Summary
हम 13.56 मेगाहर्ट्ज रेडियोफ्रीक्वेंसी (आरएफ) की बातचीत की जांच के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का वर्णन दोनों गैर जैविक और जैविक प्रणालियों (इन विट्रो / विवो) में सोने nanoparticle कोलाइड के साथ बिजली के खेतों. इन मुलाकातों के कैंसर के उपचार में आवेदन के लिए जांच की जा रही है.
Abstract
अपने मौजूदा समकक्षों की तुलना में कम विषाक्त और आक्रामक रहे हैं जो कैंसर उपचार अत्यधिक वांछित हैं. न्यूनतम विषाक्तता के कारण गहरे शरीर में घुसना कि आरएफ बिजली क्षेत्रों के उपयोग, वर्तमान में गैर इनवेसिव कैंसर के उपचार के लिए एक व्यवहार्य साधन के रूप में अध्ययन किया जा रहा है. यह भली भाँति नैनोकणों (एनपीएस) के साथ आरएफ ऊर्जा की बातचीत अंततः सेल परिगलन में समाप्त, तो सेल की (अतिताप) overheating पैदा कर सकता है, जो गर्मी को आजाद कराने सकते हैं कि कल्पना की है.
गैर जैविक प्रणालियों के मामले में, हम अत्यधिक केंद्रित एनपी कोलाइड से मुक्त कराया गर्मी बढ़ाता से संबंधित विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. जैविक प्रणालियों के लिए इन विट्रो प्रयोगों के मामले में, हम प्रभावी रूप से काफी डेटा ढक थोक मीडिया हीटिंग कलाकृतियों के बिना आरएफ ऊर्जा के लिए कैंसर की कोशिकाओं को बेनकाब करने के क्रम में पालन किया जाना चाहिए जो तकनीक और स्थिति का वर्णन. अंत में, हम एक विस्तृत कार्यप्रणाली च देया अस्थानिक यकृत कैंसर के ट्यूमर के साथ vivo माउस मॉडल में.
Introduction
(कारण अपने निहित बिजली permittivity के लिए) जैविक ऊतक से आरएफ ऊर्जा के अवशोषण अंततः हाइपरथर्मिया से कोशिका मृत्यु की ओर जाता है जो समय के एक समारोह के रूप में ऊंचा ऊतक तापमान में यह परिणाम है. यह कैंसर अतिताप कैंसर कोशिका के भीतर भली और बरकरार पड़ोसी स्वस्थ, सामान्य कोशिकाओं को छोड़ने, आरएफ थर्मल transducers के रूप में कार्य है कि लक्षित nanomaterials के उपयोग के माध्यम से अनुकूलित किया जा सकता है कि धारणा है. कई रिपोर्टों पहले से ही एनपीएस की एक किस्म है जो कैंसर परिगलन 1-4 में सहायता के रूप में प्रभावी आरएफ गर्मी स्रोतों कार्य कर सकते हैं कि पता चला है.
इन संबंध में, सोने एनपीएस (AuNPs) 3-5, कार्बन नैनोट्यूब 1, और क्वांटम डॉट्स 6, दोनों में इन विट्रो और इन विवो आरएफ प्रयोगों में इस्तेमाल किया जब 7 रोमांचक विशेषताओं का प्रदर्शन किया है. एक आरएफ क्षेत्र के संपर्क में जब इन एनपीएस की हीटिंग तंत्र की वास्तविक प्रकृति अभी भी बहस की जा रही है, एक श्रृंखला कीAuNPs का उपयोग मौलिक प्रयोगों एनपी आकार और एकत्रीकरण दोनों राज्यों पर काफी महत्व दिया है. यह एक आरएफ क्षेत्र 8 से अवगत कराया जब व्यास <10 एनएम के साथ ही AuNPs गर्मी होगी कि दिखाया गया था. AuNPs एकत्रित कर रहे हैं इसके अलावा, जब यह हीटिंग तंत्र काफी तनु है. इस एकत्रीकरण हालत भी प्रभावोत्पादक आरएफ चिकित्सा 4 के लिए endolysomal intracellular डिब्बों के भीतर AuNP कोलाइडयन स्थिरता के अनुकूलन पर महत्व रखा है कि इन विट्रो मॉडल भीतर मान्य किया गया था. हालांकि, इस डेटा इकट्ठा करने और आकलन करने के लिए इस्तेमाल की तकनीक और प्रयोगात्मक सिद्धांतों विशेष रूप से एनपी कोलाइड से आरएफ गर्मी प्रोफाइल को मान्य करने के मामले में, समस्याग्रस्त किया जा सकता.
