Summary
نحن تصف البروتوكولات المستخدمة للتحقيق في تفاعلات 13.56 ميغاهرتز الترددات الراديوية (RF) الحقول الكهربائية مع الغرويات جسيمات متناهية الصغر من الذهب في كلا النظامين غير البيولوجية والبيولوجية (في المختبر / فيفو). ويجري التحقيق في هذه التفاعلات لتطبيقات في علاج السرطان.
Abstract
علاجات السرطان التي هي أقل سمية والغازية من نظيراتها الموجودة هم مرغوب فيه للغاية. استخدام الترددات اللاسلكية المجالات الكهربائية التي تخترق عميقا في الجسم، مما يسبب الحد الأدنى من السمية، ويجري حاليا دراستها باعتبارها وسيلة ناجعة لعلاج السرطان غير الغازية. ومن المتوقع أن تفاعلات الطاقة RF مع النانوية المنضوية (NPS) يمكن تحرير الحرارة التي يمكن أن تسبب ارتفاع درجة الحرارة ثم (ارتفاع الحرارة) للخلية، وتنتهي في نهاية المطاف في نخر الخلية.
في حالة الأنظمة غير البيولوجية، نقدم بروتوكولات مفصلة تتعلق قياس الحرارة حررها الغرويات NP تتركز بشكل كبير. لالنظم البيولوجية، في حالة من التجارب في المختبر، ونحن تصف التقنيات والشروط التي يجب الالتزام بها من أجل فضح الخلايا السرطانية بشكل فعال للترددات اللاسلكية RF معظم القطع الأثرية دون التدفئة وسائل الاعلام التعتيم بشكل كبير من البيانات. أخيرا، نعطي و منهجية مفصلةأو في نماذج الماوس المجراة مع أورام سرطان الكبد خارج الرحم.
Introduction
امتصاص الطاقة RF بواسطة الأنسجة البيولوجية (بسبب السماحية الكهربائية الكامنة) يؤدي إلى درجات حرارة مرتفعة الأنسجة بوصفها وظيفة من الوقت، الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى موت الخلايا عن طريق ارتفاع الحرارة. هو الافتراض بأن ارتفاع الحرارة السرطان يمكن أن يكون الأمثل من خلال استخدام المواد النانوية المستهدفة التي تستوعب داخل الخلايا السرطانية وتكون بمثابة محولات RF-الحرارية، وترك صحية، والخلايا الطبيعية المجاورة سليمة. وقد أظهرت العديد من التقارير بالفعل أن مجموعة متنوعة من مصادر الطاقة النووية يمكن أن تكون مصادر الحرارة RF اعتبارا التي تساعد في نخر السرطان 1-4.
في هذه التحيات، مصادر الطاقة النووية الذهب (AuNPs) 3-5، أنابيب الكربون النانوية 1، ونقاط الكم 6، 7 أظهرت خصائص مثيرة عندما تستخدم في كل من في المختبر والتجارب في RF الجسم الحي. على الرغم من أن الطبيعة الدقيقة للآلية تسخين هذه مصادر الطاقة النووية عندما يتعرض له المجال RF ما زال قيد المناقشة، سلسلة منالتجارب الأساسية باستخدام AuNPs قد وضعت أهمية كبيرة على كل من حجم NP والدول التجميع. فقد تبين أن AuNPs فقط بأقطار <10 نانومتر سوف الحرارة عندما تتعرض إلى RF-8 الحقل. أيضا، هو الموهن هذه الآلية التدفئة بشكل ملحوظ عندما يتم تجميعها في AuNPs. تم التحقق من صحة هذا الشرط التجميع أيضا داخل في المختبر النماذج التي وضعت على أهمية تحسين AuNP الاستقرار داخل حجرات داخل الخلايا الغروية endolysomal لعلاج فعال RF 4. ومع ذلك، يمكن للتقنيات ومبادئ التجريبية المستخدمة في جمع وتقييم هذه البيانات تكون إشكالية، لا سيما في حالة التحقق من صحة RF ملامح الحرارة من الغرويات NP.
