Summary
Hypertension oculaire chronique est induite en utilisant la photocoagulation au laser du trabéculum dans les yeux de souris. La pression intraoculaire (PIO) est élevée pendant plusieurs mois après le traitement au laser. La diminution de l'acuité visuelle et la sensibilité au contraste des animaux expérimentaux sont surveillés en utilisant le test optomoteur.
Abstract
Le glaucome, souvent associé à une pression intraoculaire (PIO) élevée, est l'une des principales causes de cécité. Nous avons cherché à établir un modèle de souris de l'hypertension oculaire pour imiter haute tension humaine glaucome. Ici illumination laser est appliqué sur le limbe cornéen à photocoagulate l'écoulement aqueux, induisant fermeture de l'angle. Les variations de pression intraoculaire sont surveillés à l'aide d'un tonomètre à rebond avant et après le traitement au laser. Un test de comportement optomoteur est utilisé pour mesurer les changements correspondants dans la capacité visuelle. Le résultat représentatif d'une souris qui a développé élévation de la PIO soutenue après l'illumination laser est affiché. Une diminution de l'acuité visuelle et la sensibilité au contraste est observé dans ce oculaire souris hypertensive. Ensemble, notre étude introduit un système modèle intéressant d'étudier la dégénérescence neuronale et les mécanismes moléculaires sous-jacents chez les souris glaucomateux.
Protocol
Procédures
C57BL/6J souris (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) sont portées à la Facilité de protection des animaux de l'Université Northwestern. Tous les animaux sont utilisés conformément aux protocoles approuvés par Northwestern University Institutional Animal Care et du Comité de l'utilisation et conforme aux lignes directrices sur l'utilisation des animaux en recherche en neurosciences du NIH.
1. La photocoagulation au laser
La procédure de photocoagulation laser est modifiée à partir de protocoles publiés précédemment 5-7.
- Anesthésier une vieille souris de 40-60 jours par une injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg / kg, Butler Schein santé animale, OH) et de xylazine (10 mg / kg, Lloyd Inc. de l'Iowa, Shenandoah, IA).
- Dilater la pupille de l'oeil droit de l'animal expérimental par traitement topique avec une ou deux gouttes de solution de sulfate d'atropine à 1% (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX).
- Après mydriase, aplatir la unechambre nterior pour améliorer l'induction laser 6. Insérez une micro-pipette en verre avec bout pointu (World Precision Instruments Inc, Sarasota, Floride) dans l'espace antérieure sous la lampe à fente (SL-3E, Topcon, Oakland, NJ) pour vidanger le liquide dans la chambre antérieure.
- Retenez la souris dans un porte-cône en plastique (Braintree Sci Inc., MA) et ligoté sur une plate-forme maison (voir la figure 1A). Maintenez la souris avec retardateur et expose l'oeil droit de la souris vers la source de lumière derrière la lampe à fente. Aligner l'œil droit de la souris anesthésiée sous la lampe à fente.
- Tout en maintenant le dispositif de retenue de la souris avec les deux mains, appliquez l'illumination laser au limbe cornéen à l'aide d'un laser Argon (Ultima 2000SE, Coherent, Santa Clara, CA). Livrer environ 80-100 spots laser (514 nm, 100 mW, 50 ms impulsion, et 200 spots pm) perpendiculairement autour de la circonférence du trabéculum. Les souris C57BL / 6 ont iris pigmenté qui sert de barrière pour tout potentiel énergie perdue 7.
- Instiller topique 0,5% moxifloxacine (Alcon Labs, Inc., Fort Worth, TX) sur la surface oculaire pour désinfecter la zone traitée au laser et de 0,5% Proparacaine (Bausch & Lomb, Rochester, NY) pour soulager la douleur.
- Gardez l'animal sur un coussin chauffant (Sunbeam Products Inc, Boca Raton, FL) pour la récupération pendant environ une heure jusqu'à ce qu'il soit complètement réveillé.
- L'oeil gauche est non traitée pour servir de témoin.
2. IOP mesures
- Placez la souris éveillé dans un tube à charger dans le porte-cône en plastique, puis le retenir sur la plate-forme (voir figure 2A).
- Permettre cinq à dix minutes pour laisser la souris et s'adapter à la position de la porte. Approchez-vous du tonomètre à rebond (TonoLab, Colonial Medical Supply, Franconia, NH) à l'œil de la souris jusqu'à la pointe de la sonde est de 2-3 mm de la surface de la cornée 14.