कई रिपोर्टों एनपीएस में निलंबित कर रहे हैं कि पृष्ठभूमि आयनिक निलंबन की जौल हीटिंग मुख्य आरएफ गर्मी उत्पादन के स्रोत और नहीं एनपीएस खुद को 9-12 हो सकता है कि पता चला है. हमारे हाल के पेपर 8 टी पुष्टि की है हालांकिवह 10 एनएम से भी कम व्यास की AuNPs से गर्मी पैदा करने में आरएफ बातचीत का उपयोग करें, हम इस लेख में और अधिक विस्तार में इन प्रोटोकॉल का वर्णन करना है.
हम भी प्रोटोकॉल और इन विट्रो में और लीवर कैंसर के मॉडल के लिए विवो प्रयोगों में दोनों में Hyperthermic थर्मल एजेंट के रूप में AuNPs के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक तकनीक का प्रदर्शन. हम साइट्रेट से ढकी AuNPs की सरल कोलाइड पर मुख्य रूप से ध्यान केंद्रित है, उसी तकनीक ऐसी एंटीबॉडी और कीमोथेरेपी संयुग्मित परिसरों के रूप में अन्य AuNP संकर के लिए लागू किया जा सकता है. इन सिद्धांतों का पालन करने से प्रयोगवादी उम्मीद है कि तेजी से एक प्रभावी आरएफ प्रेरित थर्मल Hyperthermic एजेंट होने के लिए किसी भी nanomaterial के लिए क्षमता का मूल्यांकन करने में सक्षम होना चाहिए.
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Protocol
पूरा एक प्रयोगात्मक अवलोकन चित्र 1 में दिखाया गया है.
अधिक जानकारी के लिए नीचे दिए गए कदम 1-3 में चित्रित कर रहे हैं.
1. एनपी Colloids का आकलन आरएफ ताप: एक उदाहरण के रूप AuNPs
- सामान्य तौर पर, प्रत्येक एनपी नमूना जांच की जा रही के लिए, पहली पृष्ठभूमि आयनों और को दूर करने के लिए विआयनीकृत (डी) पानी के साथ एक centrifugation फिल्टर के माध्यम से नमूना कई बार धोने. सभी आयनों और contaminants बाहर धोया जा रहा तरल डि पानी के रूप में इसी तरह आरएफ हीटिंग दर (घंटे) है जब AuNP निलंबन से हटा दिया गया होगा. इस शुद्धिकरण की प्रक्रिया भी प्राप्त किया जा करने के लिए एनपीएस की उच्च सांद्रता के लिए अनुमति देता है. यह इस उदाहरण में AuNPs का उपयोग हालांकि, मौलिक सिद्धांतों अन्य एनपी सामग्री के लिए लागू किया जा सकता है कि ध्यान देने योग्य है.
- एक उदाहरण के रूप में, व्यास एनएम 5 के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध AuNPs की 500 मिलीलीटर की बोतल को शुद्ध और फिर बिजली फाई की 13.56 मेगाहर्ट्ज आरएफ क्षेत्र के लिए उन्हें विषयवृद्धावस्था ताकत 90 केवी / मी.
- ~ छह 50 केडीए अपकेंद्रित्र फिल्टर ट्यूबों के बीच शेयर AuNP समाधान और विभाजन से 125 मिलीलीटर ले लो. 3,000 rpm पर अपकेंद्रित्र. 2 मिनट 5 सेकंड के लिए. अधिक शेयर समाधान के साथ फ़िल्टर्ड बफर और फिर से भरना फिल्टर निकालें. सभी 500 मिलीलीटर फ़िल्टर कर दिया गया जब तक दोहराएँ.
- डि पानी के एक समान मात्रा के साथ फ़िल्टर्ड बफर बदलें और लगभग 8 बार (या फ़िल्टर बफर आरएफ hrs डि पानी के बराबर हैं जब तक) दोहराएँ. यूवी विज़ विश्लेषण भी संदूषक अवशोषण चोटियों पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, ध्यान दें. बफर contaminants के पूरी तरह से प्रत्येक फिल्टर में, पिपेट लगभग 0.5 मिलीलीटर डि पानी निकाल दिया और दोहराया pipetting द्वारा AuNPs resuspend किया गया है एक बार. यह पूरी तरह से फिल्टर से AuNPs हटाने और पूरी मेजबान के लिए अनुमति चाहिए. एक 15 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में सभी छह निलंबन का मिश्रण.
- AuNPs शुद्ध और ध्यान केंद्रित किया गया है एक बार, आईसीपी OES और / या आईसीपी एमएस, यूवी विज़ और concentratio पर डेटा के लिए जीटा क्षमता का उपयोग नमूना विश्लेषणएन और एनपी स्थिरता, क्रमशः. SEM और / या मंदिर विश्लेषण भी रूपात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन तकनीकों के लिए विस्तृत नमूना तैयार करने साहित्य 4 में पाया जा सकता है.