وقد أظهرت العديد من التقارير التي تفيد بأن التدفئة الجول لتعليق الأيونية الخلفية التي علقت مصادر القدرة النووية في يمكن أن يكون المصدر الرئيسي للإنتاج الحرارة RF وليس مصادر الطاقة النووية أنفسهم 9-12. على الرغم من ورقتنا الأخيرة 8 والتحقق من صحتها رانه استخدام التفاعلات RF في توليد الحرارة من AuNPs من أقطار أقل من 10 نانومتر، ونحن نهدف لوصف هذه البروتوكولات بمزيد من التفصيل خلال هذه المقالة.
نحن أيضا تدليل على البروتوكولات والتقنيات اللازمة لتقييم فعالية AuNPs كعوامل الحرارية في كل حموي في التجارب المختبرية والتجارب المجراة لنماذج سرطان الكبد. على الرغم من أننا نركز في المقام الأول على الغرويات بسيطة من AuNPs المغطاة سيترات، نفس التقنيات يمكن تطبيقها على AuNP الهجينة الأخرى مثل الأجسام المضادة والعلاج الكيميائي المجمعات مترافق. من خلال الالتزام بهذه المبادئ ينبغي أن التجريبي نأمل أن تكون قادرة على تقييم بسرعة إمكانية أي المواد متناهية الصغر ليكون وكيلا حموي الحرارية RF التي يسببها فعالة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ويصور لمحة تجريبية كاملة في الشكل 1.
وصفت مزيد من التفاصيل في الخطوات 1-3 أدناه.
1. تقييم RF التدفئة NP الغروية: AuNPs كمثال
- بشكل عام، لكل عينة NP يجري التحقيق، وغسل أول العينة عدة مرات خلال مرشح الطرد المركزي مع منزوع الأيونات (DI) بالماء لإزالة أيونات الخلفية والملوثات. وسيكون قد تم إزالة جميع الملوثات من الأيونات وتعليق AuNP عندما السائل يجري جرفت ديه مماثلة معدلات التدفئة RF (ساعة) كما الماء DI. يسمح هذا أيضا عملية تنقية لتركيزات أعلى من مصادر الطاقة النووية التي يمكن الحصول عليها. تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من استخدام AuNPs في هذا المثال، المبادئ الأساسية يمكن تطبيقها على المواد NP الأخرى.
- كمثال، وتنقية زجاجة 500 مل من AuNPs المتاحة تجاريا من قطر 5 نانومتر ومن ثم إخضاعها لمجال الترددات اللاسلكية 13.56 ميغاهيرتز الكهربائية فايELD قوة 90 كيلو فولت / متر.
- اتخاذ ~ 125 مل من محلول المخزون AuNP والانقسام بين ستة 50 كيلو دالتون أنابيب تصفية الطرد المركزي. أجهزة الطرد المركزي في 3000 دورة في الدقيقة. لمدة 2 دقيقة 5 ثانية. إزالة تصفيتها العازلة والملء المرشحات مع أكثر محلول المخزون. كرر حتى تم تصفيتها كل مل 500.
- استبدال العازلة تصفيتها مع حجم مماثل من الماء DI وتكرار ما يقرب من 8 مرات (أو حتى المخزن المؤقت الحقوقي RF تصفيتها تعادل المياه DI). ملاحظة، ويمكن أيضا أن تستخدم تحليل الأشعة فوق البنفسجية فيز لرصد قمم امتصاص الملوثات. مرة واحدة الملوثات عازلة قد أزيلت تماما، ماصة ما يقرب من 0.5 مل من الماء DI في كل مرشح و resuspend AuNPs من قبل pipetting المتكررة. هذا يجب إزالة تماما AuNPs من مرشح، والسماح لإعادة تعليق كامل. الجمع بين كل ستة معلقات في أنبوب واحد 15 مل إيبندورف.
- مرة واحدة تم تنقيته من AuNPs وتتركز، وتحليل عينة باستخدام ICP-OES و / أو ICP-MS، الأشعة فوق البنفسجية في مواجهة وزيتا المحتملة للبيانات على concentratioن والاستقرار NP، على التوالي. ويمكن أيضا أن تستخدم SEM و / أو تحليل TEM للحصول على بيانات المورفولوجية. إعداد نموذج مفصل لهذه التقنيات يمكن العثور عليها في الأدب 4.
