Summary
Chronische oculaire hypertensie wordt opgewekt met behulp van laserfotocoagulatie van de trabekelnetwerk in muis ogen. De intraoculaire druk (IOP) wordt verhoogd tot verscheidene maanden na laserbehandeling. De daling van de gezichtsscherpte en contrastgevoeligheid proefdieren worden gecontroleerd met behulp van de optomotor-test.
Abstract
Glaucoom, vaak geassocieerd met verhoogde intraoculaire druk (IOP), een van de belangrijkste oorzaken van blindheid. We wilden een muismodel van oculaire hypertensie te bootsen menselijke high-drukglaucoom stellen. Hier laser verlichting wordt toegepast op het corneale limbus de waterige uitstroom photocoagulate, induceren geslotenhoekglaucoom. De veranderingen van IOP worden geanalyseerd met een rebound tonometer voor en na de laserbehandeling. Een optomotor gedragstest wordt gebruikt om overeenkomstige wijzigingen in de visuele capaciteit te meten. De vertegenwoordiger resultaat van de ene muis die opgelopen IOP hoogte ontwikkeld na de laser verlichting wordt getoond. Een verminderde gezichtsscherpte en contrastgevoeligheid wordt waargenomen in deze oculaire hypertensie muis. Samen, onze studie introduceert een waardevol modelsysteem om neuronale degeneratie en de onderliggende moleculaire mechanismen te onderzoeken in glaucomateuze muizen.
Protocol
Procedures
C57BL/6J-muizen (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) worden opgewekt aan de Northwestern University's Animal Care Facility. Alle dieren worden gebruikt in overeenstemming met de door de Northwestern University Institutional Animal Care en gebruik Comite en gelijkvormig aan de richtlijnen inzake het gebruik van dieren in Neuroscience Research van de NIH goedgekeurde protocollen.
1. Laserfotocoagulatie
De procedure van laserfotocoagulatie is gewijzigd ten opzichte van eerder gepubliceerde protocollen 5-7.
- Verdoven een 40-60 dagen oude muis door een intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg / kg, Butler Schein diergezondheid, OH) en xylazine (10 mg / kg, Lloyd Inc van Iowa, Shenandoah, IA).
- Verwijden de pupil van het rechteroog van het proefdier door plaatselijke behandeling met een of twee druppels 1% atropine sulfaat-oplossing (Alcon Labs, Inc, Fort Worth, TX).
- Na mydriasis, plat de eennterior kamer om laser inductie verbeteren 6. Plaats een glazen micropipet met scherpe tip (World precisie-instrumenten Inc, Sarasota, FL) in de voorste ruimte onder de spleetlamp (SL-3E, Topcon, Oakland, NJ) om uit te lekken uit de vloeistof in de voorste oogkamer.
- Beperken de muis in een plastic kegel houder (Braintree Sci Inc, MA) en vastgebonden op een zelfgemaakt platform (zie figuur 1A). Houd de muis met weerhouder en onthult het rechteroog van de muis om de lichtbron achter de spleetlamp. Lijn de rechter oog van de verdoofde muis onder de spleetlamp.
- Terwijl u de muis restrainer met beide handen, gelden de laser verlichting aan de hoornvlies limbus met een Argon laser (Ultima 2000SE, Coherent, Santa Clara, CA). Lever ongeveer 80-100 laserspots (514 nm, 100 mW, 50 msec puls en 200 urn spot) loodrecht rond de omtrek van het trabeculaire netwerk. De C57BL / 6 muizen hebben gepigmenteerde iris die als een barrière voor elke p fungeertotential verdwaalde energie 7.
- Instill topische 0.5% moxifloxacine (Alcon Labs, Inc, Fort Worth, TX) op het oculaire oppervlak om de laser-behandelde stippellijn 0,5% proparacaïne (Bausch & Lomb, Rochester, NY) om pijn te verlichten desinfecteren.
- Houd het dier op een verwarmingselement (Sunbeam Products Inc, Boca Raton, FL) voor herstel voor ongeveer een uur totdat het volledig wakker.