- Kanzius आरएफ पिछले अध्ययनों 8 में वर्णित व्यवस्था, या इस प्रणाली के derivations, (कोई नमूना वर्तमान) के साथ हवा में आरएफ बिजली क्षेत्र के लिए किया जाएगा ताकि किसी 1.3 मिलीलीटर बेलनाकार क्वार्ट्ज क्युवेट जगह ~ क्युवेट अंदर 90 केवी / एम का उपयोग करना. एक मानक खारा नमूना के लिए (0.9% NaCl) बिजली क्षेत्र ~ 1.1 केवी / मीटर तक कम हो जाएगा. ये तुलना विभिन्न प्रणालियों के बीच किए जाने की अनुमति देने के लिए प्रयोग किया जाता अनुमानित स्थितियां हैं.
- पिपेट क्वार्ट्ज क्युवेट में शुद्ध AuNP कोलाइड की 1000 मिलीग्राम / एल नमूना की 1.3 मिलीलीटर और आरएफ क्षेत्र में इस परिचय. यह एक कस्टम निर्मित Teflon नमूना धारक का उपयोग करके किया जा सकता है. 120 सेकंड की अवधि के लिए या नमूना बिजली arcing या तेजी से उबलते को रोकने के लिए 70 डिग्री सेल्सियस तक पहुँच जाता है जब तक आरएफ क्षेत्र के लिए नमूना बेनकाब. सीएएक IR कैमरा और संबंधित सॉफ्टवेयर का उपयोग थर्मल इमेजिंग डेटा (और साथ ही नियंत्रण क्षेत्रों) pture. इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएँ.
- डि पानी बफर से AuNPs निकालने के लिए एक और 50 केडीए अपकेंद्रित्र फिल्टर के माध्यम से नमूना तक. तीन बार फिर से, आरएफ क्षेत्र को बफर फिर से बेनकाब. AuNP कोलाइड और पृष्ठभूमि डि पानी बफर के बीच hrs में अंतर के कारण AuNPs खुद को ऑफिस निर्धारित करता है. ~ के hrs प्राप्त करने की उम्मीद 0.3 डिग्री सेल्सियस / सेकंड और ~ 0.25 डिग्री सेल्सियस / सेकंड की एक AuNP निर्भर ऑफिस देने के लिए 0.05 डिग्री सेल्सियस / सेक. इन विट्रो / विवो प्रयोगों के लिए 1.3 मिलीलीटर पानी में फिल्टर से शेष AuNPs Resuspend.
2. Nanoparticle की मदद से आरएफ प्रेरित अतिताप: इन विट्रो अध्ययन
- इन विट्रो अध्ययन में 2D monolayers फार्म कि कैंसर कोशिका प्रकार के किसी भी प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है. इस प्रयोग में Hep3B कोशिकाओं व्युत्पन्न मानव hepatocellular कार्सिनोमा का उपयोग करें.
- प्लेट ~ 50,000 सीईएलविकास मीडिया के 1 मिलीलीटर के साथ एक 12 अच्छी तरह से थाली के सामने तीन कुओं में रास. इस 6 बार (नियंत्रण के रूप में एनपी पढ़ाई के लिए तीन प्लेटें और तीन प्लेटों का उपयोग करें) दोहराएँ. एनपीएस शुरू करने से पहले 24 घंटे के लिए 37.5 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. 5 मिनट के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट यूवी प्रकाश जोखिम का उपयोग पहले एनपीएस जीवाणुरहित.
- प्रत्येक में अच्छी तरह से एक 1000 मिलीग्राम / एल AuNP समाधान के 0.1 मिलीलीटर शुरू करने और एक और 24 घंटे के लिए छोड़ दें. तीन नियंत्रण सेल प्लेटों के प्रत्येक कुएं में पानी की 0.1 मिलीलीटर जोड़ें और भी 24 घंटे के लिए छोड़ दें.
- 24 घंटा गुजर जाने के बाद, सेल मीडिया aspirate और किसी भी सतह बाध्य AuNPs दूर करने के लिए पीबीएस के साथ धो लो. सेल मीडिया की जगह. कोशिकाओं को अब आरएफ जोखिम के लिए तैयार हैं.
- आरएफ क्षेत्र के भीतर प्रत्येक 12 अच्छी तरह से सेल पैक रखें. कोशिकाओं 31 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने तक प्रतीक्षा आरएफ जनरेटर को चालू करें और 3.5 मिनट के लिए बेनकाब. सेल मीडिया की अंतिम तापमान ~ 37 डिग्री सेल्सियस हो जाएगा आरएफ क्षेत्र को बंद करें. कोशिकाओं को हटाने और विश्लेषण से पहले 24 घंटे के लिए एक मशीन में उन्हें जगह है.