- باستخدام نظام كانزيوس RF موضح في الدراسات السابقة 8، أو الاشتقاقات من هذا النظام، ووضع 1.3 مل أسطواني الكوارتز كفيت ذلك أن المجال الكهربائي-RF في الهواء (مع عدم وجود عينة الوقت الحاضر) سيكون ~ 90 كيلو فولت / متر داخل كفيت. لعينة المالحة القياسية (0.9٪ كلوريد الصوديوم) ستنخفض إلى الحقل الكهربائي إلى ~ 1.1 كيلو فولت / متر. هذه هي الشروط تقريبية تستخدم للسماح إجراء مقارنات بين الأنظمة المختلفة.
- ماصة 1.3 مل من عينة 1،000 ملغ / لتر من تنقية الغروانية AuNP في كفيت الكوارتز وإدخال هذا في الميدان RF. ويمكن القيام بذلك عن طريق استخدام حامل العينة تفلون مبنية خصيصا. تعرض العينة إلى الميدان RF لمدة 120 ثانية أو حتى عينة تصل إلى 70 درجة مئوية لمنع الانحناء الكهربائية أو السريع الغليان. كاليفورنياpture البيانات التصوير الحراري (وكذلك مناطق السيطرة) باستخدام كاميرا الأشعة تحت الحمراء والبرمجيات المرتبطة بها. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات.
- تحديد العينة من خلال مرشح آخر الطرد المركزي 50 كيلو دالتون لاستخراج AuNPs من المخزن المؤقت المياه DI. إعادة فضح المخزن المؤقت إلى حقل الترددات اللاسلكية، ومرة أخرى ثلاث مرات. الفرق في الحقوقي بين الغروانية AuNP والخلفية العازلة المياه DI يحدد HR بسبب AuNPs أنفسهم. نتوقع الحصول على ساعة من ~ 0.3 ° C / ثانية و 0.05 ° C / ثانية لإعطاء HR تعتمد AuNP من 0.25 ~ ° C / ثانية. resuspend وAuNPs المتبقية من مرشح في 1.3 مل من الماء عليها في المختبر التجارب المجراة /.
2. بمساعدة جسيمات متناهية الصغر التي يسببها ارتفاع الحرارة RF: دراسات في المختبر
- ويمكن تطبيق هذه الدراسات في المختبر إلى أي نوع من السرطان نوع من الخلايا التي تشكل الطبقات الوحيدة 2D. في هذه التجربة استخدام سرطان الكبد حقوق الإنسان مستمد الخلايا Hep3B.
- لوحة ~ 50،000 سلليرة سورية في ثلاثة آبار أمام 12 لوحة جيدا مع 1 مل من وسائط النمو. كرر هذا 6 مرات (استخدام ثلاث لوحات للدراسات NP وثلاث لوحات والضوابط). احتضان عند 37.5 درجة مئوية لمدة 24 ساعة قبل إدخال مصادر الطاقة النووية. تعقيم مصادر الطاقة النووية الأولى باستخدام السلامة الأحيائية مجلس الوزراء التعرض للأشعة فوق البنفسجية ضوء لمدة 5 دقائق.
- في كل إدخال جيدا 0.1 مل من محلول 1،000 ملغ / لتر AuNP ويترك لمدة 24 ساعة أخرى. إضافة 0.1 مل من الماء في كل بئر من لوحات التحكم الخلية الثلاثة وأيضا ترك لمدة 24 ساعة.
- بعد مرور 24 ساعة، ونضح وسائل الإعلام خلية ويغسل مع برنامج تلفزيوني لإزالة أي AuNPs محددة السطح. استبدال وسائل الإعلام الخلية. الخلايا هي الآن على استعداد للتعرض RF.
- وضع كل حزمة الخلية 12 جيدا داخل الميدان RF. الانتظار حتى فترت الخلايا إلى 31 درجة مئوية. تشغيل المولد RF وفضح ل3.5 دقيقة. فإن درجة الحرارة النهائية من وسائل الإعلام خلية تكون ~ 37 درجة مئوية. إيقاف مجال الترددات اللاسلكية. إزالة الخلايا ووضعها في حاضنة لمدة 24 ساعة قبل التحليل.
