Summary
人間の神経前駆細胞（NPCの）が増殖している条件の下で拡大した。のNPCは、ニューロトロフィンの組み合わせの存在下での神経細胞が豊富な培養物に分化させた。ニューロンのマーカーは、免疫蛍光染色により検出した。ニューロンの純粋な集団を単離するために、PENのNPCは、メンブレンスライドに分化し、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを行った。
Abstract
ヒト胎児脳から単離された神経前駆細胞（NPCの）は、上皮成長因子（EGF）、細胞の豊富な供給を提供するために、線維芽細胞増殖因子（FGF）の存在下で増殖条件下で増殖させた。のNPCは、ニューロンを得るために、ポリ-L-リジンおよびマウスラミニンでコーティングしたディッシュ上で、神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）の新しい組み合わせの存在下で分化ジブチリルcAMPの（DBC）およびレチノイン酸た豊富な文化。 NPCはまた、ニューロトロフィンの非存在下、DBC及びレチノイン酸およびアストロサイトに富む培養物を得た毛様体神経栄養因子（CNTF）の存在下で分化させた。差別化されたNPCはNeuNを、シナプシン、アセチルコリンエステラーゼ、シナプトフィジンとGAP43を含む神経細胞のマーカーのパネルのための免疫蛍光染色によって特徴付けられた。グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）及びSTAT3、星状細胞マーカーは、分化したNPCの10〜15％で検出された。促進するために、細胞型特異的分子特性は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、ポリエチレンナフタレート（PEN）膜スライド上で培養したニューロンを単離するために実施した。この研究に記載された方法は、神経変性の分子機構の理解を進めるための貴重なツールを提供しています。
Introduction
生涯神経新生は、側脳室の脳室下帯にと大人の哺乳類の脳1の歯状回の顆粒下の層に発生することが知られている。神経前駆細胞（NPCの）は、これらの地域から発信は、ニューロン、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト2に分化することができる多能性細胞である。 NPCがあるため、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、脳卒中およびアルツハイマー病（AD）3を含む種々の神経変性障害を有する患者に移植されるべき潜在能力の関心を生成した。 NPCを用いた研究は、一般的に、この移植角度に焦点を当てているが、神経変性の機構を決定するための細胞培養モデルとしてNPC由来のニューロンの電位が十分に利用されていない。以前の研究は、一般的にそうでないように、各実験のために単離する必要が齧歯類の脳組織から単離した有糸分裂後ニューロンを使用している自己再生。 SH-SY5Y、およびSK-N-MC細胞を含むヒト神経芽腫細胞株を拡大することができるが、それらは一次ニューロンの特性を持っていない。彼らは複数の継代のために拡張することができ、一次ニューロン4,5の特性を有する細胞集団を生成するために分化させることができるので、人間のNPCは、一方、両方の利点を提供する。現在の研究では、ヒト胎児脳から単離されたNPCから商業的に入手可能な一貫性のあるニューロンの豊富な集団を得るための新たな分化プロトコールを記載する。これらの培養は、グリア細胞の小さな割合を含んでいないため、我々は、分子特性のために神経細胞の純粋な集団を単離するための追加のメソッドを必要としています。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、組織切片からの細胞の均質な集団を選択的遺伝子発現解析のために6捕捉することのできる新規な技術である。脳は、ニューロン、グリアおよび他の細胞TYからなる異質な組織であるPES。 LCMは、ニューロン特異的遺伝子発現を決定するために使用されている7-10を解析する。我々は以前に具体的に海馬ニューロン11において減少サイクリックAMP応答エレメント結合タンパク質の発現（CREB）およびBDNFを示すためにAD（のTg2576）マウス脳切片から海馬ニューロンのLCMを行った。本研究では、PEN膜スライド上で培養した神経細胞を単離するための、人間のNPCの拡大、神経分化、神経細胞のマーカーの免疫蛍光染色およびLCMのための手順について説明します。