- <ली> इनक्यूबेटर और महाप्राण सेल मीडिया से कोशिकाओं को निकाल दें. MTT अभिकर्मक के 0.4 मिलीलीटर में अच्छी तरह के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए सेल मीडिया की 1.6 मिलीलीटर जोड़ें. 4 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते हैं. महाप्राण मीडिया और डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें. एक बेंच घुमाव पर सेल प्लेटें प्लेस और DMSO MTT अभिकर्मकों solubilize के लिए अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए छोड़ दें. अंत में, ऑप्टिकली पिपेट 100 अच्छी तरह से एक 96 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक के μl और ऐसे SPECTROstar नैनो प्लेट रीडर के रूप में एक प्लेट रीडर का उपयोग कर 570 एनएम पर अच्छी तरह से पढ़ा.
3. Nanoparticle की मदद से आरएफ प्रेरित अतिताप: vivo अध्ययन
- ये vivo अध्ययन में एक orthotopic या अस्थानिक murine मॉडल में ठोस ट्यूमर रूपों कि कैंसर के किसी भी प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है. इस प्रयोग से एक अस्थानिक ट्यूमर BALB सी नग्न माउस मॉडल में Hep3B यकृत कैंसर की कोशिकाओं का उपयोग करता है.
- नोट: सभी vivo प्रयोगों सभी प्रासंगिक दिशा निर्देशों, नियमों और नियामक एजेंसियों के साथ अनुपालन में क्रियान्वित कर रहे हैं. इसके अलावा, प्रदर्शन किया जा रहा प्रोटोकॉल टेक्सास विश्वविद्यालय के एमडी एंडरसन कैंसर केंद्र संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के मार्गदर्शन और अनुमोदन के तहत किया गया था.
- उपयुक्त मध्यम विकास के साथ एक टिशू कल्चर फ्लास्क में कोशिकाओं का एक उचित संख्या (~ 100 कश्मीर) के लिए आगे बढ़ें. सेल संस्कृति की अवधि के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं.
- Trypsin (कुप्पी से अलग करने के लिए) के साथ कोशिकाओं का इलाज और हर 25 μl के लिए 2 लाख कोशिकाओं का एक समाधान का उत्पादन. (बर्फ पर) Matrigel के एक बराबर मात्रा में जोड़ें और अंतिम इंजेक्शन समाधान तैयार करने के लिए अच्छी तरह मिक्स. माउस की पीठ पर यात्रा की स्थिति में इस समाधान इंजेक्षन और ट्यूमर वांछित आकार (सबसे कोशिकाओं के लिए 2-4 सप्ताह) को विकसित करने के लिए समय का एक उचित मात्रा इंतजार. आरएफ जोखिम से पहले, BALB सी नग्न चूहों ठोस अस्थानिक ट्यूमर 0.5-1 सेमी व्यास सहन करना चाहिए.
- Anae से (इस मामले में BALB सी नग्न चूहों) का उपयोग किया जा करने के लिए चूहों को तैयारआईपी इंजेक्शन द्वारा ketamine और xylazine का एक समाधान के साथ उन्हें sthetizing. चूहों सोते हैं, वहीं 37 डिग्री सेल्सियस तापमान नियंत्रित कक्ष में रख कुल 20 चूहों, सब असर समान आकार के ट्यूमर की जरूरत होगी. कोई AuNP इंजेक्शन के साथ दोनों समूहों: शेष 10 चूहों आरएफ उजागर और गैर आरएफ उजागर नियंत्रण के बीच विभाजित किया जाएगा, जबकि दस चूहों (उत्तरार्द्ध जा रहा पीबीएस इंजेक्शन केवल) के साथ संयोजन के रूप में और AuNPs के बिना उपयोग किया जाएगा.
- एक बार ठीक से anaesthetized, सीधे एक 27 जी सुई के साथ एक 1 सीसी सिरिंज का उपयोग ट्यूमर में AuNPs इंजेक्षन. AuNP समाधान पीबीएस के 0.1 मिलीलीटर में 200 मिलीग्राम / एल की एक Au एकाग्रता पर होना चाहिए. इंजेक्शन के बाद, पोंछ एक शराब के साथ रक्त को अवशोषित और इंजेक्शन स्थल पोंछने के लिए एक शल्य झाड़ू का उपयोग करें.
- तब आरएफ जनरेटर के प्राप्त सिर पर इलाज किया जा करने के लिए माउस माउंट. ट्यूमर प्रसारण सिर के सबसे करीब है इतना है कि माउस तैनात किया जाना चाहिए. इलाज करने के लिए नहीं कर रहे हैं कि क्षेत्रों ढाल, और साथ ही संवेदनशीलतांबे टेप के साथ, इस तरह के आंख, कान, और पैर की उंगलियों के रूप में क्षेत्रों ेश्य. कोई शुल्क नहीं buildup कि तब होता है तो तांबे टेप उचित ग्राउंडिंग विमान संपर्क कर रहा है कि सुनिश्चित करें. इसके अलावा, जोखिम क्षेत्र वांछित उपचार साइट के आकार की तुलना में अधिक से अधिक कम से कम 1 सेमी के अंतराल होना चाहिए.