- <لى> إزالة الخلايا من الحاضنة وسائل الإعلام خلية نضح. إضافة 1.6 مل من وسائل الإعلام خلية إلى كل بئر وكذلك في 0.4 مل من كاشف الإنتقالي العسكري. احتضان الخلايا لمدة 4 ساعة. وسائل الاعلام نضح واستبدالها مع 2 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). وضع لوحات الخلايا على مقعد الروك ويترك لمدة 10 دقيقة للسماح للDMSO إلى ذوبان الكواشف الإنتقالي العسكري. أخيرا، ماصة 100 ميكرولتر من كل بئر في لوحة 96 جيدا وبصريا قراءة جيدا في 570 نانومتر باستخدام قارئ لوحة مثل لوحة قارئ SPECTROstar نانو.
3. بمساعدة جسيمات متناهية الصغر التي يسببها ارتفاع الحرارة RF: في الجسم الحي دراسات
- ويمكن تطبيق هذه في الدراسات المجراة على أي نوع من السرطان الذي يشكل الأورام الصلبة في نموذج الفئران مثلي أو خارج الرحم. يستخدم هذه التجربة Hep3B خلايا سرطان الكبد في الورم BALB-C نموذج الفأر عاري خارج الرحم.
- ملاحظة: يتم تنفيذ جميع التجارب المجراة في الامتثال لجميع المبادئ التوجيهية ذات الصلة واللوائح والوكالات التنظيمية. أيضا، تم تنفيذ بروتوكول شرحها تحت إشراف وموافقة من جامعة تكساس MD اندرسون للسرطان جنة مراكز رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية (IACUC).
- ينمو عدد مناسب من الخلايا (~ 100 ك) في قارورة الثقافة الأنسجة مع متوسط النمو المناسبة. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة خلية ثقافة.
- علاج الخلايا مع التربسين (لفصل من القارورة) وتنتج حلا من 2 مليون خلية لكل ميكرولتر 25. إضافة كمية متساوية من Matrigel (على الجليد) وتخلط جيدا لإعداد الحل الحقن النهائي. حقن هذا الحل في الموضع المطلوب على ظهره الماوس، والانتظار لكمية مناسبة من الوقت للأورام لتنمو إلى الحجم المطلوب (2-4 أسابيع لمعظم الخلايا). قبل التعرض RF، ينبغي BALB-C الفئران عارية تحمل الأورام الصلبة خارج الرحم 0.5-1 سم القطر.
- إعداد الفئران لاستخدامها (في هذه الحالة BALB-C الفئران عارية) من قبل نزلتsthetizing لهم حلا من الكيتامين وزيلازين عن طريق الحقن IP. في حين أن الفئران والنوم، والاحتفاظ بها في غرفة التحكم بدرجة حرارته عند 37 درجة مئوية. وسوف تكون هناك حاجة إلى 20 الفئران في المجموع، كل حجم الأورام مماثلة تحمل. وسوف تستخدم عشرة الفئران بالاشتراك مع وبدون AuNPs (وهذا الأخير هو حقن PBS فقط) في حين سيتم تقسيم 10 الفئران المتبقية بين RF مكشوفة وغير مكشوفة الضوابط RF: كلا الفريقين مع عدم وجود الحقن AuNP.
- مرة واحدة مخدرة بشكل صحيح، حقن AuNPs مباشرة داخل الورم باستخدام حقنة سم مكعب 1-27 G مع إبرة. وينبغي أن يكون الحل AuNP بتركيز الاتحاد الافريقي من 200 ملغ / لتر في 0.1 مل من برنامج تلفزيوني. بعد الحقن، واستخدام مسحة الجراحية لامتصاص الدم ومسح موضع الحقن مع الكحول مسح.
- ثم تحميل الماوس في أن يعامل على رأسه تلقيه لمولد الترددات اللاسلكية. يجب وضع الماوس بحيث الورم الأقرب إلى رئيس الإرسال. حماية المناطق التي لا يمكن علاجها، وكذلك سينسيTIVE مجالات مثل العينين والأذنين واليدين والقدمين، مع شريط النحاس. تأكد من أن الشريط النحاس والاتصال بشكل مناسب الطائرة التأريض بحيث لا يحدث تراكم تهمة. أيضا، يجب أن يكون مجال التعرض فجوة من 1 سم على الأقل أكبر من حجم موقع العلاج المطلوب.
