Summary
Ipertensione oculare cronica è indotta mediante fotocoagulazione laser del trabecolato negli occhi del mouse. La pressione intraoculare (IOP) è elevato per diversi mesi dopo il trattamento laser. La diminuzione di acuità visiva e la sensibilità al contrasto di animali da esperimento sono monitorati utilizzando il test optomotor.
Abstract
Glaucoma, frequentemente associata a elevata pressione intraoculare (IOP), è una delle principali cause di cecità. Abbiamo cercato di stabilire un modello murino di ipertensione oculare per imitare ad alta tensione umana glaucoma. Qui illuminazione laser è applicato al limbus corneale per fotocoagulare il deflusso acquosa, inducendo chiusura dell'angolo. Le variazioni di IOP sono controllati mediante un tonometro rimbalzo prima e dopo il trattamento laser. Un test comportamentale optomotor viene utilizzato per misurare corrispondenti variazioni della capacità visiva. Il risultato rappresentante di un topo che si è sviluppato subito dopo IOP elevazione illuminazione laser è indicato. Un acuità visiva diminuita e la sensibilità al contrasto sono osservati in questo oculare ipertensiva mouse. Insieme, il nostro studio introduce un sistema modello prezioso per studiare la degenerazione neuronale e dei meccanismi molecolari sottostanti nei topi glaucomatosi.
Protocol
Procedure
C57BL/6J topi (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) sono allevati presso la Northwestern University Animal Care strumento. Tutti gli animali sono utilizzati secondo protocolli approvati dalla Northwestern University Institutional Animal Care e del Comitato uso e conforme alle linee guida sull'uso degli animali in Neuroscience Research dal NIH.
1. Fotocoagulazione laser
La procedura di fotocoagulazione laser viene modificata dai protocolli precedentemente pubblicati 5-7.
- Anestetizzare un 40-60 giorni vecchio mouse con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg / kg, Butler Schein la salute degli animali, OH) e xilazina (10 mg / kg, Lloyd Inc. di Iowa, Shenandoah, IA).
- Dilatare la pupilla dell'occhio destro dell'animale sperimentale per il trattamento topico con una o due gocce di soluzione di solfato di atropina 1% (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX).
- Dopo midriasi, appiattire l'unacamera di nterior per migliorare l'induzione laser 6. Inserire una micropipetta di vetro con punta acuminata (World Precision Instruments Inc, Sarasota, FL) nello spazio anteriore sotto la lampada a fessura (SL-3E, Topcon, Oakland, NJ) per drenare il liquido nella camera anteriore.
- Frena il mouse in un supporto cono di plastica (Braintree Sci Inc., MA) e legato su una piattaforma fatta in casa (vedere Figura 1A). Tenere il mouse con dispositivo di immobilizzazione ed espone l'occhio destro del mouse per la fonte di luce dietro la lampada a fessura. Allineare l'occhio destro del mouse anestetizzato sotto la lampada a fessura.
- Tenendo premuto il dispositivo di immobilizzazione del mouse con entrambe le mani, applicare l'illuminazione laser per il limbus corneale utilizzando un laser ad Argon (Ultima 2000SE, Coherent, Santa Clara, CA). Trasporti circa 80-100 punti laser (514 nm, 100 mW, 50 msec impulsi e 200 pronti micron) perpendicolarmente intorno alla circonferenza del trabecolato. I topi C57BL / 6 hanno iride pigmentata che funge da barriera per ogni pPotenziali energia randagio 7.
- Instillare topico 0,5% moxifloxacina (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX) sulla superficie oculare per disinfettare la zona trattata con laser e 0,5% Proparacaine (Bausch & Lomb, Rochester, NY) per alleviare il dolore.
- Tenere l'animale su una piastra elettrica (Sunbeam Products Inc, Boca Raton, FL) per il recupero per circa un'ora fino a quando non è completamente sveglio.
- L'occhio sinistro è trattata per servire come controllo.