- Het linkeroog onbehandeld te dienen als controle.
2. IOP Metingen
- Plaats de wakkere muis in een buis te laden in de kunststof conus houder en dan beperken zij op het platform (zie Figuur 2A).
- Laat 5-10 minuten zodat de muis krijgt aangepast aan de houder plaats. Benader de rebound tonometer (TonoLab, Koloniale Medical Supply, Franconia, NH) om de muis oog totdat de sonde tip is 2-3 mm afstand van het oppervlak van het hoornvlies 14.
- Druk op de knop meting te laten de sonde raken het midden oppervlakvan het hoornvlies voorzichtig. Drie opeenvolgende sets van zes metingen van IOP van hetzelfde oog worden verkregen en gemiddeld de IOP van het oog. De onbehandelde controle oog wordt altijd eerst gemeten om een nulmeting voor de laser-behandelde oog dat de volgende keer wordt gemeten krijgen.
3. Optomotor Test
Gezichtsscherpte en contrastgevoeligheid getest 14,15. De twee ogen van individuele muizen worden afzonderlijk onderzocht door het omkeren van de richting drijven raster, dat wil zeggen een klok drifting raster gebruikt om de visuele functie van het linkeroog en linksom drijven raster voor het rechteroog 16 identificeren. Elke test duurt ongeveer 15 minuten en wordt herhaald door twee waarnemers onafhankelijk van elkaar.
- Plaats de muis en laat de muis om vrij te bewegen op een verhoogd platform omringd door vier computerschermen (figuur 3A-B).
- Het opzetten van de monitoren, zodat ze elkaar horizontaal drijven sinusvormigeroosters als visuele stimuli met een gemiddelde lichtsterkte van 39 cd / m 2. De bewegingsrichting van het rooster moeten afwisselen achtereenvolgens tussen de klok mee en tegen de klok in.
- Analyseer de bewegingen van het dier. De bewegingen van het dier in-concert met de drijvende roosters worden beschouwd als "positief" binnen 15 seconden na de visuele stimulus is en vervolgens geleidelijk verhoogd. De hoogste respons uitlokken visuele stimulus wordt gedefinieerd als gezichtsscherpte het dier 17.
- Onderzoekt de contrastgevoeligheid op drie vooraf geselecteerde ruimtelijke frequenties: 0.075, 0.16 en 0.3 cycli per graad (CPD). Het contrast drempel voor elk oog wordt gedefinieerd als de laagste contrast die visuele responsen uitlokt bij de vooraf vastgestelde frequentie. De contrastgevoeligheid is het omgekeerde van de drempel van 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Zoals beschreven in de procedures wordt laserbelichting gericht op het trabeculaire maaswerk van het limbale gebied van de waterige uitstroom photocoagulate, induceren geslotenhoekglaucoom (figuur 1). De meeste gelaserde ogen vertoonden geen significante fysieke schade, pigment onthechting of infectie, in overeenstemming met eerdere bevindingen 6. Bij een kleine groep muizen (minder dan 5% van alle gelaserde dieren) vertoonden lichamelijke tekenen van ernstige schade, zoals leeggelopen oog ballen, ernstige cataract, significante pigment onthechting, of bloeden, we geëuthanaseerd ze meteen. Ongeveer 30% van gelaserde ogen ontwikkelde kleine hoornvlies littekens, en de meeste van hen teruggevonden binnen 1-2 weken na de laserbehandeling.