- كاميرا الأشعة تحت الحمراء الحرارية الموقف بحيث الورم والمنطقة المعالجة واضحة. بدوره على الترددات اللاسلكية لمدة 5 دقائق. تسجيل منحنى درجة الحرارة الناتجة عن ذلك. إذا يحقق العلاج درجات حرارة أعلى من 42 درجة مئوية العلاج تتوقف على الفور.
- بعد التعرض لموجات استرداد الفئران من التخدير في غرفة دافئة حتى تكون واعية.
- تكرار التجربة مع نفس الفئران 48 ساعة في وقت لاحق (الخطوات 3.3.1 - 3.4.1).
- بعد التجربة، الموت ببطء الفئران وفقا للبروتوكولات وإجراءات مؤسسية. تسجيل وزن الورم. للتحليل النسيجي إصلاح الأورام باستخدام الفورمالين وتضمينها في البارافين. وعادة ما تكون ملطخة أقسام الورم الطرافةح الهيماتوكسيلين ويوزين والأهداف ذات الصلة لقياس الكفاءة العلاجية، مثل كي 67، المشقوق كاسباس 3، الخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1. تقييم التدفئة RF من NP الغرويات: AuNPs كمثال على ذلك.
بعد اتباع القسم 1.1 - 1.2.3 نتوقع أن يكون مركزا للغاية، حل مستقر، وتنقيته من 5 نانومتر و 10 نانومتر AuNPs القطر. من 500 مل كما هو وشراء محلول المخزون، ونتوقع الحصول على ما لا يقل عن 4 مل من محلول بتركيز 1،000 ملغ / لتر. يجب أن يكون الفرق في الحقوقي بين AuNPs والخلفية حل العازلة المياه DI في هذا التركيز ~ 0.25 ° C / ثانية و 0.1 درجة مئوية / ثانية لمدة 5 نانومتر و 10 نانومتر AuNPs، على التوالي، كما هو مبين في الشكل 2.
2. بمساعدة جسيمات متناهية الصغر الناتج عن ارتفاع الحرارة RF: في الدراسات المختبرية
ينبغي أن تظهر النتائج بشكل مثالي أن الخلايا المعرضة لحقل RF التي المنضوية AuNPs أقل قابلة للحياة من الخلايا المعرضة غير AuNP RF. ويسلط الضوء على مثال لهذه النتائج المتوقعة في الشكل 3.
3. Nanopar بمساعدة ticle الناتج عن ارتفاع الحرارة RF: في الدراسات المجراة
عند حقن AuNPs PBS وقف التنفيذ وبعد العلاج التعرض لموجات من ~ 2-3 أسابيع، ينبغي تحليل بعد وفاته تكشف عن نمو الورم تسيطر عليها و / أو انخفاض في حجم الورم / الشامل (كما هو موضح في الشكل 4). قد يكون هناك أيضا أدلة الاجتثاث الحرارية الخلوية المباشرة. ومع ذلك، قد لا يكون هذا هو الحال في AuNPs المغطاة سترات بسيطة هي أبعد ما تكون عن الأمثل وتميل إلى تجميع داخل أنسجة الورم. كما يمكن أن يرى في المنشورات الأخيرة، يجب أن يكون AuNPs غير مجمعة داخل عضيات داخل الخلايا لتعزيز الناجم RF cytoxicity. أيضا، وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الاقتران من أدوية العلاج الكيميائي مثل جيمسيتابين لAuNPs يحسن العلاج RF. المحقق يمكن الاستمرار في استخدام هذه البروتوكولات ولكن للمقارنة بشكل مباشر على فعالية خاصة بهم AuNP معقدة بالنسبة للعمل مجموعاتنا 'السابقة.