- Appuyez sur le bouton de mesure de laisser la pointe de la sonde a atteint la surface du centrede la cornée doucement. Trois séries consécutives de six mesures de la PIO du même œil sont acquises et que la moyenne de la PIO de l'oeil. L'oeil du témoin non traité est toujours mesurée premier à obtenir une lecture de référence pour l'œil traité par laser qui est mesurée suivant.
3. Test optomoteur
L'acuité visuelle et la sensibilité aux contrastes sont testés 14,15. Les deux yeux de souris individuelles sont examinées séparément en inversant le sens de la grille à la dérive, c'est à dire un réseau dérive vers la droite est utilisée pour identifier la fonction visuelle de l'oeil gauche et un réseau à la dérive dans le sens antihoraire pour l'oeil droit 16. Chaque test dure environ 15 minutes et est répété par deux observateurs indépendamment.
- Placez la souris et la souris permet de se déplacer librement sur une plate-forme surélevée entourée de quatre écrans d'ordinateur (figure 3A-B).
- Mettre en place les moniteurs afin qu'ils écran horizontalement dérive sinusoïdalegrilles en tant stimuli visuels en appliquant une luminance moyenne de 39 cd / m 2. Le sens de déplacement du réseau de diffraction doit alterner consécutivement entre droite et à gauche.
- Analyser les mouvements de l'animal. Les mouvements de l'animal en concert avec les réseaux de dérive sont considérés comme "positive" dans les 15 secondes après le stimulus visuel est en marche et ensuite progressivement augmentée. La réponse la plus élevée, provoquant stimulus visuel est définie comme une acuité visuelle de l'animal 17.
- Examiner la sensibilité de contraste à trois présélectionnés fréquences spatiales: 0,075, 0,16 et 0,3 cycles par degré (CPD). Le seuil de contraste pour chaque oeil est défini comme étant la plus faible contraste qui provoque des réponses visuelles à la fréquence pré-déterminée. La sensibilité au contraste est l'inverse du seuil 17.
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Representative Results
Comme décrit dans les procédures, illumination laser est dirigé vers le trabéculum dans la région limbique à photocoagulate l'écoulement aqueux, provoquant la fermeture de l'angle (figure 1). La plupart des yeux sérigraphiés au laser ne présentaient pas de dommages physiques importants, le détachement de pigment ou d'une infection, en accord avec les résultats antérieurs 6. Quand un petit groupe de souris (moins de 5% de tous les animaux sérigraphiés au laser) a montré des signes physiques de graves dommages tels que des balles dégonflés oculaires graves, cataracte, décollement de pigment significative, ou le saignement, nous euthanasiés immédiatement. Environ 30% des yeux sérigraphiés au laser développé cicatrices cornéennes mineures, et la plupart d'entre eux récupéré dans les 1-2 semaines après le traitement au laser.
Nous avons trouvé une PIO élevée dans presque tous les yeux traités par laser provenant de plus d'une centaine de souris. La PIO des animaux de laboratoire est contrôlée à l'aide d'un tonomètre à rebond (Figure 2). Figure 2B représente un exemple de l'évolution de IOP avant et après le traitement au laser. Avant le traitement au laser, les lignes de base de la PIO les deux yeux de la souris n'ont pas montré de différence: 15,7 mmHg (à droite) vs 14,7 mmHg (gauche, Jour 0, figure 2B). Sept jours après le traitement au laser, l'IOP de la (droite) oeil traité augmenté près de 2 fois à 30,7 mmHg, par rapport à l'oeil non traité (15,7 mm de Hg). La PIO des yeux au laser traité est restée élevée à 26-28 mmHg pendant environ 4 mois à 4 mois après le traitement, la PIO moyenne de l'oeil traité était de 26 mmHg, significativement supérieure à celle de l'oeil gauche non traité (16,3 mmHg). Par la suite, la PIO de l'oeil traité lentement diminué et atteint 18,7 mmHg à 6 mois (24 semaines) après le traitement (oeil non traité: 15,3 mmHg). Nos données démontrent que élévation de la PIO soutenue est réalisée pendant plus de 4 mois.
