Summary
私たちは、13.56MHzの高周波（RF）の両方の非生物学的および生物学的システムにおける金ナノ粒子コロイドと電気分野（ 試験管内 / 生体内 ）の相互作用を調査するために使用されるプロトコルについて説明します。これらの相互作用は、癌治療における用途のために研究されている。
Abstract
既存の対応物よりも毒性および侵襲性癌療法が非常に望ましい。最小限の毒性を引き起こす、身体深部に浸透RF電界フィールドの使用は、現在、非侵襲性癌療法の実行可能な手段として研究されている。これは、内在化ナノ粒子（NPを）有するRFエネルギーの相互作用は、最終的には細胞壊死で終わる、セルの（温熱療法）を引き起こす可能性が過熱する熱を放出することが想定される。
非生物学的システムの場合、我々は、高濃度のNPコロイドによって遊離熱を定量化に関する詳細なプロトコルを提示する。生物系は、in vitro実験の場合には、我々は、効果的に、バルク媒体の加熱アーチファクトが有意にデータを不明瞭にすることなく、RFエネルギーに癌細胞を露出させるために接着されなければならない技術および条件を記載している。最後に、我々は詳細な方法論Fを与えるまたは異所性肝癌腫瘍を用いたin vivoマウスモデルで 。
Introduction
（それらの固有の電気誘電率）の生体組織によるRFエネルギーの吸収は、最終的には温熱により細胞死をもたらす時間の関数として高められた組織温度をもたらす。それは、癌温熱療法は、癌細胞内に内在化し、隣接する健康な無傷の、正常細胞を残して、RF熱変換体として作用する標的化ナノ材料の使用によって最適化することができると仮定される。いくつかの報告が既にNPの様々な癌壊死1-4助剤として有効なRF熱源として作用することが示されている。
両方のインビトロおよびインビボ RF実験に使用した場合にこれらの点は、金のNP（AuNPs）3-5、カーボンナノチューブ1、及び量子ドット6において、図7は、刺激的な特性を示している。 RF場に露出これらのNPの加熱機構の正確な性質は、依然として、一連の議論されているがAuNPsを使用した基本的な実験は、NPのサイズと集約状態の両方で大きな意義を置いている。これは、RF場8にさらされたときの直径を有するのみAuNPs <10ナノメートルで加熱することが示された。 AuNPsが凝集している場合にも、この加熱機構を大幅に減衰する。この集約状態は、効果的なRF療法4用endolysomal細胞内コンパートメント内AuNPコロイド安定性を最適化する際に重要視しin vitroモデル内で検証されました。ただし、このデータを収集し、評価するために使用される技術及び実験的な原理は、特にNPコロイドからRF熱プロファイルを検証する場合には、問題となる可能性がある。
いくつかの報告のNPが懸濁されているバックグラウンドイオン性懸濁液のジュール加熱は、主RFの熱発生源ではなく、それ自体のNP 9-12であり得ることを示している。私たちの最近の論文8は、Tを検証したが彼は10ナノメートル未満の直径のAuNPsからの熱を生成する際に、RF相互作用の使用は、この記事の中で、より詳細にこれらのプロトコルを記述することを目指しています。
また、in vitroおよび肝臓癌モデルのin vivo実験の両方において高体温の熱AuNPs薬としての有効性を評価するために必要なプロトコルおよび技術を実証する。我々は、クエン酸をかぶったAuNPsの単純なコロイドに主に焦点を当てているが、同技術は、抗体と化学療法 - 共役複合体のような他のAuNPハイブリッドに適用することができます。これらの原則に付着していることで実験者がうまくいけば、急速に効果的なRF誘導感熱温熱剤であることがあらゆるナノ材料の可能性を評価することができるはずです。
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Protocol
完全な実験の概要を図1に示されている。
さらなる詳細は、以下の手順1〜3に示されている。
1。 NPコロイドの高周波加熱を評価する：例としてAuNPs
- 一般に、各NPサンプルが調査され、第一のバックグラウンドイオン及び汚染物を除去するために脱イオン（DI）水を用いて遠心分離フィルターを通して試料を数回洗浄する。すべてのイオンおよび汚染物質が洗い流されている液体が、DI水と同様の高周波加熱速度（時間）がAuNP懸濁液から削除されています。この精製プロセスはまた、得られるNPのより高い濃度を可能にする。なお、この例ではAuNPsを用いているが、基本的な原理は 、他のNPの材料に適用することができることは注目に値する。
- 一例として、直径5nmの市販のAuNPsの500ミリリットル瓶を浄化した後、電気-Fiは13.56MHzのRFフィールドにそれらをさらすELD強度90 kVの/ M。
- 〜6 50kDaの遠心フィルターチューブの間に株式AuNPソリューションとスプリットから125ミリリットルを取る。 3,000 rpmで遠心分離する。 2分5秒。より多くの保存溶液で濾過液リフィルフィルタを削除。すべての500ミリリットルがフィルタリングされるまで繰り返します。