- स्थिति आईआर थर्मल कैमरा ट्यूमर और उपचार क्षेत्र दिखाई दे रहे हैं. 5 मिनट के लिए आरएफ चालू करें. जिसके परिणामस्वरूप तापमान वक्र रिकार्ड. चिकित्सा तुरंत तापमान से अधिक 42 डिग्री सेल्सियस रोकने के उपचार को प्राप्त होता है.
- वे सचेत कर रहे हैं जब तक आरएफ जोखिम एक गर्म चैम्बर में संज्ञाहरण से चूहों की वसूली के बाद.
- बाद में एक ही चूहों 48 घंटा के साथ प्रयोग (- 3.4.1 3.3.1 कदम) दोहराएँ.
- प्रयोग के बाद, संस्थागत प्रोटोकॉल और प्रक्रियाओं के अनुसार चूहों euthanize. ट्यूमर का वजन रिकॉर्ड. Histological विश्लेषण के लिए formalin का उपयोग कर ट्यूमर को ठीक करने और आयल में उन्हें एम्बेड. ट्यूमर वर्गों आमतौर पर बुद्धि दाग रहे हैंज hematoxylin और eosin और gauging चिकित्सीय प्रभावकारिता, जैसे की-67 के लिए प्रासंगिक लक्ष्यों के लिए, आदि, कस्पासे -3 cleaved.
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Representative Results
1. एक उदाहरण के रूप में AuNPs: एनपी कोलाइड की आरएफ ताप का आकलन.
खंड 1.1 पालन करने के बाद - 1.2.3 5 एनएम और 10 एनएम व्यास AuNPs की एक अत्यधिक ध्यान केंद्रित, स्थिर, और शुद्ध समाधान की उम्मीद है. शेयर समाधान खरीदा रूप में 500 मिलीग्राम से, 1000 मिलीग्राम / एल की एकाग्रता में समाधान के कम से कम 4 मिलीलीटर प्राप्त करने की उम्मीद AuNPs और इस एकाग्रता में पृष्ठभूमि डि पानी बफर समाधान के बीच hrs में अंतर होना चाहिए ~ 0.25 डिग्री सेल्सियस / सेकंड और चित्रा 2 में दिखाया गया है के रूप में क्रमश: 5 एनएम और 10 एनएम AuNPs,, के लिए 0.1 डिग्री सेल्सियस / सेक.
2. Nanoparticle की मदद से आरएफ अतिताप प्रेरित: इन विट्रो अध्ययन
परिणाम आदर्श AuNPs भाँति है जो एक आरएफ क्षेत्र के संपर्क में कोशिकाओं गैर AuNP आरएफ उजागर कोशिकाओं की तुलना में कम सक्षम हैं कि दिखाना चाहिए. ऐसी उम्मीद परिणामों का एक उदाहरण चित्रा 3 में डाला जाता है.
3. Nanoparticle की मदद से आरएफ अतिताप प्रेरित: vivo अध्ययन
पीबीएस निलंबित AuNPs के इंजेक्शन पर और ~ 2-3 सप्ताह के आरएफ जोखिम उपचार के बाद, मरणोपरांत विश्लेषण नियंत्रित ट्यूमर के विकास और / या (4 चित्र में दिखाया गया है) ट्यूमर के आकार / जन में कमी उजागर करना चाहिए. भी प्रत्यक्ष सेलुलर थर्मल पृथक का सबूत हो सकता है. सरल साइट्रेट से ढकी AuNPs दूर अनुकूलित किया जा रहा से कर रहे हैं और ट्यूमर के ऊतक के भीतर कुल के लिए करते लेकिन, जैसा कि इस मामले में नहीं हो सकता. हाल के प्रकाशनों में देखा जा सकता है, AuNPs आरएफ प्रेरित cytoxicity बढ़ाने के लिए intracellular organelles भीतर गैर एकत्रित होना चाहिए. AuNPs आरएफ चिकित्सा का अनुकूलन करने के लिए इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से इस तरह के Gemcitabine के रूप में रसायन चिकित्सा दवाओं की कि विकार से पता चला है. अन्वेषक अभी भी सीधे हमारे समूह 'पिछले काम के संबंध में अपने स्वयं के AuNP परिसर के प्रभाव की तुलना करने के लिए हालांकि इन प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं.
