעלה ממאה עכברים. לחץ התוך העיני של חיות ניסוי הוא פיקוח באמצעות tonometer ריבאונד (איור 2). איור 2 מציג דוגמה אחת לשינויים שליOP לפני ואחרי הטיפול בליזר. לפני הטיפול בלייזר, את הנקודות המוצא IOP של שתי עיניו של העכבר לא הראו הבדל: 15.7 מ"מ כספית (מימין) לעומת 14.7 מ"מ כספית (משמאל, יום 0, איור 2). שבעה ימים לאחר טיפול לייזר, לחץ התוך העיני של העין שטופלה (מימין) גדלו כמעט פי 2 ל -30.7 מ"מ כספית, בהשוואה לעין שלא טופלה (15.7 מ"מ כספית). לחץ התוך העיני של העין שטופלה בליזר נשאר גבוה ב26-28 מ"מ כספית למשך כ 4 חודשים: בגיל 4 חודשים לאחר טיפול, IOP הממוצע של העין שטופלה היה 26 מ"מ כספית, גבוה באופן משמעותי מזה של העין אינה מטופל (16.3 מ"מ כספית). כתוצאה מכך, לחץ התוך העיני של העין שטופלה ירד לאט לאט והגיע ל 18.7 מ"מ כספית בגיל 6 חודשים (24 שבועות) לאחר טיפול (העין מטופל: 15.3 מ"מ כספית). הנתונים שלנו מראים כי העלאת לחץ תוך עינית מתמשכת מושגת במשך יותר מ -4 חודשים.
בשלב הבא אנו אישר את אובדן הראייה באמצעות בדיקת optomotor (איור 3). היבטי אמצעי בדיקת ראייה מרחבית של optomotor באמצעות רפלקסיבית ראש-TRacking תנועות. איור 3 ג מציג ירידה של חדות ראייה של בעלי החיים נבחנו באיור 2. לפני טיפול לייזר, שתי העיניים הפגינו חדות רגילה (משמאל: 0.375 CPD; ימנית: 0.397 CPD; איור 3 ג). בשני חודשים לאחר טיפול לייזר, חדות של העין הימנית (IOP הגבוה) ירד באופן משמעותי בהשוואה בעין שמאל השליטה (משמאל: 0.45 CPD; ימני: 0.228 CPD; איור 3 ג). חדות של העין עם לחץ תוך עיני מוגבר נותר נמוכות ב 5-6 חודשים לאחר טיפול לייזר (משמאל: 0.378 CPD; ימני:. 0 258 CPD; איור 3 ג). כמו כן, רגישות לניגודיות תחתונה של עין ימין עם לחץ תוך עיני מוגבר נצפתה (איור 3D). בשני חודשים לאחר טיפול לייזר, רגישות ניגודיות של השליטה עזבה העין הייתה 6.13, בעוד שהעין הימנית הייתה 1.91 ב 0.075 CPD. הרגישות לקונטרסט של העין השמאלית והשליטה היה 5.53 2.67 0.16 וב0.3 CPD, בעוד שהעין הימנית הייתה 4.28 ו1.45, בהתאמה (איור 3D).
איור 1. טיפול לייזר של יצוא ההומור המימית בעיני עכבר. () תמונה של מנורת הסדק לטיפול בליזר. המפעיל מחזיק את העכבר עם עוצר ולאחר מכן מיישר את העין הימנית של העכבר למקור האור של מנורת הסדק. (BC) סכמטי צד ומול נוף של העין. המפעיל מחזיק את restrainers העכבר עם שתי ידי בעוד 80-100 נקודות לייזר מוחלות על האזור שבין ורידי episcleral והאישון המורחב.
איור 2. לחץ תוך עיני מוגבר לאחר טיפול לייזר. () כדי למדוד את לחץ התוך העיני ההתקנה באמצעות tonometer ריבאונד. (ב ')שינויים של לחץ תוך עיני של עכבר ניסוי אחד לאחר טיפול לייזר. כל נקודה היא ממוצעת של שלוש סדרות רצופות של שש מדידות של לחץ תוך עיני.