Nous avons ensuite confirmé la perte de vision en utilisant le test optomoteur (Figure 3). Les optomoteur test mesure les aspects de la vision spatiale via réflexive tête-tracking mouvements. figure 3C montre la diminution de l'acuité visuelle de l'animal examiné sur la figure 2B. Avant le traitement au laser, les deux yeux présentaient une acuité normale (à gauche: 0.375 CPD; droite: 0,397 CPD; figure 3C). A deux mois après le traitement laser, l'acuité de l'œil droit (PIO élevée) a diminué de manière significative par rapport à l'œil de commande gauche (Left: 0.45 DPC; droite: 0,228 CPD; figure 3C). L'acuité de l'œil avec une PIO élevée est restée faible à 5-6 mois après le traitement laser (Gauche: 0,378 CPD; droite:. 0 258 DPC; figure 3C). De même, on a observé une sensibilité au contraste inférieur de l'oeil droit avec une PIO élevée (figure 3D). A deux mois après le traitement au laser, la sensibilité au contraste du contrôle de l'œil gauche était 6,13, tandis que l'œil droit était de 1,91 à 0,075 DPC. La sensibilité au contraste de l'oeil gauche de contrôle était 5,53 et 2,67 à 0,16 et 0,3 cpd, tandis que l'œil droit était de 4,28 et 1.45, respectivement (figure 3D).
Figure 1. La photocoagulation au laser de l'écoulement de l'humeur aqueuse dans les yeux de souris. (A) Une photo de la lampe à fente pour le traitement au laser. L'opérateur tient la souris avec restrainer puis aligne l'œil droit de la souris vers la source de lumière de la lampe à fente. (BC) Schéma vue latérale et vue de face de l'œil. L'opérateur tient les butées de la souris avec les deux mains tandis 80-100 spots laser sont appliqués à la zone située entre les veines épisclérales et la pupille dilatée.
Figure 2. IOP augmenté après un traitement au laser. (A) La configuration de mesurer la PIO avec un tonomètre à rebond. (B)Les changements de la PIO d'une souris expérimentale après le traitement au laser. Chaque point est la moyenne de trois séries consécutives de six mesures de la PIO.
Figure 3. Des baisses d'acuité visuelle et la sensibilité au contraste avec élévation de la PIO. (A) Représentation schématique de la configuration optomoteur. (B) Une souris sur la plate-forme centrale dans l'appareil optomoteur avec grilles affichées sur quatre moniteurs environnantes. (C) l'acuité et sensibilité au contraste de la souris examiné sur la figure 2B.
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Discussion
Nous rapportons ci-dessus que l'hypertension oculaire soutenue peut être induite par illumination laser dans les yeux de souris. Par rapport au modèle d'injection saline 18 et le modèle de cautérisation de la veine 11 qui exigent tous deux de vastes compétences de microchirurgie, l'illumination laser est relativement simple et facile à réaliser. Habituellement, nous pouvons réaliser l'illumination laser pour 4-6 souris dans 2-3 heures. Les étapes essentielles pour atteindre élévation de la PIO soutenus sont la chambre antérieure aplatir avant de laser et les paramètres d'illumination laser. Vidange sur le fluide dans la chambre antérieure facilité de cibler le laser à la zone de réseau trabéculaire et minimiser les blessures à proximité du corps ciliaire et de vaisseaux sanguins 6. Différents types de laser ont également été signalés, par exemple, certaines études ont utilisé un laser à diode de longueur d'onde de 532 nm 5,6 et d'autres utilisés 810 nm énergie des impulsions 7 à cibler le trabéculum et les veines épisclérales dans le reg limbiqued'ions. Afin de maximiser les dégâts angle, nous avons augmenté le nombre de spots laser par rapport aux modèles laser précédemment rapportés 5-7. Avec notre dispositif expérimental, presque chaque souris traitée au laser avait plus de 50% d'augmentation de la PIO par la première semaine après le traitement au laser, dont environ 60% ont PIO élevée pendant plus de 2 mois. En revanche, une injection intraoculaire de microbilles dans les yeux de souris peut provoquer une élévation d'environ 30% de la PIO pendant quelques semaines 8 (autre étude suggère un effet plus d'élévation de la PIO 9,10), et l'occlusion des veines limbiques et épisclérale dans albinos souris CD-1 seulement induit une élévation de la PIO aiguë pendant quelques jours 13.
La mesure précise de la PIO est important pour déterminer les effets de laser sur les yeux de souris. L'anesthésie modifie de façon significative la mesure de la PIO et la formation comportementale des souris réduit de variation PIO chez des animaux éveillés 9,19. Ici, les animaux de laboratoire étaient gompte tenu de quelques minutes pour se reposer et s'adapter à la position retenue avant la mesure afin d'obtenir des mesures cohérentes de la PIO. Pour confirmer la mesure de la PIO est fiable et ne dépend pas de la personne qui a effectué le test, les mêmes animaux ont été examinés par deux ou trois testeurs différents et leurs différences de lectures PIO sont généralement dans 5-15%.