We vonden verhoogde IOP in bijna elke laser behandelde ogen meer dan honderd muizen. De IOP proefdieren wordt geanalyseerd met een rebound tonometer (Figuur 2). Figuur 2B toont een voorbeeld van de verandering van IOP voor en na de laserbehandeling. Vóór laserbehandeling, het IOP basislijnen van de twee ogen van de muis gaf geen verschil: 15,7 mmHg (rechts) versus 14,7 mmHg (links, Dag 0, Figuur 2B). Zeven dagen na de laserbehandeling, de IOP van het behandelde (rechter) oog met bijna 2-voudig tot 30,7 mmHg, vergeleken met de onbehandelde ogen (15,7 mmHg). De IOP van laser behandelde oog bleef verhoogd op 26-28 mmHg gedurende 4 maanden: 4 maanden na de behandeling, de gemiddelde IOP behandelde oog werd 26 mmHg, aanzienlijk hoger dan die van onbehandelde linkeroog (16,3 mmHg). Vervolgens, de IOP van het behandelde oog langzaam af en 18,7 mmHg na 6 maanden (24 weken) na behandeling (onbehandelde oog: 15.3 mmHg). Onze gegevens tonen aan dat langdurig IOP hoogte is bereikt voor meer dan 4 maanden.
We volgende bevestigde het verlies van gezichtsvermogen met behulp van de optomotor test (Figuur 3). De optomotor test meet aspecten van ruimtelijke visie via reflexieve head-trERPAKKINGSINSTRUCTIES bewegingen. Figuur 3C toont de daling van de gezichtsscherpte van de onderzochte in figuur 2B dier. Voordat de laser-behandeling, beide ogen vertoonden een normale gezichtsscherpte (Links: 0.375 cpd; Rechts: 0,397 cpd; Figuur 3C). Bij twee-maanden na de laserbehandeling, de scherpte van het rechter oog (verhoogde IOP) daalde aanzienlijk in vergelijking met de linker controle-oog (links: 0.45 BPR; Rechts: 0,228 cpd; Figuur 3C). De scherpte van het oog met verhoogde IOP bleven laag in 5-6 maanden na de laserbehandeling (Links: 0.378 cpd; Rechts:. 0 258 cpd; Figuur 3C). Ook een lagere contrastgevoeligheid van het rechteroog met verhoogde IOP werd waargenomen (Figuur 3D). Bij twee-maanden na de laserbehandeling, de contrastgevoeligheid van de controle linkeroog was 6.13, terwijl het rechter oog was 1,91 bij 0.075 CPD. De contrastgevoeligheid van de controle linkeroog was 5.53 en 2.67 bij 0.16 en 0.3 cpd, terwijl het rechter oog was 4,28 en 1.Respectievelijk 45, (Figuur 3D).
Figuur 1. Laserfotocoagulatie van de waterige humor uitstroom in de muis ogen. (A) Een foto van de spleetlamp voor laserbehandeling. De exploitant houdt de muis met restrainer en dan lijnt het rechteroog van de muis om de lichtbron van de spleetlamp. (BC) Schematisch zijaanzicht en vooraanzicht van het oog. De bediener houdt de muis restrainers met beide handen, terwijl 80-100 laserspots worden toegepast op het gebied tussen de episclerale venen en verwijde pupil.
Figuur 2. IOP toegenomen na laserbehandeling. (A) De opstelling om IOP meten met behulp van een rebound tonometer. (B)Veranderingen van het IOP van een experimentele muis na laserbehandeling. Elk punt is het gemiddelde van drie opeenvolgende reeksen van zes metingen van IOP.