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Protocol
1。人間のNPCの拡大（ 図1）
- 、増殖サプリメントを含有する神経基礎培地でニューロスフェア（ 図1A）のように、T-75フラスコ中の懸濁液中の胎児の脳（ロンザ、ウォーカー、MD、USA）と文化からそれらを人間のNPCの凍結ストックを復活させるEGF（10 ng / mL）をし、 FGF（10 ng / mL）を。
- 培養3日後、5分間、500rpmで15mlチューブと遠心分離機に神経球を移す。
- 細胞ペレットの上に〜100μlの培地を残して上清を捨て、エッペンドルフチューブに移す。 100μlの細胞ペレットを2 T-75フラスコに分割するのに十分である。神経前駆細胞が薄い分割した場合に増殖することができないように少なく、フラスコの数を減らした場合。
- チューブの底部に200μlの先端を保持しながら200μlの先端50Xでペレットを粉砕する。二つの部分に均等に細胞懸濁液を分割し、2のT-75フラスコ（1-2スプリット）、継続のための1に追加します差別化のための拡張および他の。
- ニューロスフェアは、300〜500ミクロンの元のサイズになるまで4〜5日毎に培地を変更することで、拡張のための神経前駆細胞の培養（第一フラスコ）を継続。 （500 rpmで、5分間）遠心分離により培地を変更し、古い培地を廃棄し、新しいメディアを追加します。
2。ニューロンに富んだ文化に人間のNPCの分化（ 図2）
- 神経豊かな文化への神経前駆細胞の分化のために、各ウェルに500μLを添加することにより、ポリ-L-リジン100μgの/ mlの24ウェルプレートとコートの各ウェルに、単一のカバーガラスを配置します。室温で30分間料理をインキュベートする。
- ポリ-L-リジンソリューションを吸引し、滅菌水でプレートをすすぐ。
- 次に、5μg/ mlのマウスラミニン500μlでコートプレートのウェルを、30分間インキュベートする。インキュベーション後、PBSでウェルを洗浄する。
- 4日後にsplitti細胞（ステップ1.4）にNGの24ウェルプレートのウェルあたり〜500ニューロスフェアの密度でコーティングされた皿に「差別化のため」とラベル付けされたフラスコの小さなニューロスフェアを転送します。
- 6時間後、ニューロスフェアは、皿に付着した場合、増殖培地を除去し、神経基礎培地からなる分化培地を追加し、B27サプリメント、NGF（20 ng / mL）を、BDNF（10 ng / mL）を、DBC（100mm）に、レチノイン酸（2μM）。
3。差別化されたNPCの免疫蛍光染色（ 図3）
- 2週間の神経分化培地中で神経前駆細胞の培養に続いて、神経細胞に富む培養物が得られる。 PBSで1回ニューロンを洗い流してから30分間、4％パラホルムアルデヒドで固定します。固定したら、PBSで細胞を3回すすいでください。
- 60分間室温で透過化緩衝液（5％BSAおよびPBS中の0.2％トリトンX-100）で細胞をインキュベートする。
- 4℃のIでの料理のO / Nインキュベート;アセチルコリンエステラーゼ（1:500）とシナプトフィジン（1:250）; BDNF（1のNeuN（1:250）およびシナプシン（1:250）：PBS中の3％BSA中のポリクローナルおよびモノクローナル抗体の組み合せでシェーカーNA ：500）およびGAP43（1:250）; STAT3（1:500）およびGFAP（1:1,000）。
- カバーガラスをPBSで3回洗浄し、次いで、90分間、暗所でRTにて抗ウサギCy3および抗マウスFITC二次抗体でそれらをインキュベートする。インキュベーション後、PBSでカバーグラスを3回洗浄する。
- ピンセットで培養皿からカバーグラスを取り出し、封入剤に逆さに置き、スライドガラス上に封入剤を10μlを置きます。やさしく、余分な封入剤を乾いた布で拭き取ってくださいとマニキュアでエッジを封印。
- 蛍光顕微鏡での免疫染色されたニューロンを調査します。