איור 3. ירידות של חדות ראייה ורגישות לקונטרסט עם העלאת לחץ תוך עינית. () ציור סכמטי של התקנת optomotor. (ב ') בעכבר על פלטפורמת המרכז במנגנון optomotor עם סורגים המוצגים בארבעה צגים שמסביב. (ג) חדות והרגישות לניגודיות של העכבר נבחן באיור 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מדווחים כי מעל לחץ תוך עיני מוגבר מתמשך יכול להיגרם על ידי תאורת לייזר בעיני עכבר. בהשוואה למודל הזרקת סליין 18 ומודל כויה וריד 11 שניהם דורשים מיומנויות microsurgical נרחבות, תאורת לייזר היא יחסית פשוטה וקלה לביצוע. בדרך כלל אנחנו יכולים לבצע את תאורת לייזר ל4-6 עכברים ב2-3 שעות. השלבים הקריטיים כדי להשיג העלאת לחץ תוך עינית ספגה הם הלשכה הקדמית משטחת לפני לייזר והפרמטרים לתאורת לייזר. לנקז את הנוזלים בלשכה הקדמית אפשרה למקד את לייזר לאזור meshwork trabecular ולמזער את הפגיעה בגוף הריסים סמוך וכלי דם 6. סוגים שונים של לייזר דווחו גם, למשל, חלק מהמחקרים נעשו שימוש בליזר דיודה עם אורך גל של 532 ננומטר 5,6 ואחרים השתמשו ב810 ננומטר אנרגיה פולסים 7 למקד meshwork trabecular וורידי episcleral ברג limbalיון. על מנת למקסם את נזק הזווית, הגדלנו את מספר הנקודות לייזר בהשוואה לדגמי לייזר שדווח בעבר 5-7. עם ההתקנה הניסיונית שלנו, כמעט בכל עכבר לייזר שטופל היה יותר מ 50% עלייה של לחץ תוך עיני בשבוע הראשון שלאחר טיפול לייזר, ביניהם כ -60% היו גבוהים IOP במשך יותר מ 2 חודשים. לעומת זאת, הזרקה תוך עיני אחת microbeads לתוך עיני עכבר יכולה לעורר גובה ~ 30% בלחץ התוך עיני במשך כמה שבועות (8 מחקר אחר הציע השפעה ארוכה יותר של לחץ תוך עיני גובה 9,10), וחסימה של ורידי limbal וepiscleral בבקן CD-1 עכברים מושרה העלאת לחץ תוך עינית חריפה רק לכמה ימים 13.
המדידה מדויקת של לחץ תוך עיני היא חשובה בקביעת השפעות לייזר על עיני עכבר. הרדמה שינתה את מדידת לחץ התוך העיני ואימון התנהגותי של עכברי וריאציה מופחתת לחץ תוך עיני בחיות ערות 9,19 באופן משמעותי. הנה, את חיות הניסוי היו GIven כמה לנוח ולהסתגל לעמדה המאופקת לפני מדידה על מנת לקבל קריאה של IOP עקבי דקות. כדי לאשר את מדידת לחץ התוך העינית היא אמינה ואינו תלויה באדם שביצע את הבדיקה, את אותם בעלי החיים אלה נבדקו על ידי שניים או שלושה בודקים שונים וחילוקי קריאות IOP הם בדרך כלל בתוך 5-15%.
בגלל ההשתנות של משך הזמן ומידת עליית לחץ תוך עיני, אובדן RGC שונה כבר דיווח במודלים של בעלי חיים שונים. לדוגמה, 20% אובדן של אקסונים נצפה בעיני עכבר עם microbeads זריקה 8. כ -20% מRGCs מתו בעיני חולדה בשישה שבועות לאחר תאורת לייזר בmeshwork trabecular, בעוד ש -60% מRGCs מתו עם תאורת לייזר בשניהם meshwork trabecular וורידי episcleral 5. הנתונים שלנו הראו 20-30% של אובדן RGC ב2 חודשים לאחר טיפול לייזר בעיני עכבר. עם זאת, כל מודלים של בעלי החיים שונים אלה של כרוני oיתר לחץ דם cular ללא דלקת משמעותית או נזק לחלקים אחרים של העיניים לספק לנו את הפוטנציאל כדי למדוד את ההשפעות ארוכות הטווח של לחץ תוך עיני מוגבר במבנה רשתית ותפקוד ראייה לאורך זמן.
מנצל את הטבע לא פולשנית של assay ההתנהגות החזותי המאפשר בדיקות סידורי כפונקציה של תנאים משתנים, ניתן לעקוב אחר השינויים של חדות ראייה ורגישות לניגודיות חודשים אחרי הגיוס של לחץ תוך עיני מוגבר. מבחן optomotor מספק הערכה מהירה של תפקוד ראייה ומעבר לכך, ניתן לבדוק את שתי העיניים בנפרד, מה שמאוד מקלה הניסויים שלנו, כי עין אחת של עכבר המטרה היא שטופלו בלייזר והשנייה נותרה בשלמותה כשליטה. במקביל, הוא ציין כי רפלקס optomotor לפעמים קשה להשתמש בשל פעילות הגבוהה ותשומת לב נודדת של עכברים מסוימים 12.