Figuur 3. Afname van de gezichtsscherpte en contrastgevoeligheid met IOP hoogte. (A) Schematische tekening van de optomotor setup. (B) Een muis op het midden-platform in de optomotor apparaat met roosters weergegeven op vier omliggende monitoren. (C) De gezichtsscherpte en contrastgevoeligheid van de muis onderzocht figuur 2B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij rapporteren boven die aanhoudende oculaire hypertensie kan worden geïnduceerd door laser verlichting in de muis ogen. Vergeleken met de zoutoplossing model 18 en de ader cautery model 11 beide vereisen uitgebreide microchirurgische vaardigheden, de laser verlichting is relatief eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren. Meestal kunnen we de laser verlichting voeren voor 4-6 muizen in 2-3 uur. De kritische stappen naar duurzame IOP hoogte te bereiken, zijn de voorste kamer afvlakken voordat laser en de parameters voor laser verlichting. Aftappen van de vloeistof in de voorste kamer vergemakkelijkt de laser het trabeculaire maaswerk gebied richten en minimaliseren buurt verwond corpus ciliare en bloedvaten 6. Verschillende soorten laser zijn ook gerapporteerd, bijvoorbeeld in sommige onderzoeken werd een diodelaser met een golflengte van 532 nm 5,6 cs is 810 nm energiepulsen 7 het trabeculaire netwerk en episclerale venen richten in de limbale region. Om de hoek schade optimaliseren hebben we het aantal laservlekken gestegen ten opzichte van de eerder gerapporteerde laserprinters 5-7. Met onze experimentele opstelling, bijna elke laser-behandelde muizen hadden meer dan 50% toename van de IOP van de eerste week na laserbehandeling, waaronder ongeveer 60% IOP was verhoogd tot meer dan 2 maanden. Daarentegen kan een intra-oculaire injectie van microbolletjes in de muis ogen een ~ 30% verhoging van de IOD voor een paar weken 8 (andere studie suggereerde een langere werking van IOP hoogte 9,10), en de afsluiting van limbale en episclerale aders in albino lokken CD-1 muizen alleen veroorzaakte een acute IOP hoogte voor een paar dagen 13.
De nauwkeurige meting van IOP is van belang om de laser effecten muisogen. Anesthesie beduidend de IOP meting en gedragstraining van muizen verminderde IOP variatie in wakkere dieren 9,19. Hier de proefdieren waren given een paar minuten te rusten en aan te passen aan de terughoudende positie alvorens de meting om een consequente metingen van IOP krijgen. Bevestigen de IOP meting betrouwbaar en niet afhankelijk van de persoon die een proef werden dezelfde dieren onderzocht door twee of drie verschillende testers en hun verschillen IOP metingen meestal binnen 5-15%.
Vanwege de variabiliteit van de duur en mate van IOP verhoging heeft verschillende RGC verlies gerapporteerd in verschillende diermodellen. Zo heeft een verlies van axonen 20% waargenomen muisogen met microkorrels injectie 8. Ongeveer 20% van de RGC stierf in rat ogen op zes weken na de laser belichting bij het trabekelsysteem, terwijl ongeveer 60% van het RGC stierf met laser verlichting op zowel de trabekelsysteem en de episclerale aders 5. Onze gegevens toonden een 20-30% van RGC verlies bij 2 maanden na de laserbehandeling in muisogen. Toch al deze verschillende diermodellen van chronische oCular hypertensie zonder significante ontsteking of schade aan andere delen van de ogen geven ons de mogelijkheid om de lange-termijn effecten van oculaire hypertensie op het netvlies structuur en visuele functie in de tijd te meten.
Gebruikmakend van de niet-invasieve karakter van de visuele gedrags test die seriële criteria als functie van veranderende omstandigheden toelaat, kunnen de veranderingen van de gezichtsscherpte en contrastgevoeligheid worden gecontroleerd maanden na de inductie van oculaire hypertensie. De optomotor test geeft een snelle beoordeling van de visuele functie, bovendien kunnen de twee ogen afzonderlijk getest, die sterk vergemakkelijkt onze experimenten door een oog van het doel muis laser behandeld en het andere wordt intact gelaten als controle. Tegelijkertijd wordt opgemerkt dat de optomotor reflex soms moeilijk te gebruiken vanwege de hoge activiteit en zwervende aandacht van sommige muizen 12.
Gecombineerd met de kracht van de muis genetischcs, ons model biedt een uitstekende uitlezing waarmee de pathologische mechanismen in high-drukglaucoom onderzoeken. Bijvoorbeeld, met Thy-1-YFP transgene muizen, die een klein aantal RGCs gelabeld 10,20-22 heeft, kan de dendritische structurele veranderingen van afzonderlijke RGC worden afgebeeld in ogen met aanhoudende oculaire hypertensie. We hebben aangetoond dat de dendritische degeneratie RGC's afhankelijk van de locatie en subtypes in oculaire hypertensieve ogen 23. Apoptosis of neuroprotectieve signaalwegen kan verder worden gemanipuleerd in vivo om de onderliggende moleculaire mechanismen van RGC degeneratie en overleving in glaucoom identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
De auteurs zijn full-time medewerkers van de Northwestern University.