4。ニューロンのレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ 図4）
- PEN膜スライド上に神経細胞に富んだ文化にNPCのを差別図2に記載の手順に従って、ポリ-L-リジンおよびマウスラミニンで被覆sの。
- RNA分解酵素を含まない条件下で、以降のすべてのステップを実行します。
- 細胞を可視化するためにHistoGeneステイン（アルクトゥルス）を使用して、文化を染色。
- ベリタスLCMシステムとスライド全体のロードマップイメージを使用して、アストロサイトを欠い純粋なニューロン集団の領域を見つける。描画ツールを使用して神経細胞をマーク。
- 2段階のプロセスでコンピュータ制御の精度と自動化を使用して、これらの領域のレーザーキャプチャーを実行します。まず、IR（赤外線）は、膜がキャップに付着し得るために70 Mwおよび2500秒のパルスのレーザーパワー設定で複数のスポットで焼成する。次に、マークされた領域は10 mVでの低レベル設定でUV切削工具を用いて切除される。
- これらのプロセスの組み合わせを選択的CapSure LCMマクロのキャップの上にペン膜からマークされた領域をキャプチャします。キャップが持ち上げられると、Nとメンブレンeuronsがキャップに付着している。
- のPicoPure RNA単離キット（アルクトゥルス）を使用してLCMサンプルから全RNAを分離し、DNA分解酵素で処理する。
- キットの指示に従ってRiboAMP RNA増幅キットを使用して単離されたRNAを増幅する。
- 人間の神経フィラメント重鎖（hNFHc）を検出するためのTaqManプローブを用いたリアルタイムRT-PCR解析を行う。
略語：
AD、アルツハイマー病、BDNF、脳由来神経栄養因子、CREB、サイクリックAMP応答エレメント結合タンパク質; DBC、ジブチリル環状AMP、EGF、上皮成長因子、FGF、線維芽細胞増殖因子、GFAP、グリア線維性酸性タンパク質、LCM、レーザマイクロダイセクションをキャプチャ、NGF、神経成長因子、NPC、神経前駆細胞、ペン、ポリエチレンナフタレート。
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Representative Results
NPCは拡大します（ 図1）
ニューロスフェアは、粉砕により単一細胞懸濁液に分解されるときに、ピペットチップは、懸濁液を上下にピペットである程度の抵抗があるように、チューブの底に触れる必要がある。トリチュレーションの回数は、個人や顕微鏡下で得られた細胞懸濁液を検査することによって、試行錯誤によって決定される必要がある間で変化する。 NPCに近い接触すると増殖が速い速度であろうので、細胞懸濁液の十分な密度を提供することが重要である。 NPCには成長しない場合、細胞密度はフラスコの数を減らすことにより増加されるべきである。我々は、最大10から15継代のニューロスフェアを拡張することができました。従って、ヒトのNPCの豊富な供給は、ヒト胎児組織の使用を低減する、生成することができる。 NPCのニューロンの継続的な供給のためには、3〜4継代し、その後のために、最初にそれらを展開することが望ましい、のNPCの半分は、ニューロスフェアのように展開することができ、他の半分は、進行中の実験のために分化させることができる。あるいは、NPCはまた、複数の通路のために展開株式の大きな電圧を発生させる細胞株の場合と同様に液体窒素中で凍結し、必要なときに復活することができる。これは、NPCの異なるバッチ由来のニューロンを用いた実験を行うことも望ましい。
のNPCの神経分化（ 図2）
NPCは多能性細胞であり、培養条件に依存して、ニューロン、アストロサイト、またはオリゴデンドロサイトに分化させることができる。私たちの分化プロトコルは、コーティングされた皿で4日齢のニューロスフェア（ 図2A）の播種を含んでいた。我々は、それがニューロン分化の周りに広がり、神経突起の密なネットワークを形成するように、ニューロスフェアの十分な密度に播種するために必須であることを観察した。 1（ 図2B）と4日後の画像（ 図播種のウレア2Cは）が示されている。 80〜90％のニューロンと10〜15％の星状細胞が得られるニューロンの豊富な培養物を、2週間後（ 図2D）のために、NGF、BDNF、DBCとレチノイン酸との組み合わせの存在下でのNPCの分化後に得られた。我々の知る限り、ニューロン分化のために、この研究で説明されたプロトコルは、他者によって以前に報告されていない。低密度の領域では、NPCは、星状細胞（ 図2E）に分化した。星状細胞が豊富な培養物を得るために、NPCはCNTF（10 ng / mlの）の存在下でNGF、BDNF、DBC及びレチノイン酸の非存在下で培養することができる。したがって、ニューロン、星状細胞組成物は、実験の目的に応じて分化中に操作することができる。