चित्रा 1. प्रायोगिक अवलोकन. AuNP ताप आकलन: के रूप में खरीदा AuNPs (1.A) एक 50 केडीए फिल्टर (1.b) में रखा गया है और छानना से AuNPs अलग करने के लिए नीचे centrifuged हैं (1.c). अत्यधिक ध्यान केंद्रित और शुद्ध AuNPs (1.d) का गठन किए जाने के लिए अनुमति देता है. नमूना तो एक समायोज्य रोटरी मंच (1.e) के लिए मुहिम शुरू की एक Teflon नमूना धारक का उपयोग आरएफ प्रणाली में रखा गया है. AuNPs ताप दरें, साथ ही चार अन्य नियंत्रण वाले क्षेत्रों, एक IR कैमरा (1.f) का उपयोग कर दर्ज कर रहे हैं इन विट्रो प्रोटोकॉल:. के रूप में दिखाया Hep3B यकृत कैंसर की कोशिकाओं को कई 12 अच्छी तरह से सेल पैक के सामने 3 कुओं में बड़े हो रहे हैं 2.A में (सेल पैक की राशि रवानगी इस्तेमाल किया प्रयोगवादी एप्लाइड आरएफ शक्ति, AuNP एकाग्रता, नियंत्रण, आदि) के मामले में जांच करना चाहती है पर समाप्त होता है. प्रत्येक 12 अच्छी तरह से थाली तो आरएफ क्षेत्र के अधीन है (2.b). इष्टतम आरएफ जोखिम समय के रूप में आवश्यक नहीं पहले से ही निर्धारित किया गया है हालांकि मीडिया तापमान भी आईआर कैमरे (2.c) का उपयोग कर दर्ज किया जा सकता है में vivo प्रोटोकॉल:. अस्थानिक यकृत ट्यूमर असर BALB सी चूहों (3.A) के अधीन थे कई मिनट के लिए आरएफ प्रणाली (3.b) के संपर्क में अंतर tumoral AuNPs के इंजेक्शन और. कॉपर टेप त्वचा जल को रोकने के क्रम में चूहों भूमि पर किया गया था. AuNPs से भरा एक क्वार्ट्ज क्युवेट भी आरएफ जोखिम को मान्य करने के लिए माउस के बगल में दिखाया गया है. ट्यूमर क्षेत्र माउस के बाकी की तुलना में अधिक तापमान है और आमतौर पर आईआर चित्र (3.c) में लाल दिखाई देता है चाहिए. वाईएस ">
चित्रा 2. 5 एनएम और 10 एनएम व्यास AuNPs समाधान के ताप दर (सी / सेक °). प्रोटोकॉल निर्देश के अनुसार, हीटिंग दरों पर तैरनेवाला साथ AuNPs के लिए निर्धारित कर रहे हैं (AuNPs + एस.एन.), केवल सतह पर तैरनेवाला मौजूद है कि इतनी AuNPs फिल्टर हो (एस एन) , और इन दो (अंतर) के बीच ताप दरों में अंतर. औसत ताप दरों तीन अलग प्रयोगों (ए, बी, और सी) से हैं.
चित्रा 3. . क्रमशः सेलुलर भाँति AuNPs (ए, बी, सी और डी, के अलावा के साथ आरएफ ही, और आरएफ नियंत्रण (कोई आरएफ), AuNP केवल (कोई आरएफ),: आर्दश अतिताप cytotoxicity व्यवहार्यता (MTT परख) दिखाया चार सेल प्रयोगों हैं ).
चित्रा 4. अस्थानिक चूहों ट्यूमर के मरणोपरांत विश्लेषण. बाएं हाथ ट्यूमर दोनों नियंत्रण नमूनों) कोई आरएफ और कोई AuNP इंजेक्शन अर्थात् से उम्मीद होगी क्या है. अकेले आरएफ क्षेत्र के अधीन जब मध्य ट्यूमर के आकार में मामूली कमी को दर्शाता है. हालांकि, दाएँ हाथ के ट्यूमर आरएफ + AuNP संयुक्त चिकित्सा आगे भी ट्यूमर के विकास को नियंत्रित / कम कर सकते हैं कि पता चलता है.
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Discussion
इन प्रोटोकॉल प्रयोगवादी पूरी तरह से (इस मामले में AuNPs) कैंसर के इलाज के लिए आरएफ प्रेरित अतिताप बढ़ा सकते हैं करने के लिए जो nanomaterials हद विश्लेषण करने के लिए अनुमति देते हैं. पहले प्रोटोकॉल विशेष रूप से उच्च केंद्रित और शुद्ध किया AuNP नमूनों से गर्मी उत्पादन का विश्लेषण करने के साथ संबंधित है. अन्य समूहों में मुख्य रूप से AuNPs AuNPs खुद को 9-11 में और न निलंबित कर रहे हैं जो बफ़र्स से गर्मी उत्पादन की सूचना दी है, उनके आरएफ सिस्टम व्यास के साथ AuNPs की कम सांद्रता> 10 एनएम, साथ ही साथ कम आरएफ परिचालन शक्तियों का इस्तेमाल बिजली क्षेत्र ताकत <AuNPs से किसी भी ध्यान देने योग्य आरएफ हीटिंग प्रभाव को देखने के लिए बहुत कम हैं जो 90 केवी / मी. केवल इस रिपोर्ट में सूचीबद्ध प्रोटोकॉल और मापदंडों का पालन करते हुए प्रयोगवादी nanoscale गर्मी घटना का निरीक्षण कर सकते हैं.