בשילוב עם העצמה של העכבר genetiCS, המודל שלנו מספק readout מעולה שבה לחקור את המנגנונים פתולוגיים במתח גבוה גלאוקומה. לדוגמה, שימוש בעכברים מהונדסים Thy-1-YFP, שבו יש מספר קטן של RGCs הכותרת 10,20-22, יכולים להיות צילמו את השינויים המבניים דנדריטים של RGCs הבודדים בעיניים עם לחץ תוך עיני מוגבר מתמשך. אנחנו הוכחנו שניוון הדנדריטים של RGCs תלוי במיקום ובתת בעיניים עיניות 23 עם יתר לחץ דם. אפופטוזיס תא או מסלולי איתות neuroprotective ניתן להשפיע עוד יותר in vivo לזהות את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של ניוון והישרדות בגלאוקומת RGC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
הכותבים הם עובדים במשרה מלאה באוניברסיטת נורת'ווסטרן.
החוקרים לא קיבל מימון שהועמד על ידי חברות אשר מייצרות ריאגנטים ומכשירים המשמשים במאמר זה.
Acknowledgments
העבודה הכלולה במסמך זה כבר נתמך על ידי פרס ד"ר דאגלס ח ג'ונסון לחקר גלאוקומה מבריאות סיוע הקרן האמריקנית (XL), פרס ויליאם ומרי Greve המיוחד Scholar מהמחקר למניעת עיוורון (XL), חברת אילינוי למניעת עיוורון (HC) והמענק NIH R01EY019034 (XL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| moxifloxacin | Alcon Labs, Inc. | NDC 0065-4013-03 | 0.5 %, Rx only |
| Proparacaine Hydrochloride | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | 0.5 %, Rx only |
| Ophthalmic Solution USP | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | .5 %, Rx only |
| ketamine | Butler Schein Animal Health | NDC 11695-0550-1 | 100 mg / kg |
| xylazine | LLOYD Inc. of Iowa | NADA 139-236 | 10 mg / kg |
| atropine sulfate solution | Alcon Labs, Inc. | NDC 61314-303-02 | 1 %, Rx only |
| Equipment | |||
| Slit Lamp, TOPCON | Visual Systems Inc | SL-3E | powered by PS-30A |
| OptoMotry 1.8.0 virtual | CerebralMechanics Inc. | ||
| opto-kinetic testing system | CerebralMechanics Inc. | ||
| Tonometer, TonoLab, for mice | Colonial Medical Supply | ||
| Heating pad | Sunbeam Products Inc | 722-810 | |
| Argon laser | Coherent Inc | Ultima 2000SE | |
| DECAPICONE Plastic cone holder | Braintree Sci Inc. | MDC-200 | for mouse |
References
- Gupta, N., Yucel, Y. H. Glaucoma as a neurodegenerative disease. Curr. Opin. Ophthalmol. 18, 110-114 (2007).
- Quigley, H. A. Neuronal death in glaucoma. Prog. Retin. Eye Res. 18, 39-57 (1999).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88, 816-824 (2009).
- Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. J. Glaucoma. 16, 483-505 (2007).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 402-410 (2002).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 4314-4320 (2003).
- Grozdanic, S. D. Laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4337-4346 (2003).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative ophthalmology & visual science. 51, 207-216 (2010).
- Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Experimental Eye Research. 92, 512-520 (2011).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3847-3857 (2012).
- Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61, 379-382 (1995).
- Chiu, K., Chang, R., So, K. F. Laser-induced chronic ocular hypertension model on SD rats. J. Vis. Exp. (10), e549 (2007).
- Fu, C. T., Sretavan, D. Laser-induced ocular hypertension in albino CD-1 mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 980-990 (2010).
- Rangarajan, K. V. Detection of visual deficits in aging DBA/2J mice by two behavioral assays. Curr. Eye Res. 36, 481-491 (2011).
- Wang, L., et al. Direction-specific disruption of subcortical visual behavior and receptive fields in mice lacking the beta2 subunit of nicotinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 29, 12909-12918 (2009).
- Douglas, R. M., et al. Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system. Visual Neuroscience. 22, 677-684 (2005).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 4611-4616 (2004).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64, 85-96 (1997).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 99, 27-35 (2012).
- Liu, X., et al. Brain-derived neurotrophic factor and TrkB modulate visual experience-dependent refinement of neuronal pathways in retina. J. Neurosci. 27, 7256-7267 (2007).
- Liu, X., et al. Regulation of neonatal development of retinal ganglion cell dendrites by neurotrophin-3 overexpression. The Journal of Comparative Neurology. 514, 449-458 (2009).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. The Journal of Comparative Neurology. 451, 115-126 (2002).
- Feng, L., et al. Sustained Ocular Hypertension Induces Dendritic Degeneration of Mouse Retinal Ganglion Cells that Depends on Cell-type and Location. Investigative Ophthalmology & Visual Science. , (2013).