- DI水の同じような量で濾過液を交換し、約8倍（またはフィルタリングされたバッファのRF時間DI水と同等になるまで）を繰り返します。ノート、UV-Visの分析はまた、汚染物質の吸収ピークを監視するために使用することができる。バッファ汚染物質が各フィルタに、ピペットを約0.5ミリリットルのDI水を完全に除去され、繰り返しピペッティングによりAuNPsを再懸濁したら。これは完全にフィルタからAuNPsを削除し、完全な再懸濁を可能にすべきである。 1 15ミリリットルエッペンドルフチューブにすべての6懸濁液を兼ね備えています。
- AuNPsを精製し、濃縮された後、ICP-OES、および/またはICP-MS、UV-VISとconcentratio上のデータのためのゼータ電位を使用してサンプルを分析するnおよびNP安定性であった。 SEMおよび/またはTEM分析は、形態学的データを得るために使用することができる。これらの技術についての詳細なサンプル調製は、文献4に見出すことができる。
- Kanzius高周波これまでの研究8に記載されているシステム、またはこのシステムの導出、（無サンプルプレゼントに）空気中のRF電界がなるように1.3ミリリットルの円筒状の石英キュベットを置く〜キュベット内部の90 kVの/ Mを用い。標準生理食塩水試料（0.9％NaCl）をするための電界は、〜1.1 kVの/ mまで減少するであろう。これらの比較は、異なるシステム間で行われることを可能にするために使用されるおおよその条件である。
- ピペット石英キュベットに精製されたAuNPコロイド1,000 mg / Lの試料を1.3ミリリットルとRFフィールドにこれを紹介する。これは、特注のテフロン（登録商標）サンプルホルダーを使用することによって行うことができる。 120秒またはサンプルが電気アークや急激な沸騰を防ぐために、70℃に達するまでの期間、RFフィールドにサンプルを公開しています。カナダ赤外線カメラ·関連ソフトウェアを使用して熱画像データ（および制御領域）pture。この手順を3回繰り返します。
- DI水バッファからAuNPsを抽出するために別の50 kDaの遠心フィルターを通して試料を濾過する。 3回は再び、RFフィールドにバッファを再公開します。 AuNPコロイドおよび背景DI水バッファ間のHRの差がAuNPs自身のために人事を決定します。 AuNPに〜0.25℃/秒の依存人事を与える〜0.3℃/秒と0.05℃/秒の時間得ることを期待しています。 試験管内/ vivo実験用の1.3ミリリットルの水に、フィルタからの残りAuNPsを再懸濁します。
2。ナノ支援RF誘発性高体温：in vitro試験
- これらのインビトロ研究は、2D単層を形成し、癌細胞型の任意のタイプに適用することができる。この実験では、ヒト肝細胞癌は、Hep3B細胞由来の使用。
- プレート〜5万CEL増殖培地1mlの12ウェルプレートの前面3つのウェル中のls。 （コントロールとしてのNPの研究と3枚のために3枚を使用してください）この6回繰り返します。 NPSを導入する前に24時間、37.5℃でインキュベートする。 5分間のバイオセーフティキャビネット紫外線露光を用いて最初にNPSを殺菌する。
- それぞれにうまく千mg / LのAuNP溶液0.1mlを導入し、さらに24時間のままにしておきます。 3対照細胞プレートの各ウェルに0.1mlの水を加え、さらに24時間のままにしておきます。
- 24時間後に細胞培地を吸引し、任意の表面に結合したAuNPsを除去してPBSで洗って、合格しています。細胞培地を交換してください。セルは現在、RF被爆の準備ができている。
- RFフィールド内の各12ウェルセルパックを置きます。細胞は31℃に冷却するまで待ちますRF発生器の電源を入れ、3.5分間さらす。細胞培地の最終温度は〜37℃になりますRFフィールドをオフにします。細胞を除去し、分析の前に24時間、インキュベーターに配置します。
- <李>インキュベーターと吸引細胞培地から細胞を取り出します。 MTT試薬の0.4ミリリットルでなく、各ウェルに細胞培地の1.6ミリリットルを追加します。 4時間細胞をインキュベートする。培地を吸引し、ジメチルスルホキシド（DMSO）2mlで置き換える。ベンチロッカーに細胞プレートを配置し、DMSOは、MTT試薬を可溶化することを可能にするために10分間のままにしておきます。最後に、光学的にピペット100 96ウェルプレートにそれぞれの液とは、そのようなSPECTROstarナノプレートリーダーなどのプレートリーダーを用いて570nmでよくお読みください。
3。ナノ支援RF誘発性高体温：in vivo試験
- これらのインビボ研究は、同所性または異所性マウスモデルにおいて、固形腫瘍を形成する任意の種類の癌にも適用することができる。この実験は、異所性腫瘍をBALB-CヌードマウスモデルでのHep3B肝癌細胞を使用する。
