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Medicine

激光诱导的慢性高眼压表征视觉缺陷的小鼠模型

doi: 10.3791/50440 Published: August 14, 2013

Summary

慢性高眼压诱导使用激光光凝小梁在小鼠眼睛。激光治疗后的几个月内升高的眼压(IOP)。减少实验动物的视力和对比敏感度使用optomotor测试监测。

Abstract

经常伴有高眼压(IOP),青光眼,失明的主要原因之一。我们试图建立高眼压症的小鼠模型来模拟人类高眼压性青光眼。这里激光照射施加到角膜缘photocoagulate水外流,诱导闭角。使用激光治疗之前和之后的反弹式眼压计的眼压的变化进行监测。是用于测量相应的变化在视觉能力一个optomotor的行为测试。代表性的结果显示从一个鼠标开发激光照射后持续高眼压。下降的视力,对比敏感度观察在高眼压鼠标。总之,我们的研究引入了一个有价值的模型系统研究青光眼的小鼠神经元变性的分子机制。

Protocol

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程序

C57BL/6J小鼠(杰克逊实验室的Bar Harbor,ME)提出在西北大学的动物护理设施。按照协议,由西北大学机构动物护理和使用委员会,符合使用动物在神经科学的研究由美国国立卫生研究院的指引批准用于所有动物。

1。激光光凝

从先前公布的5-7协议的程序修改光凝。

  1. 麻醉40-60日龄鼠标,腹腔内注射氯胺酮(100毫克/公斤,管家施恩动物健康,OH)和甲苯噻嗪(10毫克/千克,劳埃德公司,雪兰爱荷华,IA)。
  2. 实验动物的右眼的瞳孔扩张,局部治疗与一个或两个滴1%硫酸阿托品溶液(爱尔康实验室公司,德克萨斯州沃思堡)。
  3. 瞳孔散大,后压平了内六角圆柱腔,以提高激光诱导6。插入玻璃微裂隙灯下前间隙(SL-3E,拓普康,奥克兰,新泽西州)锐利尖端(世界精密仪器公司,萨拉索塔,佛罗里达州),前房液排出。
  4. 抑制鼠标在一个的塑料锥持有布伦特里科学公司(MA)和自制的平台上捆绑起来( 见图 1a)。按住鼠标限制器和公开右眼裂隙灯背后的光源的鼠标。麻醉鼠标对准右眼裂隙灯下。
  5. 用双手按住鼠标限制器,适用于激光照射到角膜缘使用氩激光(终极2000SE,相干,圣克拉拉,CA)。提供约80-100激光点(514纳米,100毫瓦,50毫秒的脉冲,和200μm的光斑)垂直的圆周周围的小梁。 C57BL / 6小鼠虹膜色素作为任意的p的一个障碍otential杂散能量7。
  6. 灌输外用0.5%莫西沙星(爱尔康实验室公司,沃斯堡,德克萨斯州)眼球表面的消毒激光治疗的面积和0.5%的丙美卡因(博士伦,纽约州罗切斯特市),以减轻疼痛。
  7. 动物保持一个加热垫(新光产品公司,佛罗里达州博卡拉顿)恢复了大约一个小时,直到它完全清醒。
  8. 左眼是未经处理的作为对照。

2。眼压测量

  1. 将清醒的鼠标成筒装入塑料锥持有人,然后克制它的平台上( 见图 2a)。
  2. 允许五到十分钟,让鼠标适应持有人的位置。接近反弹眼压(TonoLab,殖民地医疗用品,新罕布什尔州Franconia)老鼠的眼睛,直到探头尖端是2-3毫米,从表面角膜14。
  3. 按下测量键,让探头尖击中中心表面轻轻角膜。连续三组六相同的眼眼压测量采集和眼的眼压的平均值。未处理的对照眼总是首先测量测量激光治疗眼睛得到一个基准值。

3。 Optomotor测试

视力及对比敏感度测试14,15。个别老鼠的两只眼睛进行检查,分别由反转的漂流的光栅方向, 沿顺时针漂流光栅是用来识别的视觉功能的左眼和用于右眼16沿反时针的漂移光栅。每个测试大约需要15分钟,由两个独立观察家重复。

  1. 将鼠标,让鼠标上自由移动的高架平台,四周由四个电脑显示器( 图3A-B)。
  2. 设置了监视器,让他们显示水平漂流正弦的光栅作为视觉刺激,平均亮度为39 cd /米2。光栅的移动方向上应交替 之间连续的顺时针和逆时针。
  3. 分析动物的运动。漂流光栅音乐会动物的动作被认为是“积极的”视觉刺激后,在15秒内,然后逐渐增加。最高的响应被定义为引发视觉刺激动物的视力17。
  4. 检查对比敏感度在预先选定的三个空间频率:0.075,0.16,和0.3个周期,每度(CPD)。为每只眼睛的对比度阈值被定义为,在预先固定的频率引出的视觉反应的最低对比度。对比敏感度的阈值17的倒数。