De auteurs kregen GEEN financiering die werd verstrekt door bedrijven die reagentia en instrumenten die in dit artikel te produceren.
Acknowledgments
De werkzaamheden die in dit document is ondersteund door de Dr Douglas H. Johnson Award voor Glaucoom Research van de American Health Assistance Foundation (XL), de William & Mary Greve Special Scholar Award van het Onderzoek ter voorkoming van Blindheid (XL), de Illinois Vereniging ter Voorkoming van Blindheid (HC) en NIH-subsidie R01EY019034 (XL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| moxifloxacin | Alcon Labs, Inc. | NDC 0065-4013-03 | 0.5 %, Rx only |
| Proparacaine Hydrochloride | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | 0.5 %, Rx only |
| Ophthalmic Solution USP | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | .5 %, Rx only |
| ketamine | Butler Schein Animal Health | NDC 11695-0550-1 | 100 mg / kg |
| xylazine | LLOYD Inc. of Iowa | NADA 139-236 | 10 mg / kg |
| atropine sulfate solution | Alcon Labs, Inc. | NDC 61314-303-02 | 1 %, Rx only |
| Equipment | |||
| Slit Lamp, TOPCON | Visual Systems Inc | SL-3E | powered by PS-30A |
| OptoMotry 1.8.0 virtual | CerebralMechanics Inc. | ||
| opto-kinetic testing system | CerebralMechanics Inc. | ||
| Tonometer, TonoLab, for mice | Colonial Medical Supply | ||
| Heating pad | Sunbeam Products Inc | 722-810 | |
| Argon laser | Coherent Inc | Ultima 2000SE | |
| DECAPICONE Plastic cone holder | Braintree Sci Inc. | MDC-200 | for mouse |
References
- Gupta, N., Yucel, Y. H. Glaucoma as a neurodegenerative disease. Curr. Opin. Ophthalmol. 18, 110-114 (2007).
- Quigley, H. A. Neuronal death in glaucoma. Prog. Retin. Eye Res. 18, 39-57 (1999).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88, 816-824 (2009).
- Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. J. Glaucoma. 16, 483-505 (2007).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 402-410 (2002).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 4314-4320 (2003).
- Grozdanic, S. D. Laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4337-4346 (2003).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative ophthalmology & visual science. 51, 207-216 (2010).
- Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Experimental Eye Research. 92, 512-520 (2011).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3847-3857 (2012).
- Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61, 379-382 (1995).
- Chiu, K., Chang, R., So, K. F. Laser-induced chronic ocular hypertension model on SD rats. J. Vis. Exp. (10), e549 (2007).
- Fu, C. T., Sretavan, D. Laser-induced ocular hypertension in albino CD-1 mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 980-990 (2010).
- Rangarajan, K. V. Detection of visual deficits in aging DBA/2J mice by two behavioral assays. Curr. Eye Res. 36, 481-491 (2011).
- Wang, L., et al. Direction-specific disruption of subcortical visual behavior and receptive fields in mice lacking the beta2 subunit of nicotinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 29, 12909-12918 (2009).
- Douglas, R. M., et al. Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system. Visual Neuroscience. 22, 677-684 (2005).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 4611-4616 (2004).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64, 85-96 (1997).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 99, 27-35 (2012).
- Liu, X., et al. Brain-derived neurotrophic factor and TrkB modulate visual experience-dependent refinement of neuronal pathways in retina. J. Neurosci. 27, 7256-7267 (2007).
- Liu, X., et al. Regulation of neonatal development of retinal ganglion cell dendrites by neurotrophin-3 overexpression. The Journal of Comparative Neurology. 514, 449-458 (2009).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. The Journal of Comparative Neurology. 451, 115-126 (2002).
- Feng, L., et al. Sustained Ocular Hypertension Induces Dendritic Degeneration of Mouse Retinal Ganglion Cells that Depends on Cell-type and Location. Investigative Ophthalmology & Visual Science. , (2013).