分化したニューロンの特性化（ 図3）
さらに、これらの分化のNPCを特徴付けるために、我々は、wは、ニューロンマーカーについて二重免疫染色を行ったi番目のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、それぞれのCy3（赤）およびFITC（緑）に連結されたウサギおよびマウス二次抗体に曝露した。次の神経細胞のマーカーが検出された。 図3A：。のNeuNおよびシナプシン図3B：アセチルコリンエステラーゼコリンエステラーゼ（AChE）およびシナプトフィジン図3C：BDNFおよびGAP43。したがって、分化したNPCは、一次ニューロンの特性を有する。さらに、星状細胞マーカーGFAP及びSTAT3は、細胞の小集団（ 図3A）において検出された。したがって、追加の方法は、ニューロン特異的遺伝子発現解析のために必要とされる。
ニューロンのレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）（ 図4）
LCMは、培養皿からの細胞の単離に使用することができますが、彼らがしっかりとコーティングされたディッシュに装着されているため、ニューロンとLCMの我々の最初の試みは失敗しました。この問題を克服するために、我々は、OのNPC分化nは、ポリ-L-リジンおよびマウスラミニンでコーティングされたPEN膜インサートと摺動する。スライドは、100ミリメートルの細胞培養皿（ 図4A）の内部に配置した。 PEN膜、スライド及びLCMキャップの配置は、 図4Bに示されている。培養物を、細胞（ 図4C）を可視化するために原組織染色（アルクトゥルス）で染色した。スライドはアルクトゥルスのVeritas器具顕微鏡に置いた。キャプチャするニューロンは、描画ツール（ 図4D）でマークされた。 CapSure HSキャップは、PEN膜上に置いた。 UVレーザ切断およびIRレーザーキャプチャーの組み合わせを使用して、マークされた領域は、キャップの上に集めた。キャプチャされたニューロンは、低い（ 図4F）のキャップと高い（ 図4F）の倍率に示されている。
図1。人間のNPCの拡大。 A.のNPCは、ニューロスフェアとしてT75フラスコ中の懸濁液中で培養した。神経球は、300〜500ミクロンのサイズに達したときB.、それらを15 mlチューブに移し、5分間1,000 RPMで遠心分離した。 上清を廃棄し200μlの培地中で細胞ペレットを、エッペンドルフチューブに移し、粉砕した。分割される準備D.神経球が示されている。摩砕の後E.壊れた神経球が示されている。
図2。人間のNPCの分化。 A.ニューロスフェアは、新しいニューロスフェアを生成するために4日間培養チュレーションにより破壊した。B.フォー日齢の神経球を、ポリ-L-リジンおよびマウスラミニンでコーティングしたディッシュに播種した。C.差異のNPCのTiONは播種後3日で、NGF、BDNF、DBCとレチノイン酸の存在下で観察された。D.ニューロン豊かな文化が2週間後に得られた。E.のNPCは、低密度の領域で、星状細胞に分化した。F.のNPC CNTF（10 ng / mlの）の存在下でNGF、BDNF、DBC及びレチノイン酸の非存在下で星状細胞に富む培養物に分化した。
図3。神経および。のNPCが2週間分化さ分化したヒトのNPCでのアストロサイトマーカーが固定され、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体で示さターゲットに対して免疫染色したデュアル、Cy3の（赤）と、それぞれ、FITC（緑）にリンクウサギやマウス二次抗体に曝露した。次のニューロンマーカーが検出された。A.のNeuNとシナプシンを。B.アセチルコリンエステラーゼ（アセチルコリンエステラーゼ）およびシナプトフィジン℃のBDNFおよびGAP43。さらに、次の星状細胞マーカーが検出された：D. STAT3およびGFAPを。