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Representative Results

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中所描述的程序,目的是激光照明在角膜缘的区域photocoagulate水外流的小梁,诱导闭角型青光眼( 图1)。大多数光刻眼睛表现出没有明显的物理伤害,色素脱落或感染,与以前的研究结果相一致6。当一小群​​小鼠(小于5%所有的光刻动物)展出,如的瘪眼球,严重的白内障,显着的色素支队,或出血严重损害的体征,我们立刻处死他们。约有30%的光刻眼睛轻微的角膜疤痕,其中大部分激光治疗后1-2个星期内恢复。

我们发现从一百多个小鼠在几乎所有的激光治疗眼眼压升高。实验动物的眼压监测使用一个反弹式眼压计( 图2),图2B示出的I的变化的一个例子的激光治疗之前和之后的OP。激光治疗前,鼠标的两个眼睛的眼压基线无显着差异:15.7毫米汞柱(右)和14.7毫米汞柱(左,0天, 图2B)。激光处理后七天,处理过的(右)眼的眼压增加了近2倍至30.7毫米汞柱,较未处理的眼(15.7毫米汞柱)。激光治疗眼的眼压持续升高26-28毫米汞柱,约4个月治疗后4个月,治疗眼的平均眼压为26毫米汞柱,明显高于未经处理的左眼(16.3毫米汞柱)。随后,处理过的眼睛的眼压缓慢下降,在6个月(24周)治疗后(未处理的眼睛:15.3毫米汞柱)达到18.7毫米汞柱。我们的数据表明,超过4个月实现持续高眼压。

接下来,我们证实了视力减退,使用的optomotor测试( 图3)。空间视觉的optomotor测试措施方面通过反身头TR进行确认动作, 图3C示出的动物的视力检查在图2B中的减少。激光治疗前,双眼表现出正常视力(左:0.375 CPD;右:0.397 CPD; 图3C)。在两个月的激光治疗后视力右眼眼压升高眼睛(左:左控制相比显着下降0.45 CPD;右:0.228 CPD 图3C)。视力眼眼压升高仍然偏低,激光治疗后5-6个月(左:0.378 CPD;右:0。258 CPD; 图3C)。同样,较低的对比灵敏度高眼压右眼观察到( 图3D)。对比敏感度的控制在激光治疗后2个月,左眼为6.13,而右眼为1.91 0.075 CPD。对比敏感度的控制左眼为5.53和2.67,0.16和0.3 CPD,而右眼为4.28和1。45,分别为( 图3D)。

图1
图1。激光光凝鼠眼房水的流出(A)激光治疗裂隙灯照片。操作者将鼠标限制器,然后对齐鼠标的右眼裂隙灯(BC)的管脚的侧视和前视眼睛的光源。操作者将鼠标同时用双手夹持器上巩膜静脉和扩张的瞳孔之间的区域施加80-100个激光点。

图2
图2。激光治疗后眼压上升(A)设置使用反弹式眼压计测量眼压(B)激光治疗后的一个实验小鼠的眼压变化。每个点是平均六测量眼压的三个连续的套。

图3
图3。减少视力和对比敏感度与高眼压(A)示意图的optomotor设置(B)(C)的视力和对比敏感度鼠标四周围的监视器上显示的optomotor设备与光栅的中心平台。检查鼠标在图2B中。

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Discussion

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我们报告以上,持续的高眼压可诱发小鼠眼睛的激光照射。盐水注射模型18和静脉烧灼模型的11两者都需要广泛的显微技能相比,激光照射是相对简单和容易执行的。通常情况下,我们就可以进行激光照射4-6小鼠在2-3小时。实现持续的高眼压的关键步骤是前房压扁之前,激光和激光照射的参数。排水便于目标激光的小梁区和减少伤害到附近的睫状体和血管6的前房中的流体。不同类型的激光也有报道,例如,一些研究中使用的二极管激光器的波长为532nm的5,6和其他的用810 nm的能量脉冲7目标角膜缘章第小梁网和上巩膜静脉根离子。为了最大限度地提高角度的损失,我们已经增加激光点的数目较先前报告的激光模型5-7。与我们的实验设置,几乎每个鼠标激光治疗,激光治疗后,其中约60%有升高的眼压超过2个月的第一周增加50%以上,眼压。相比之下,一个鼠标的眼睛可以引起眼内注射的微珠〜30%抬高了几个星期8(另一项研究中提出了一个较长的高眼压效果9,10)的眼压,角膜缘和巩膜静脉闭塞的白化CD-1小鼠诱发急性高眼压几天13。