इन विट्रो अनुभाग सेलुलर आरएफ एनपी इंटरफेस का विकास अनुकूलित आरएफ / एनपी प्रेरित अतिताप के लिए अध्ययन किया जा सकता है. BEFAuNPs और आरएफ जोखिम के अयस्क इसके अलावा, आप (इस मामले Hep3B में) प्रासंगिक कैंसर कोशिका लाइनों की एक व्यवहार्य 2 डी परत वृद्धि की उम्मीद करनी चाहिए. हालांकि, प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए सही आरएफ जोखिम समय अलग समय बिंदुओं पर आरएफ क्षेत्र के लिए कोशिकाओं को प्रकाश में लाने से इन प्रयोगों से पहले पूर्व निर्धारित किए जाने की आवश्यकता 2 -8 मिनट उदा) और 24 घंटे के बाद उनकी व्यवहार्यता प्रोफ़ाइल पर देख रहे हैं. कोशिकाओं ~ 80% व्यवहार्य हैं, जहां का उपयोग करने के लिए सही आरएफ जोखिम समय होना चाहिए. Hep3B कोशिकाओं के मामले में यह ~ 3.5 मिनट हो पाया था.
व्यवहार्यता के लिए चुनाव का सरलतम परख मानक 3 है - (4,5-dimethylthiazol2-YL)-2.5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (MTT) परख, यह एनपीएस परख अभिकर्मकों के साथ बातचीत करेंगे अनुमान है कि अगर एक और परख की जरूरत हो सकती है, हालांकि (MTT परख CNTs 13 के साथ प्रतिक्रिया के साथ मामला था). अन्य अधिक उन्नत और विस्तृत assays ऐसे Annexin-V और propidium iodid साथ FACS विश्लेषण के रूप में सेल मौत तंत्र का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैई (पीआई) धुंधला हो जाना. हमारे समूह के भीतर इन विट्रो प्रणाली के घटनाक्रम में भविष्य पूरी तरह से कारण सेल मीडिया के थोक हीटिंग के लिए अतिताप के किसी भी संभावित स्रोतों से इनकार करने के एक तापमान नियंत्रित आरएफ निष्क्रिय इनक्यूबेटर में कोशिकाओं रखने पर दिखेगा. इसके अलावा, अधिकतम कोशिका मृत्यु, साथ ही intracellular organelles के भीतर अपनी स्थिरता के लिए एक कक्ष के भीतर भली भाँति करने की आवश्यकता है जो AuNPs की राशि, अधिक से अधिक विस्तार में जांच की जाएगी. इस AuNPs बढ़ाया आरएफ चिकित्सा 4 के लिए लाइसोसोम भीतर गैर एकत्रित होना चाहिए जिससे पता चला कि हाल ही में काम के अनुसार है.
अंत में, vivo प्रोटोकॉल आरएफ चिकित्सा के साथ संयोजन में ट्यूमर के विकास और / या आकार पर नियंत्रण या कम करने के लिए अपनी क्षमता के लिए अस्थानिक यकृत कैंसर चूहों मॉडल में AuNPs से भरा जैव विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए वर्णित किया गया. चर्चा के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा कारण गलत ग्राउंडिंग प्रक्रियाओं के लिए माउस पर त्वचा जलता प्रेरित करने के लिए आरएफ क्षेत्र के लिए क्षमता है. prope का उपयोगप्रोटोकॉल खंड में वर्णित के रूप में रेलवे, तांबे टेप जमीन और रखा, इन जलता को रोकने के क्रम में एक आवश्यकता है.