= "دائما"> 
الشكل 1. نظرة عامة التجريبية. AuNP تقييم التدفئة: وضعت و-شراؤها AuNPs (1.A) في كيلو دالتون مرشح 50 (1.B) وطرد وصولا الى فصل AuNPs من الترشيح (1.C). وهذا يسمح لAuNPs عالية التركيز والنقاء التي سيتم تشكيلها (1.d). ثم يتم وضع العينة في نظام RF باستخدام تفلون صاحب العينة التي شنت على مرحلة دوارة قابلة للتعديل (1.E). أسعار التدفئة AuNPs، فضلا عن أربعة مجالات التحكم الأخرى، وسجلت باستخدام كاميرا الأشعة تحت الحمراء (1.f) في المختبر البروتوكولات: تزرع Hep3B الخلايا السرطانية الكبدية في الجبهة 3 آبار من عدة حزم خلايا 12 جيدا كما هو مبين في 2.A (كمية الخلايا تستخدم حزم إقلاع ينتهي يوم ما تود التجريبي للتحقيق من حيث القوة التطبيقية RF، وتركيز AuNP، والضوابط، وغيرها). ثم يخضع كل لوحة 12 جيدا لمجال الترددات اللاسلكية (2.B). وإن لم يكن ضروريا كما في المرة التعرض لموجات الأمثل وقد تم بالفعل تحديد درجة الحرارة وسائل الإعلام يمكن أيضا أن سجلت باستخدام كاميرا الأشعة تحت الحمراء (2.C) في الجسم الحي البروتوكولات: الفئران BALB-C تحمل الأورام الكبدية خارج الرحم (3.A) تعرضوا لل الحقن داخل الورم من AuNPs ومعرضة للنظام RF (3.B) لعدة دقائق. وقد استخدم الشريط النحاس إلى الأرض الفئران من أجل منع حرق الجلد. ويرد كفيت الكوارتز مليئة AuNPs أيضا بجانب الماوس للتحقق من صحة التعرض RF. يجب أن يكون لمنطقة الورم درجة حرارة أعلى من بقية الماوس وعادة ما يظهر في الصورة الحمراء IR (3.C).
الشكل 2. أسعار التدفئة (° C / ثانية) من 5 نانومتر و 10 نانومتر قطرها AuNPs الحلول. وفقا لتعليمات البروتوكول، يتم تحديد أسعار التدفئة لAuNPs مع طاف (AuNPs + SN)، AuNPs تخرج بحيث لا طاف موجود (SN) ، والفرق في أسعار التدفئة بين هذين (الفرق). متوسط أسعار التدفئة هي من ثلاث تجارب مختلفة (A، B، و C).
الرقم 3. . ارتفاع الحرارة المثالية السمسة الجدوى (الإنتقالي العسكري مقايسة) يظهر أربعة تجارب الخلايا: التحكم (أي RF)، AuNP فقط (وليس RF)، RF فقط، والترددات اللاسلكية مع اضافة AuNPs المنضوية الخلوية (A، B، C، D و، على التوالي ).
الشكل 4. تحليل بعد وفاته من أورام الفئران خارج الرحم. الورم اليسار اليد ما يمكن توقعه من كل العينات تحكم أي لا RF ولا حقن AuNP). يظهر ورم المتوسطة انخفاضا طفيفا في حجم عندما تتعرض لمجال الترددات اللاسلكية وحدها. ومع ذلك، يظهر الورم الأيمن أن RF + AuNP العلاج مجتمعة يمكن أن تقلل / السيطرة على نمو الورم إلى أبعد من ذلك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه البروتوكولات تسمح التجريبي لتحليل كامل لمدى متناهية الصغر (في هذه الحالة AuNPs) يمكن أن تزيد من ارتفاع الحرارة الناجم عن الترددات اللاسلكية لعلاج السرطان. يتناول البروتوكول الأول تحديدا مع تحليل عينات من إنتاج الحرارة العالية تتركز AuNP وتنقيته. على الرغم من أن مجموعات أخرى وأفادت إنتاج الحرارة في المقام الأول من المخازن المؤقتة التي علقت في AuNPs وليس AuNPs أنفسهم 9-11، وتستخدم نظم RF على تركيزات أقل من AuNPs بأقطار> 10 نانومتر، فضلا عن انخفاض القوى التشغيل RF مع الكهربائية شدة المجال <90 كيلو فولت / متر والتي هي منخفضة جدا لرؤية أي آثار التدفئة RF ملحوظ من AuNPs. فقط من خلال اتباع البروتوكولات والمعايير الواردة في هذا التقرير يمكن أن نلاحظ ظاهرة التجريبي الحرارة النانو.