眼压的准确测量是很重要的,在确定对小鼠眼睛的激光效果。麻醉显着改变眼压测量行为训练老鼠在清醒动物9,19降低眼压变化。在此,作为实验的动物是克请几分钟IVEN休息和调整前的内敛的位置,为了得到一致的读数眼压测量。要确认的IOP测量是可靠的,不依赖于执行测试的人由两个或三个不同的测试仪和IOP读数的差异,一般在5%到15%之内,同样的检查动物。

由于高眼压的持续时间和程度的变化,不同的RGC损失据报道,在不同的动物模型。例如,有20%的损失轴突已在小鼠的眼睛观察到,与微球注射剂,8。大约有20%的大鼠眼睛的视网膜神经节细胞死亡在6周的小梁激光照射后,激光照射,而60%左右的视网膜神经节细胞死亡的小梁和巩膜静脉5。我们的数据显示,RGC的损失在20-30%的激光治疗2个月后,在小鼠眼睛。然而,所有这些不同的动物模型中的慢性o丘拉尔高血压但无明显的炎症或损伤眼睛的其他部分为我们提供长期高眼压的影响随着时间的推移视网膜的结构和视觉功能的潜力来衡量。

利用的非侵入性的性质的视觉行为的检测,作为变化的条件的函数允许串行测试,视力和对比敏感度的变化可以被监测,高眼压症的诱导后半年。的optomotor测试提供了一个快速评估视觉功能;此外,两只眼睛可以单独进行测试,大大方便了我们的实验中,因为一只眼睛的目标鼠标是激光治疗,另一种是原封不动作为控制。在同一时间,另外,的optomotor反射有时很难使用,由于高活性和徘徊注意一些老鼠12。

结合的小鼠geneti与电力CS,我们的模型提供了一个极好的读数调查高眼压性青光眼的病理机制。例如,使用THY-1-YFP的转基因小鼠视网膜神经节细胞标记10,20-22,其中有一个小数目,个人的视网膜神经节细胞的树突结构的变化可以成像在眼睛与持续的高眼压。我们已经证明,视网膜神经节细胞的树突状变性取决于位置和亚型在高眼压的眼睛23。细胞凋亡或神经保护作用的信号通路可以进一步在体内操纵,以识别潜在的分子机制在青光眼RGC变性和生存。

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Disclosures

作者宣称,他们有没有竞争经济利益。

作者是美国西北大学的全职雇员。

作者没有收到拨款,在这篇文章中所使用的试剂和仪器的公司,生产提供。

Acknowledgments

本文所载的工作已经得到了青光眼研究由美国健康援助基金会(XL),威廉&玛丽格雷夫特别学术研究奖,以防止失明(XL),博士道格拉斯·约翰逊奖伊利诺伊防盲协会(HC)和美国国立卫生研究院:授予R01EY019034(XL)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
moxifloxacin Alcon Labs, Inc. NDC 0065-4013-03 0.5 %, Rx only
Proparacaine Hydrochloride Bausch Lomb NDC 24208-730-06 0.5 %, Rx only
Ophthalmic Solution USP Bausch Lomb NDC 24208-730-06 .5 %, Rx only
ketamine Butler Schein Animal Health NDC 11695-0550-1 100 mg / kg
xylazine LLOYD Inc. of Iowa NADA 139-236 10 mg / kg
atropine sulfate solution Alcon Labs, Inc. NDC 61314-303-02 1 %, Rx only
Equipment
Slit Lamp, TOPCON Visual Systems Inc SL-3E powered by PS-30A
OptoMotry 1.8.0 virtual CerebralMechanics Inc.
opto-kinetic testing system CerebralMechanics Inc.
Tonometer, TonoLab, for mice Colonial Medical Supply
Heating pad Sunbeam Products Inc 722-810
Argon laser Coherent Inc Ultima 2000SE
DECAPICONE Plastic cone holder Braintree Sci Inc. MDC-200 for mouse

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References

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Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects. J. Vis. Exp. (78), e50440, doi:10.3791/50440 (2013).More

Feng, L., Chen, H., Suyeoka, G., Liu, X. A Laser-induced Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension to Characterize Visual Defects. J. Vis. Exp. (78), e50440, doi:10.3791/50440 (2013).

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