2. IOP Misure
- Posizionare il mouse svegli in un tubo di caricare nel porta cono di plastica e poi frenare sulla piattaforma (vedi Figura 2A).
- Consentire 9:55 minuti per lasciare il mouse ottenere adattato alla posizione di titolare. Avvicinatevi al tonometro rimbalzo (TonoLab, coloniale Medical Supply, Franconia, NH) per l'occhio del mouse fino a quando la punta della sonda è di 2-3 mm di distanza dalla superficie della cornea 14.
- Premere il tasto di misurazione per lasciare la punta della sonda ha colpito la superficie del centrodella cornea con delicatezza. Tre set consecutivi di sei misure di IOP dello stesso occhio sono acquisite e mediate come la IOP dell'occhio. L'occhio controllo non trattato è sempre misurato prima di ottenere una lettura di base per l'occhio laser-trattato che viene misurato dopo.
3. Prova Optomotor
Acuità visiva e la sensibilità al contrasto sono testati 14,15. Due occhi del singoli topi sono esaminati separatamente invertendo il senso reticolo deriva, cioè un reticolo deriva in senso orario viene utilizzato per identificare la funzione visiva dell'occhio sinistro e una grata alla deriva in senso antiorario per l'occhio destro 16. Ogni test richiede circa 15 minuti e si ripete da due osservatori in modo indipendente.
- Posizionare il mouse e lasciare il mouse per muoversi liberamente su una piattaforma elevata, circondato da quattro monitor per computer (Figura 3A-B).
- Impostare i monitor in modo da visualizzare alla deriva orizzontalmente sinusoidalegrate come stimoli visivi con luminanza media di 39 cd / m 2. La direzione di spostamento del reticolo deve alternare consecutivamente tra senso orario e antiorario.
- Analizzare i movimenti dell'animale. Movimenti degli animali in-concerto con le grate alla deriva sono considerati "positivi" entro 15 secondi dopo lo stimolo visivo è accesa e poi gradualmente aumentata. La risposta di elicitare massima stimolo visivo è definita come acuità visiva dell'animale 17.
- Esaminare la sensibilità al contrasto a tre pre-selezionati frequenze spaziali: 0.075, 0.16, e 0,3 cicli per grado (CPD). La soglia di contrasto per ciascun occhio è definita come la più bassa contrasto che suscita risposte visive alla frequenza prefissata. La sensibilità al contrasto è il reciproco della soglia 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Come descritto nelle Procedure, illuminazione laser è finalizzata alla trabecolato nella regione limbare fotocoagulare per il deflusso acquosa, inducendo chiusura di angolo (Figura 1). Occhi più esposte al laser senza significativi danni fisici, distacco pigmento o infezione, in linea con i risultati precedenti 6. Quando un piccolo gruppo di topi (meno del 5% di tutti gli animali al laser) espone i segni fisici di gravi danni, come palle sgonfie occhio, grave cataratta, distacco significativo pigmento, o sanguinamento, li abbiamo sacrificati immediatamente. Circa il 30% degli occhi al laser sviluppato cicatrici corneali minori, e la maggior parte dei quali recuperati entro 1-2 settimane dopo il trattamento laser.
Abbiamo trovato IOP elevata in quasi tutti gli occhi laser-trattati da più di un centinaio di topi. La IOP degli animali da esperimento è controllata mediante un tonometro rimbalzo (Figura 2). Figura 2B mostra un esempio dei cambiamenti di IOP prima e dopo il trattamento laser. Prima del trattamento laser, le linee di base IOP dei due occhi del topo ha mostrato alcuna differenza: 15,7 mmHg (destra) vs 14,7 mmHg (sinistra, giorno 0, la Figura 2B). Sette giorni dopo il trattamento laser, la IOP del (destra) occhio trattato aumentati quasi 2 volte al 30,7 mmHg, rispetto ad occhio non trattato (15,7 mmHg). La IOP di eye laser-trattato è rimasta elevata a 26-28 mmHg per circa 4 mesi: a 4 mesi dopo il trattamento, la pressione intraoculare media di occhio trattato è stato di 26 mmHg, significativamente superiore a quello dei non trattati occhio sinistro (16,3 mmHg). Successivamente, la pressione intraoculare dell'occhio trattata lentamente diminuita e ha raggiunto 18,7 mmHg a 6 mesi (24 settimane) dopo il trattamento (occhio non trattato: 15,3 mmHg). I nostri dati dimostrano che sostenuta IOP elevazione è ottenuta per più di 4 mesi.