- 注：すべてのin vivo実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制当局に準拠して実行されます。また、実証されているプロトコルは、テキサス大学MDアンダーソンがんセンターの施設内動物管理使用委員会（IACUC）の指導と承認の下で行われた。
- 適切な増殖培地で、組織培養フラスコ中で適切な数の細胞（〜100 k）を成長させる。細胞培養の間、5％CO 2、37℃インキュベーターでインキュベートする。
- トリプシンで細胞を処理（フラスコから分離するために）、すべての25μlのための200万個の細胞の溶液を生成します。 （氷上）マトリゲル等量を追加し、最終的な注射液を調製し、十分に混合。マウスの背中に所望の位置に、このソリューションを注入し、腫瘍が目的のサイズ（ほとんどの細胞のための2-4週）に成長するために適切な時間を待つ。 RF被曝の前に、BALB-cヌードマウスは、固形腫瘍が子宮外に0.5〜1センチメートル直径を負担する必要があります。
- ANAEことにより（この場合、BALB-Cヌードマウス）が使用されたマウスを作製IP注射によるケタミンおよびキシラジンの溶液でそれらをsthetizing。マウスは眠って下落している一方で、37℃に温度制御された室内に保管してください全部で20匹のマウスは、全て同様のサイズ軸受腫瘍を必要とされるであろう。無AuNP注射で両グループ：残りの10匹は、RF-曝露と非RF-曝露のコントロールの間で分割され、一方10匹のマウスを（後者は、PBS注射のみ）と一緒にしてAuNPsせずに使用されます。
- いったん適切に麻酔、27 Gの針を1-CCの注射器を使用して、腫瘍に直接AuNPsを注入する。 AuNP液をPBSの0.1ミリリットルで200 mg / LでのAuの濃度である必要があります。注射後、血液を吸収し、拭き、アルコールで注射部位を拭くために、外科綿棒を使用しています。
- 次いで、RF発生器の受容頭部に処理されるべきマウスを取り付ける。腫瘍が送信ヘッドに最も近くなるようにマウスを配置しなければならない。処置されるべきされていない領域を遮蔽、ならびに感度銅テープと、目、耳、手足などの分野をTIVE。電荷の蓄積が発生しないように銅テープを適切に接地面と接触していることを確認してください。また、露光領域は、所望の治療部位の大きさよりも少なくとも1cmのギャップを持っている必要があります。
- 位置赤外線熱カメラ、腫瘍および治療領域が表示されるように。 5分間のRFをオンにします。生じた温度曲線を記録します。治療は、直ちに温度を超える42℃の停止処理を実現した場合。
- 彼らが意識的になるまでのRF曝露後に暖かい室内での麻酔からマウスを回復する。
- （ - 3.4.1 3.3.1ステップ）48時間後に同じマウスで実験を繰り返す。
- 実験後、制度的なプロトコルと手順に従ってマウスを安楽死させる。腫瘍の重量を記録します。組織学的分析のためにホルマリンを使用して腫瘍を固定し、パラフィンに埋め込む。腫瘍切片は通常、ウィットに染色される例えば Ki-67の時間ヘマトキシリン-および治療 の有効性を測るに関連するターゲットについては、カスパーゼ3 などを切断した。
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Representative Results
1。例としてAuNPs：NPコロイドのRF加熱を評価する。
セクション1.1に従った後 - 1.2.3を5 nmおよび10 nmの直径AuNPsの高濃縮、安定し、かつ精製されたソリューションを持っていることを期待しています。として購入したストック溶液を500ミリリットルから1,000ミリグラム/ Lの濃度で溶液の少なくとも4ミリリットルを得ることを期待図2に示されているようにAuNPsこの濃度でのバックグラウンドDI水緩衝液のHRとの間の差は、それぞれ、〜0.25°C /秒、5〜0.1°C /秒から10nm AuNPsであるべきである。
2。ナノ支援RF誘導ハイパーサーミア：in vitro試験
結果は、理想的にAuNPsを内面化しているRF電界に曝露された細胞は、非AuNPのRF曝露された細胞よりも小さい実行可能であることを示す必要があります。そのような予想される結果の一例を図3に強調されている。
3。 Nanoparticle支援RF誘導ハイパーサーミア：in vivo試験
（ 図4に示すように）PBS懸濁AuNPsの注射時および約2〜3週間のRF曝露処理した後、死後分析は、制御された腫瘍増殖および/ または腫瘍の大きさ/質量の減少が明らかになるはずである。また、直接的な細胞熱切除の証拠があるかもしれません。シンプルなクエン酸をかぶったAuNPsをはるかに最適化されるのであり、腫瘍組織内で凝集する傾向があるようにしかし、これはそうでないかもしれない。最近の出版物に見られるように、AuNPsは、RF誘導性の細胞毒性を強化するために、細胞内小器官内の非集約する必要があります。また、最近の研究は、AuNPsに、例えばゲムシタビンなどの化学療法薬のコンジュゲーションは、RF治療を最適化することが示されている。研究者はまだ直接私たちのグループの前の仕事に関連して、独自のAuNP-複合体の有効性を比較するためにしかし、これらのプロトコルを使用することができます。