يسمح قسم المختبر في تطوير واجهات الخلوية-RF-NP لدراستها الامثل لRF / ارتفاع الحرارة الناجم NP-. فرنكابالإضافة خام من AuNPs والتعرض RF، يجب أن تتوقع أن يكون لها 2D نمو طبقة قابلة للحياة من خطوط الخلايا السرطانية ذات الصلة (في هذه الحالة Hep3B). ومع ذلك، فإن زمن التعرض RF الصحيحة لكل خط الخلية يجب أن يكون محدد سلفا قبل هذه التجارب من خلال تعريض الخلايا لمجال الترددات اللاسلكية عند نقاط زمنية مختلفة على سبيل المثال 2 -8 دقيقة) ويبحث في الملف الشخصي صلاحيتها بعد 24 ساعة. الصحيح الوقت التعرض لموجات لاستخدام حيث يجب أن تكون الخلايا هي ~ 80٪ قابلة للحياة. في حالة الخلايا Hep3B وجدت أن هذا ~ 3.5 دقيقة.
أبسط فحص من خيار للبقاء هو المعيار 3 - (4،5-dimethylthiazol2-YL)-2.5-diphenyltetrazolium بروميد (الإنتقالي العسكري) الفحص، على الرغم من أن الفحص قد تكون هناك حاجة أخرى إذا كان من المتوقع أن مصادر الطاقة النووية سوف تتفاعل مع الكواشف مقايسة (كما كان الحال مع MTT فحص التفاعل مع تشارك المركز الوطني 13). فحوصات أكثر تقدما ومفصلة أخرى يمكن استخدامها لتقييم آلية موت الخلايا مثل تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية مع Annexin-V وpropidium iodidه (PI) تلطيخ. والمستقبل في التطورات نظام المختبر ضمن مجموعتنا ننظر في وضع الخلايا في الحاضنة-RF الخاملة التي تسيطر عليها درجة الحرارة إلى يستبعد تماما أي المصادر المحتملة للارتفاع الحرارة بسبب التدفئة الأكبر من وسائل الإعلام الخلية. أيضا، فإن كمية AuNPs التي تحتاج إلى المنضوية داخل الخلية لأقصى قدر من موت الخلايا، فضلا عن استقرارها داخل عضيات داخل الخلايا، وسيتم التحقيق بمزيد من التفصيل. هذا هو وفقا الأعمال الأخيرة التي أظهرت أن AuNPs يجب أن تكون غير مجمعة داخل الجسيمات الحالة لتعزيز RF-4 العلاج.
أخيرا، تم وصفها في الجسم الحي بروتوكولات للسماح لكامل تحليل الحيوي من AuNPs في خارج الرحم نماذج الفئران بسرطان الكبد لقدرتها على السيطرة على نمو الورم أو نقصان و / أو حجم في تركيبة مع العلاج RF. نقطة مهمة للمناقشة هو القدرة لحقل RF للحث على حروق الجلد على الماوس بسبب الإجراءات أسس صحيحة. استخدام PROPEترتكز RLY وضعت الشريط النحاس، كما ذكر في القسم البروتوكول، هو شرط من أجل وقف هذه الحروق.