Abbiamo poi confermato la perdita di visione utilizzando il test optomotor (Figura 3). Le optomotor test misura gli aspetti della visione spaziale tramite riflessiva testa-trACKing movimenti. Figura 3C mostra la diminuzione di acuità visiva dell'animale esaminato nella figura 2B. Prima che la laser-terapia, entrambi gli occhi esposti acutezza normale (sinistra: 0,375 CPD; Destra: 0,397 CPD; Figura 3C). A due mesi dopo il trattamento laser, l'acutezza dell'occhio destro (IOP) è diminuita in modo significativo rispetto al controllo occhio sinistro (Left: 0.45 CPD; Destra: 0.228 CPD; Figura 3C). L'acutezza dell'occhio con elevata pressione intraoculare è rimasto basso a 5-6 mesi dopo il trattamento laser (A sinistra: 0,378 CPD; destra:. 0 258 CPD; Figura 3C). Analogamente, è stata osservata una sensibilità al contrasto inferiore dell'occhio destro con IOP elevata (figura 3D). A due mesi dopo il trattamento laser, la sensibilità al contrasto del controllo occhio sinistro era 6.13, mentre l'occhio destro era 1,91 a 0,075 CPD. La sensibilità al contrasto dell'occhio sinistro controllo era 5,53 e 2,67 a 0,16 e 0,3 CPD, mentre l'occhio destro era 4,28 e 1.45, rispettivamente (Figura 3D).
Figura 1. La fotocoagulazione laser del deflusso dell'umore acqueo negli occhi del mouse. (A) Una foto della lampada a fessura per il trattamento laser. L'operatore tiene il mouse con dispositivo di immobilizzazione e poi allinea l'occhio destro del mouse per la sorgente di luce della lampada a fessura. (BC) schematica vista laterale e frontale-vista dell'occhio. L'operatore tiene i Dispositivi per la limitazione del mouse con entrambe le mani mentre 80-100 punti laser sono applicati alla zona tra le vene episclerali e la pupilla dilatata.
Figura 2. IOP aumentata dopo il trattamento laser. (A) Il setup per misurare la IOP con tonometro a rimbalzo. (B)Modifiche di IOP di un topo sperimentale dopo il trattamento laser. Ogni punto rappresenta la media di tre serie consecutive di sei misurazioni di IOP.
Figura 3. Variazioni negative di acuità visiva e la sensibilità al contrasto con IOP elevazione. (A) Schema del setup optomotor. (B) Un mouse sulla piattaforma centrale nell'apparato optomotor con griglie visualizzate quattro monitor circostanti. (C), l'acutezza e la sensibilità al contrasto del mouse esaminato nella figura 2B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Segnaliamo soprattutto che l'ipertensione oculare sostenuta può essere indotta da illuminazione laser negli occhi del mouse. Rispetto al modello iniezione salina 18 e il modello cauterizzazione vena 11 entrambi richiedono estese competenze microchirurgia, l'illuminazione laser è relativamente semplice e facile da eseguire. Di solito siamo in grado di eseguire l'illuminazione laser per 4-6 topi in 2-3 ore. I passi fondamentali per raggiungere sostenuta IOP elevazione sono la camera anteriore appiattimento prima laser e dei parametri per l'illuminazione laser. Scaricandola fluido nella camera anteriore facilitato per indirizzare il laser alla zona trabecolato e minimizzare il danno al vicino corpo ciliare e vasi sanguigni 6. Sono stati segnalati anche diversi tipi di laser, per esempio, alcuni studi hanno utilizzato un laser a diodi con lunghezza d'onda di 532 nm 5,6 e gli altri impiegati 810 nm energia impulsi 7 di indirizzare il trabecolato e vene episclerali nel limbare regione. Per massimizzare il danno angolo, abbiamo aumentato il numero di punti laser rispetto ai modelli laser precedentemente riportati 5-7. Con la nostra configurazione sperimentale, quasi ogni mouse laser-trattato aveva più del 50% di aumento della IOP entro la prima settimana dopo il trattamento laser, fra cui circa il 60% aveva elevato IOP per più di 2 mesi. Al contrario, una iniezione intraoculare di microperle negli occhi del mouse può suscitare un ~ 30% elevazione della PIO per un paio di settimane 8 (un altro studio ha suggerito un effetto più lungo della IOP elevazione 9,10), e l'occlusione delle vene limbari e episclerale in albino topi CD-1 indotte solo una PIO elevazione acuta per un paio di giorni 13.