図4。ニューロンのレーザーキャプチャーマイクロダイセクション。A.用のNPCは、ポリLリジンおよびマウスラミニンでコーティングされたPEN膜をスライドに分化させた。スライドは、100ミリメートルの細胞培養皿の内側に配置した。B.がアルクトゥルスのVeritas楽器ペン膜スライドとLCMキャップの配置が示されている。C.培養物を細胞を可視化するために原組織染色（アルクトゥルス）で染色した。Dでのキャプチャするニューロンは、描画ツールでマークされた。キャプチャされたニューロンは、（E）の下限および上限（F）マグニのキャップに表示されますfication。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
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Discussion
我々は、この研究において自己複製ヒト神経前駆細胞の分化による神経細胞に富む細胞培養モデルおよびレーザーキャプチャーマイクロダイセクションによってニューロンの純粋な集団を単離する方法を記載している。我々は、NGF、BDNF、DBCとのNPCの神経分化のためのレチノイン酸の組み合わせを使用している。 DBCはCREB、神経発生12を強化する転写因子を活性化するために使用される。レチノイン酸は、細胞周期の終了を誘導し、グリア人口13減少します。この研究に記載されている方法は、我々の以前の報告14以上の修正が組み込まれています。我々は先に、単一の細胞懸濁液にニューロスフェアを粉砕する、その後、コーティングされた皿で、それを播種する工程を使用していた。これは、低密度（ 図2E）の分野での非効率的な神経分化につながることができます。我々は今、差異間の接触を保証するために、4日齢の小さなロスフェア（ 図1B）を播種する手順を紹介していますティンニューロン（ 図1C）。また、分化サプリメントは、（Stem Cell technologies）を播種後4〜5日、B27サプリメント（Invitrogen）で置換されている。現在の方法は、一貫して80〜90％のニューロンが得られます。プロセスの広範なネットワークを有するこれらのニューロンは、2〜3ヶ月間培養におけるヒト神経芽腫細胞株の分化から得られるニューロンモデルを超える明確な利点を維持することができる。のNeuN、シナプシン、アセチルコリンエステラーゼ、シナプトフィジンとGAP43を含むいくつかのニューロンマーカーの免疫染色は、分化のNPC（ 図3）で観察した。 STAT3およびGFAPは、アストロサイトのマーカーは、細胞の小集団において検出された。 2-5μMへのレチノイン酸の濃度を増加させることによって、星状細胞集団をさらに低減することができる。グリア細胞は、増殖因子の分泌によってニューロンの生存を支持するので、このような培養物は、長い間維持することができない。我々は観察したことit1-3日の実験を行う前に、レチノイン濃度を増加させることが望ましい。
分化したニューロンの不均一な性質は、細胞型特異的遺伝子発現プロファイリングを決定するという点で課題を提示。したがって、我々は、培養ニューロンのLCM（ 図4）のための条件を最適化した。現在の研究では、PEN膜インサートをスライド上のNPCを差別化し、この技術は、彼らがしっかりと接続されているように、通常の細胞培養皿上で培養したニューロンで問題が提示されているため、LCMを行った。 LCMの目的は免疫組織化学的分析によって満たされることができますが、LCMは、多重分析を行い、RNAレベルでの信号を増幅する能力、および正確な定量を含むいくつかの利点があります。マイクロアレイと組み合わせた場合、LCMは、選択された細胞型15内の何千もの遺伝子の発現解析を可能にする。
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Disclosures
宣言するためには、特別の利害関係。
Acknowledgments
この作品は、（SPに）退役軍人からメリットレビュー助成金（NEUD-004-07F）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
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