والمستقبل في عمل الجسم الحي في المختبر تعمل على تقييم آلية الفعلي للورم التحكم الموت / حجم من التعرض RF-AuNP. على الرغم من أنه افترض أن ارتفاع الحرارة يلعب دورا حاسما، وهذا لابد من التحقق من صحتها على الرغم من أن استخدام مثل هذه الضوابط على النحو الإدراج المباشر من الألياف البصرية مجسات الحرارية داخل الورم والخلايا السليمة المحيطة بها لإلقاء نظرة على يسببها RF استجابة درجات الحرارة هذه الأنسجة . أيضا، فإن وضع صبغة الفلورسنت الحرارية داخل الخلايا التي هي وظيفة مباشرة لدرجة الحرارة والطول الموجي الانبعاثات تكون أداة ممتازة لهذا التصديق ويمكن أن تستخدم أيضا لنماذج في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (U54CA143837)، والمعاهد الوطنية للصحة MD اندرسون للسرطان مركز دعم المنح (CA016672)، ومؤسسة V (SAC)، ومنحة بحثية غير المقيد من مؤسسة أبحاث كانزيوس (SAC، إيري، PA). نشكر كريستين الرماد من قسم جراحة الأورام، مركز اندرسون للسرطان، للحصول على المساعدة الإدارية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| 500 ml gold nanoparticles (5 nm) | Ted Pella, INC | 15702-5 | |
| Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa) | Millipore | UFC805024/UFC910096 | (4 ml and 15 ml volumes) |
| MEM X1 Cell Culture Media | Cellgro | 10-101-CV | (add extra nutrients as necessary) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135-500 ml | |
| Copper Tape | Ted Pella | 16072 | |
| Equipment | |||
| Kanzius RF System (13.56 MHZ) | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| IR Camera | FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA) | Contact FLIR | |
| 1.3 ml Quartz Cuvette | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| Teflon Sample holder with Rotary Stage | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| SPECTROstar Nano Microplate reader | BGM Labtech | ||
| UV-Vis spectrometer | Applied Nanofluorescence, Houston, TX) | NS1 NanoSpectralyzer | |
| ICP-–S | PerkinElmer | Optima 4300 DV | |
| Zetasizer | Malvern | Zen 3600 Zetasizer | |
References
- Gannon, C. J., et al. Carbon nanotube-enhanced thermal destruction of cancer cells in a noninvasive radiofrequency field. Cancer. 110, 2654 (2007).
- Curley, S. A., Cherukuri, P., Briggs, K., Patra, C. R., Upton, M., Dolson, E., Mukherjee, P. Noninvasive radiofrequency field-induced hyperthermic cytotoxicity in human cancer cells using cetuximab-targeted gold nanoparticles. J. Exp. Ther. Oncol. 7, 313 (2008).
- Gannon, C. J., Patra, C. R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P., Curley, S. A. Intracellular gold nanoparticles enhance non-invasive radiofrequency thermal destruction of human gastrointestinal cancer cells. Journal of Nanobiotechnology. 6, 2 (2008).
- Raoof, M., et al. Stability of antibody-conjugated gold nanoparticles in the endolysosomal nanoenvironment: implications for noninvasive radiofrequency-based cancer therapy. Nanomedicine. 8, 1096 (2012).
- Glazer, E. S., Massey, K. L., Zhu, C., Curley, S. A. Pancreatic carcinoma cells are susceptible to noninvasive radio frequency fields after treatment with targeted gold nanoparticles. Surgery. 148, 319 (2010).
- Glazer, E. S., Curley, S. A. Radiofrequency field-induced thermal cytotoxicity in cancer cells treated with fluorescent nanoparticles. Cancer. 116, 3285 (2010).
- Glazer, E. S., Curley, S. A. Non-invasive radiofrequency ablation of malignancies mediated by quantum dots, gold nanoparticles and carbon nanotubes. Therapeutic Delivery. 2, 1325 (2011).
- Corr, S. J., Raoof, M., Mackeyev, Y., Phounsavath, S., Cheney, M. A., Cisneros, B. T., Shur, M., Gozin, M., McNally, P. J., Wilson, L. J., Curley, S. A. Citrate-Capped Gold Nanoparticle Electrophoretic Heat Production in Response to a Time-Varying Radiofrequency Electric-Field. J. Phys. Chem. C. 116, 24380 (2012).
- Kruse, D. E., et al. A Radio-Frequency Coupling Network for Heating of Citrate-Coated Gold Nanoparticles for Cancer Therapy: Design and Analysis. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58, 10 (2011).
- Li, D., et al. Negligible absorption of radiofrequency radiation by colloidal gold nanoparticles. J. Colloid Interf. Sci. 358, 47 (2011).
- Liu, X., Chen, H. J., Chen, X., Parini, C., Wen, D. Low frequency heating of gold nanoparticle dispersions for non-invasive thermal therapies. Nanoscale. , (2012).
- Sassaroli, E., Li, K. C. P., O'Neill, B. E. Radio frequency absorption in gold nanoparticle suspensions: a phenomenological study. J. Phys. D App. Phys. 45, 075303 (2012).
- Worle-Knirsch, J. M., Pulskamp, K., Krug, H. F. Oops they did it again! Carbon nanotubes hoax scientists in viability assays. Nano Lett. 6, 1261 (2006).