La misurazione accurata della IOP è importante per determinare gli effetti laser sugli occhi mouse. Anestesia alterato in modo significativo la misurazione della IOP e formazione comportamentale di topi ridotto variazione IOP in animali svegli 9,19. Qui, gli animali da esperimento sono stati gIven qualche minuto di riposo e di adattarsi alla posizione trattenuto prima della misurazione, al fine di ottenere letture coerenti di IOP. Per confermare la misurazione della IOP è affidabile e non dipende dalla persona che ha eseguito il test, gli stessi animali sono stati esaminati da due o tre differenti tester e le loro differenze di letture IOP sono generalmente entro 5-15%.
A causa della variabilità della durata e del grado di IOP elevazione, perdita RGC differente è stato riportato in diversi modelli animali. Per esempio, una perdita del 20% di assoni è stata osservata in occhi topo con microsfere di iniezione 8. Circa il 20% dei RGCs morì a occhi ratto a sei settimane dopo l'illuminazione laser sul trabecolato, mentre circa il 60% di RGCs morto con illuminazione laser sia trabecolare che le vene episclerali 5. I nostri dati hanno mostrato un 20-30% di perdita di RGC a 2 mesi dopo il trattamento laser agli occhi del mouse. Tuttavia, tutti questi diversi modelli animali di cronica olare senza ipertensione notevole infiammazione o danni ad altre parti degli occhi ci forniscono la possibilità di misurare gli effetti a lungo termine di ipertensione oculare sulla struttura della retina e la funzione visiva nel corso del tempo.
Sfruttando la natura non invasiva del test comportamentale visivo che consente verifiche seriali in funzione delle mutate condizioni, le variazioni di acuità visiva e la sensibilità al contrasto possono essere monitorati per mesi dopo l'induzione di ipertensione oculare. Il test optomotor fornisce una valutazione rapida della funzione visiva, inoltre, i due occhi possono essere testati separatamente, che facilita notevolmente nostri esperimenti perché uno occhio del mouse bersaglio è laser-trattata e l'altra è lasciata intatta come controllo. Allo stesso tempo, si osserva che il riflesso optomotor talvolta è difficile usare a causa della elevata attività e vagando attenzione di alcuni topi 12.
Combinata con la potenza di topo geneticamentecs, il nostro modello offre una superba lettura con cui studiare i meccanismi patologici in alta tensione glaucoma. Ad esempio, utilizzando Thy-1-YFP topi transgenici, che ha un piccolo numero di RGCs etichettati 10,20-22, le dendritiche cambiamenti strutturali dei singoli RGCs possono essere esposte in occhi con ipertensione oculare sostenuta. Abbiamo dimostrato che la degenerazione dendritica di RGCs dipende dalla posizione e sottotipi in oculari occhi ipertesi 23. Apoptosi cellulare o neuroprotettivi vie di segnalazione possono essere ulteriormente manipolati in vivo di identificare i meccanismi molecolari alla base della degenerazione RGC e la sopravvivenza nel glaucoma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Gli autori sono dipendenti a tempo pieno della Northwestern University.