हमारी प्रयोगशाला में विवो काम में भविष्य आरएफ AuNP जोखिम से ट्यूमर मौत / आकार नियंत्रण की वास्तविक तंत्र का आकलन करने पर काम करेंगे. यह अतिताप एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि धारणा है, यह ट्यूमर में ऑप्टिकल फाइबर थर्मल जांच के प्रत्यक्ष प्रविष्टि और इस तरह के ऊतकों के आरएफ प्रेरित तापमान प्रतिक्रिया को देखने के लिए आसपास के स्वस्थ कोशिकाओं के रूप में इस तरह के नियंत्रण का उपयोग हालांकि मान्य हो गया है . इसके अलावा, जिसका तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन तापमान का एक सीधा समारोह है एक intracellular फ्लोरोसेंट थर्मल डाई का विकास इस सत्यापन के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण हो सकता है और भी इन विट्रो मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम एनआईएच (U54CA143837), एनआईएच के एमडी एंडरसन कैंसर केंद्र सहायता अनुदान (CA016672), वी फाउंडेशन (सैक), और Kanzius रिसर्च फाउंडेशन (एसएसी, एरी, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) से एक अप्रतिबंधित अनुसंधान अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया. हम प्रशासनिक सहायता के लिए, सर्जिकल कैंसर विज्ञान विभाग, एमडी एंडरसन कैंसर केंद्र से क्रिस्टीन ऐश धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| 500 ml gold nanoparticles (5 nm) | Ted Pella, INC | 15702-5 | |
| Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa) | Millipore | UFC805024/UFC910096 | (4 ml and 15 ml volumes) |
| MEM X1 Cell Culture Media | Cellgro | 10-101-CV | (add extra nutrients as necessary) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135-500 ml | |
| Copper Tape | Ted Pella | 16072 | |
| Equipment | |||
| Kanzius RF System (13.56 MHZ) | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| IR Camera | FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA) | Contact FLIR | |
| 1.3 ml Quartz Cuvette | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| Teflon Sample holder with Rotary Stage | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| SPECTROstar Nano Microplate reader | BGM Labtech | ||
| UV-Vis spectrometer | Applied Nanofluorescence, Houston, TX) | NS1 NanoSpectralyzer | |
| ICP-–S | PerkinElmer | Optima 4300 DV | |
| Zetasizer | Malvern | Zen 3600 Zetasizer | |
References
- Gannon, C. J., et al. Carbon nanotube-enhanced thermal destruction of cancer cells in a noninvasive radiofrequency field. Cancer. 110, 2654 (2007).
- Curley, S. A., Cherukuri, P., Briggs, K., Patra, C. R., Upton, M., Dolson, E., Mukherjee, P. Noninvasive radiofrequency field-induced hyperthermic cytotoxicity in human cancer cells using cetuximab-targeted gold nanoparticles. J. Exp. Ther. Oncol. 7, 313 (2008).
- Gannon, C. J., Patra, C. R., Bhattacharya, R., Mukherjee, P., Curley, S. A. Intracellular gold nanoparticles enhance non-invasive radiofrequency thermal destruction of human gastrointestinal cancer cells. Journal of Nanobiotechnology. 6, 2 (2008).
- Raoof, M., et al. Stability of antibody-conjugated gold nanoparticles in the endolysosomal nanoenvironment: implications for noninvasive radiofrequency-based cancer therapy. Nanomedicine. 8, 1096 (2012).
- Glazer, E. S., Massey, K. L., Zhu, C., Curley, S. A. Pancreatic carcinoma cells are susceptible to noninvasive radio frequency fields after treatment with targeted gold nanoparticles. Surgery. 148, 319 (2010).
- Glazer, E. S., Curley, S. A. Radiofrequency field-induced thermal cytotoxicity in cancer cells treated with fluorescent nanoparticles. Cancer. 116, 3285 (2010).
- Glazer, E. S., Curley, S. A. Non-invasive radiofrequency ablation of malignancies mediated by quantum dots, gold nanoparticles and carbon nanotubes. Therapeutic Delivery. 2, 1325 (2011).
- Corr, S. J., Raoof, M., Mackeyev, Y., Phounsavath, S., Cheney, M. A., Cisneros, B. T., Shur, M., Gozin, M., McNally, P. J., Wilson, L. J., Curley, S. A. Citrate-Capped Gold Nanoparticle Electrophoretic Heat Production in Response to a Time-Varying Radiofrequency Electric-Field. J. Phys. Chem. C. 116, 24380 (2012).
- Kruse, D. E., et al. A Radio-Frequency Coupling Network for Heating of Citrate-Coated Gold Nanoparticles for Cancer Therapy: Design and Analysis. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 58, 10 (2011).
- Li, D., et al. Negligible absorption of radiofrequency radiation by colloidal gold nanoparticles. J. Colloid Interf. Sci. 358, 47 (2011).
- Liu, X., Chen, H. J., Chen, X., Parini, C., Wen, D. Low frequency heating of gold nanoparticle dispersions for non-invasive thermal therapies. Nanoscale. , (2012).
- Sassaroli, E., Li, K. C. P., O'Neill, B. E. Radio frequency absorption in gold nanoparticle suspensions: a phenomenological study. J. Phys. D App. Phys. 45, 075303 (2012).
- Worle-Knirsch, J. M., Pulskamp, K., Krug, H. F. Oops they did it again! Carbon nanotubes hoax scientists in viability assays. Nano Lett. 6, 1261 (2006).