En raison de la variabilité de la durée et le degré d'élévation de la PIO, différent perte RGC a été rapporté dans différents modèles animaux. Par exemple, une perte de 20% des axones a été observée dans les yeux de souris avec injection microbilles 8. Environ 20% des CGR est mort dans les yeux de rat à six semaines après l'illumination laser à la trabéculum, tandis que près de 60% des CGR est mort avec illumination laser à la fois le trabéculum et les veines épisclérales 5. Nos données montrent un 20-30% de perte RGC à 2 mois après le traitement au laser dans les yeux de souris. Néanmoins, tous ces différents modèles animaux des maladies chroniques ohypertension vasculaire sans inflammation ou des dommages à d'autres parties de l'œil significatif nous donnent la possibilité de mesurer les effets à long terme de l'hypertension oculaire sur la structure de la rétine et la fonction visuelle au fil du temps.
Profitant de la nature non-invasive de l'analyse du comportement visuel qui permet de tests en série en fonction des conditions changeantes, les changements de l'acuité visuelle et la sensibilité aux contrastes peuvent être surveillés pendant des mois après l'induction de l'hypertension oculaire. Le test de optomoteur fournit une évaluation rapide de la fonction visuelle, d'ailleurs, les deux yeux peuvent être testés séparément, ce qui facilite grandement nos expériences parce que d'un œil de la souris cible est traitée au laser et l'autre est laissé intact le contrôle. Dans le même temps, il est à noter que le réflexe de optomoteur est parfois difficile à utiliser en raison de la forte activité et l'attention errance de certaines souris 12.
Combiné avec la puissance de souris génétiquementcs, notre modèle fournit une superbe lecture avec lesquels d'étudier les mécanismes pathologiques en haute-tension glaucome. Par exemple, en utilisant des souris transgéniques Thy-1-YFP, qui dispose d'un petit nombre de RGC marquées 10,20-22, les changements structurels dendritiques de CGR individuels peuvent être visualisés dans les yeux avec de l'hypertension oculaire soutenue. Nous avons démontré que la dégénérescence dendritique des CGR dépend de l'emplacement et sous-types dans les yeux hypertendus oculaires 23. l'apoptose cellulaire ou les voies de signalisation neuroprotecteurs peuvent encore être manipulées in vivo pour identifier les mécanismes moléculaires sous-jacents de la dégénérescence RGC et la survie dans le glaucome.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Les auteurs sont des employés à temps plein de l'Université Northwestern.
Les auteurs n'a reçu aucun financement qui ont été fournis par les entreprises qui produisent des réactifs et des instruments utilisés dans le présent article.
Acknowledgments
Le travail présenté dans ce document a été soutenu par le Dr Douglas H. Johnson Award pour recherche sur le glaucome de la Fondation américaine de la Santé Assistance (XL), la Grève Scholar Award spécial William & Mary de la recherche pour prévenir la cécité (XL), le Illinois Société pour la Prévention de la Cécité (HC) et NIH R01EY019034 (XL).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| moxifloxacin | Alcon Labs, Inc. | NDC 0065-4013-03 | 0.5 %, Rx only |
| Proparacaine Hydrochloride | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | 0.5 %, Rx only |
| Ophthalmic Solution USP | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | .5 %, Rx only |
| ketamine | Butler Schein Animal Health | NDC 11695-0550-1 | 100 mg / kg |
| xylazine | LLOYD Inc. of Iowa | NADA 139-236 | 10 mg / kg |
| atropine sulfate solution | Alcon Labs, Inc. | NDC 61314-303-02 | 1 %, Rx only |
| Equipment | |||
| Slit Lamp, TOPCON | Visual Systems Inc | SL-3E | powered by PS-30A |
| OptoMotry 1.8.0 virtual | CerebralMechanics Inc. | ||
| opto-kinetic testing system | CerebralMechanics Inc. | ||
| Tonometer, TonoLab, for mice | Colonial Medical Supply | ||
| Heating pad | Sunbeam Products Inc | 722-810 | |
| Argon laser | Coherent Inc | Ultima 2000SE | |
| DECAPICONE Plastic cone holder | Braintree Sci Inc. | MDC-200 | for mouse |
References
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