Gli autori hanno ricevuto alcun finanziamento che è stato fornito da aziende che producono reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.
Acknowledgments
Il lavoro contenuto in questo documento è stata sostenuta dal Dr. Douglas H. Johnson Award per il Glaucoma Research dalla American Health Assistance Foundation (XL), la William & Mary Greve Scholar Award speciale della ricerca per prevenire la cecità (XL), il Illinois Società per la Prevenzione della Cecità (HC) e NIH concedere R01EY019034 (XL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| moxifloxacin | Alcon Labs, Inc. | NDC 0065-4013-03 | 0.5 %, Rx only |
| Proparacaine Hydrochloride | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | 0.5 %, Rx only |
| Ophthalmic Solution USP | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | .5 %, Rx only |
| ketamine | Butler Schein Animal Health | NDC 11695-0550-1 | 100 mg / kg |
| xylazine | LLOYD Inc. of Iowa | NADA 139-236 | 10 mg / kg |
| atropine sulfate solution | Alcon Labs, Inc. | NDC 61314-303-02 | 1 %, Rx only |
| Equipment | |||
| Slit Lamp, TOPCON | Visual Systems Inc | SL-3E | powered by PS-30A |
| OptoMotry 1.8.0 virtual | CerebralMechanics Inc. | ||
| opto-kinetic testing system | CerebralMechanics Inc. | ||
| Tonometer, TonoLab, for mice | Colonial Medical Supply | ||
| Heating pad | Sunbeam Products Inc | 722-810 | |
| Argon laser | Coherent Inc | Ultima 2000SE | |
| DECAPICONE Plastic cone holder | Braintree Sci Inc. | MDC-200 | for mouse |
References
- Gupta, N., Yucel, Y. H. Glaucoma as a neurodegenerative disease. Curr. Opin. Ophthalmol. 18, 110-114 (2007).
- Quigley, H. A. Neuronal death in glaucoma. Prog. Retin. Eye Res. 18, 39-57 (1999).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88, 816-824 (2009).
- Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. J. Glaucoma. 16, 483-505 (2007).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 402-410 (2002).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 4314-4320 (2003).
- Grozdanic, S. D. Laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4337-4346 (2003).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative ophthalmology & visual science. 51, 207-216 (2010).
- Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Experimental Eye Research. 92, 512-520 (2011).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3847-3857 (2012).
- Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61, 379-382 (1995).
- Chiu, K., Chang, R., So, K. F. Laser-induced chronic ocular hypertension model on SD rats. J. Vis. Exp. (10), e549 (2007).
- Fu, C. T., Sretavan, D. Laser-induced ocular hypertension in albino CD-1 mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 980-990 (2010).
- Rangarajan, K. V. Detection of visual deficits in aging DBA/2J mice by two behavioral assays. Curr. Eye Res. 36, 481-491 (2011).
- Wang, L., et al. Direction-specific disruption of subcortical visual behavior and receptive fields in mice lacking the beta2 subunit of nicotinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 29, 12909-12918 (2009).
- Douglas, R. M., et al. Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system. Visual Neuroscience. 22, 677-684 (2005).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 4611-4616 (2004).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64, 85-96 (1997).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 99, 27-35 (2012).
- Liu, X., et al. Brain-derived neurotrophic factor and TrkB modulate visual experience-dependent refinement of neuronal pathways in retina. J. Neurosci. 27, 7256-7267 (2007).
- Liu, X., et al. Regulation of neonatal development of retinal ganglion cell dendrites by neurotrophin-3 overexpression. The Journal of Comparative Neurology. 514, 449-458 (2009).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. The Journal of Comparative Neurology. 451, 115-126 (2002).
- Feng, L., et al. Sustained Ocular Hypertension Induces Dendritic Degeneration of Mouse Retinal Ganglion Cells that Depends on Cell-type and Location. Investigative Ophthalmology & Visual Science. , (2013).