図1実験の概要。 AuNP加熱アセスメント ：として購入したAuNPs（1.A）は 50kDaのフィルター（1.B）に入れて、ろ液（1.C）からAuNPsを分離するためにダウンして遠心分離する。これは（1.D）を形成しようとする、高度に濃縮し、精製AuNPsが可能になります。次いで、試料を調整可能な回転ステージ（1.E）に取り付けられたテフロン（登録商標）サンプルホルダーを使用して、RFシステム内に配置される。 AuNPs加熱速度、ならびに他の4つの制御領域は、IRカメラ（1.fの）を使用して記録されているインビトロプロトコール ：。示すようにしたHep3B肝癌細胞は、いくつかの12ウェルセルパックの正面3ウェルで増殖させる2.A中（セルパックの量が提案dep使用実験者は、投入RFパワー、AuNP濃度、コントロールなど ）の観点から検討することを望むものに終わる。各12ウェルプレートは、その後、RFフィールド（2.B）に供される。最適なRF露光時間として必要ではないが既に決定されているが、メディア温度もIRカメラ（2.C）を用いて記録することができるインビボのプロトコル ：異所性肝腫瘍を有するBALB-Cマウスを、（3.A）に供したAuNPsの腫瘍内注射し、数分間RFシステム（3.B）に暴露した。銅テープは、皮膚の燃焼を防止するために、マウスを接地するために使用した。 AuNPsで満たされた石英キュベットもRF被爆を検証するために、マウスの横に表示されます。腫瘍領域は、マウスの残りの部分よりも高い温度を有し、通常はIRピクチャ（3.C）中の赤色が表示されなければならない。 YS ">
図2。 5 nmおよび10 nmの直径AuNPsソリューションの加熱速度（℃/秒°）。プロトコル説明書に従って、加熱速度が上清とAuNPsために決定される（AuNPs + SN）、上清のみが存在するようにAuNPsが除外（SN） 、及びこれら二つの（差）加熱速度の差。平均昇温速度は3つの異なる実験（A、B、およびC）からのものである。
図3。それぞれの細胞内在化AuNPs（A、B、C、およびDの添加によるRFのみ、およびRF対照（RF）、AuNPのみ（RF）： 理想化された温熱療法の細胞毒性の生存率（MTTアッセイ）示すのは、4つの細胞の実験である）。
図4。異所性マウス腫瘍の死後分析。左側の腫瘍）は、両方の対照標本がなく、RFなしAuNP注入、すなわちないから予想されるものです。単独のRF電界を受けたときに真ん中の腫瘍のサイズがわずかに減少を示している。しかし、右側の腫瘍はRF + AuNP併用療法はさらに、腫瘍の増殖を制御/減少させることができることを示している。
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Discussion
これらのプロトコルは、実験者が完全に（この場合AuNPs）は、癌治療のためのRF誘導性高体温を増加させることができるためにナノ物質程度を分析することを可能にする。第一のプロトコルは、特に高濃度精製AuNPサンプルから熱産生を分析して扱っています。他のグループは、主にAuNPsがAuNPs自身9-11にせずに懸濁させるバッファから熱産生を報告しているが、それらのRFシステムは、直径AuNPs低濃度の> 10ナノメートルだけでなく、と低いRF動 作電力を使用した電気、 AuNPsから顕著な高周波加熱効果を表示することが低い磁場強度<90 kVの/ M。唯一このレポートに記載されているプロトコルおよびパラメータに従って、実験者は、ナノスケールの熱現象を観察することができます。
in vitroのセクションでは、セルラーRF-NPインターフェースの開発、最適化されたRF / NP誘発性高体温のために研究することができます。 BEFAuNPsとRF曝露の鉱石添加は、あなたが（この場合のHep3B）に関連した癌細胞株の生存可能な二次元層成長を有すると期待するべきである。しかしながら、各細胞株の正しいRF露光時間が異なる時点でRF電界に細胞を曝露することによって、これらの実験の前に予め決定される必要は2-8分などして ）および24時間後に生存率プロファイルを見ている。細胞が約80％生存どこ使用する正しいRF曝露時間がなければならない。 Hep3B細胞の場合、これを約3.5分であることが見出された。
生存のための選択の最も簡単なアッセイは、標準的な3 - （4,5 - dimethylthiazol2 - イル）-2.5-ジフェニルテトラブロミド（MTT）アッセイ、それはNPがアッセイ試薬と相互作用することが予想される場合、別のアッセイが必要とされ得るが、 （MTTアッセイは、カーボンナノチューブ13との反応の場合のように）。他のより高度かつ詳細なアッセイは、例えば、アネキシン-Vおよびヨウ化iodidとFACS分析のような細胞死機構を評価するために使用することができるE（PI）染色。私たちのグループ内のin vitro系の開発に未来は完全に起因する細胞培地の大部分を加熱する温熱療法のいずれかの可能性のある要因を除外するために温度制御されたRF-不活性インキュベーター内で細胞を置くことを見ていきます。また、最大の細胞死、ならびに細胞内小器官内でのそれらの安定性のために細胞内に内在化される必要があるAuNPsの量は、より詳細に検討する。これはAuNPsが強化されたRF-4療法のためのリソソーム内の非集計する必要があることを示した最近の研究によるものである。
最後に、 インビボのプロトコールにおいて RF療法と組み合わせて、腫瘍増殖および/ または大きさを制御または減少させる能力について異所性肝癌のマウスモデルにおいてAuNPsの完全なバイオ分析を可能にするために記載された。議論のための重要なポイントは、不正確な接地手順をマウスの皮膚の火傷を誘発するRFフィールドのための機能です。プロペンの使用プロトコルの項で述べたようにRLY、銅テープを接地さ置き、これらの火傷を停止するために必要条件である。
私たちの研究室で、生体内の仕事に将来は、RF-AuNP被曝から腫瘍死/サイズ制御の実際のメカニズムを評価する上で動作します。それは温熱療法が重要な役割を果たしていると仮定されているが、これは腫瘍への光ファイバの熱プローブの直接挿入し、そのような組織のRF誘導性の温度応答を見て、周囲の健康な細胞のようなコントロールを使用していますが、検証する必要がある。また、発光波長の温度の一次関数である細胞内蛍光感熱色素の開発は、この検証のための優れたツールとなり、また、in vitroモデルを使用することができる。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品は、NIH（U54CA143837）、NIH、MDアンダーソンがんセンターサポート助成金（CA016672）、V財団（SAC）、およびKanzius研究財団（SAC、エリー、ペンシルバニア州）からの無制限の研究助成金によって賄われていた。私たちは、行政の支援のために、外科腫瘍科、MDアンダーソンがんセンターのクリスティーン·アッシュに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| 500 ml gold nanoparticles (5 nm) | Ted Pella, INC | 15702-5 | |
| Amicon Ultra-4/-15 Centrifugal Filter Units (50 kDa) | Millipore | UFC805024/UFC910096 | (4 ml and 15 ml volumes) |
| MEM X1 Cell Culture Media | Cellgro | 10-101-CV | (add extra nutrients as necessary) |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135-500 ml | |
| Copper Tape | Ted Pella | 16072 | |
| Equipment | |||
| Kanzius RF System (13.56 MHZ) | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| IR Camera | FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, USA) | Contact FLIR | |
| 1.3 ml Quartz Cuvette | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| Teflon Sample holder with Rotary Stage | ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, USA) | ||
| SPECTROstar Nano Microplate reader | BGM Labtech | ||
| UV-Vis spectrometer | Applied Nanofluorescence, Houston, TX) | NS1 NanoSpectralyzer | |
| ICP-–S | PerkinElmer | Optima 4300 DV | |
| Zetasizer | Malvern | Zen 3600 Zetasizer | |
References
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