Summary
Menschen neuroprogenitor Zellen (NPCs) wurden unter proliferierenden Bedingungen erweitert. NSC wurden in Neuron-reiche Kulturen in der Gegenwart einer Kombination von Neurotrophinen unterscheiden. Neuronale Marker wurden durch Immunfluoreszenz-Färbung nachgewiesen. Um eine reine Population von Nervenzellen zu isolieren, wurden NPCs auf PEN-Membran-Folien differenziert und Laser-Mikrodissektion durchgeführt wurde.
Abstract
Neuroprogenitor Zellen (NPC) von der menschlichen fötalen Gehirn isoliert wurden unter proliferativen Bedingungen in Gegenwart von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), um eine reichliche Zufuhr von Zellen bereitzustellen erweitert. NSC in Gegenwart einer neuen Kombination von Nervenwachstumsfaktor (NGF) differenziert, brain-derived neurotrophic factor (BDNF), Dibutyryl-cAMP (DBC) und Retinsäure auf mit Poly-L-Lysin-und Maus-Laminin beschichteten Platten zu erhalten Neuron reichen Kulturen. NPCs wurden auch in der Abwesenheit von Neurotrophine, DBC und Retinsäure und in Gegenwart von ciliary neurotrophic factor (CNTF) zu Astrozyten-reichen Kulturen ergeben differenziert. Differenzierte NPCs wurden durch Immunfluoreszenzfärbung für ein Panel von neuronalen Marker NeuN einschließlich, Synapsin, Acetylcholinesterase, Synaptophysin und GAP43 gekennzeichnet. Saure Gliafaserprotein (GFAP) und STAT3, Astrozyten-Marker wurden in 10-15% der differenzierten NPCs erkannt. Zur ErleichterungZelltyp-spezifische molekulare Charakterisierung wurde die Laser Mikrodissektion durchgeführt, um Neuronen auf Polyethylennaphthalat (PEN)-Membran gleitet kultiviert isolieren. Die in dieser Studie beschriebenen Methoden liefern wertvolle Werkzeuge, um unser Verständnis der molekularen Mechanismen der Neurodegeneration zu fördern.
Introduction
Lebenslange Neurogenese ist bekannt, in der Subventrikularzone der Seitenventrikel und der subgranulären Schicht des Gyrus dentatus des erwachsenen Gehirns von Säugetieren 1 auftreten. Neuroprogenitor Zellen (NPCs), die aus diesen Regionen stammen, sind multipotente Zellen, die in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten 2 differenzieren können. NSC haben Interesse, weil ihr Potential bei Patienten mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen einschließlich Parkinson-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Schlaganfall und Alzheimer-Krankheit (AD) 3 transplantiert werden erzeugt. Studien mit NPCs haben in der Regel auf dieser Transplantation Winkel konzentriert, aber das Potential der NPC-abgeleiteten Neuronen als Zellkultur-Modell, um den Mechanismus der Neurodegeneration zu bestimmen, ist noch nicht vollständig ausgenutzt. Frühere Studien haben in der Regel verwendet, post-mitotischen Neuronen aus Nager-Hirngewebe, die für jedes Experiment isoliert werden müssen, da sie nicht isoliert sindSelbsterneuerung. Obwohl humane Neuroblastom-Zelllinien, einschließlich SH-SY5Y-und SK-N-MC-Zellen erweitert werden kann, haben sie nicht die Eigenschaften der primären Neuronen. Menschliche NSC, andererseits bieten sowohl Vorteile, da sie für mehrfache Durchgänge erweitert werden und differenziert werden, um eine Zellpopulation mit den Merkmalen des primären Neuronen 4,5 zu erzeugen. In der aktuellen Studie beschreiben wir eine neue Differenzierungsprotokoll, um eine konsistente Neuron-reichen Bevölkerung aus kommerziell erhältlichen NPCs aus menschlichen fetalen Gehirns isoliert zu erhalten. Da diese Kulturen haben einen kleinen Prozentsatz von Gliazellen enthalten, brauchen wir zusätzliche Methoden, um eine reine Population von Neuronen zur molekularen Charakterisierung isolieren. Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) ist eine neuartige Technik, mit der eine homogene Population von Zellen aus einem Gewebeschnitt selektiv zur Genexpressionsanalyse 6 erfasst werden. Das Gehirn ist ein heterogenes Gewebe, bestehend aus Neuronen, Glia und anderen Zell types. LCM wurde verwendet, um Neuronen-spezifische Genexpression zu bestimmen, analysiert 7-10. Wir haben schon früher durchgeführt LCM von Neuronen im Hippocampus von AD (Tg2576) Maushirnschnitten zu einer verminderten Expression des zyklischen AMP-Response-Element-bindendes Protein (CREB) und BDNF spezifisch in Neuronen im Hippocampus 11 zeigen. In der vorliegenden Studie beschreiben wir Verfahren für die Erweiterung der menschlichen NPCs, neuronale Differenzierung, Immunfluoreszenzfärbung für neuronale Marker und LCM für die Isolierung von Neuronen auf PEN-Membran-Folien kultiviert.
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Protocol
1. Erweiterung des menschlichen NPCs (Abbildung 1)
- Revive die Tiefkühllagerung von menschlichen NPCs aus fötalen Gehirns (Lonza Walkersville, MD, USA) und Kultur sie in Suspension in T-75-Flaschen als Neurosphären (Abbildung 1A) in Neurobasalmedium enthält Proliferation Ergänzungen, EGF (10 ng / ml) und FGF (10 ng / ml).
- Nach 3 Tagen in Kultur übertragen die Neurosphären in ein 15 ml Zentrifugenrohr und bei 500 rpm für 5 min.
- Überstand verwerfen und hinterließ ~ 100 ul Medium über dem Zellpellet und Überführung in ein Eppendorf-Röhrchen. A 100 ul Zellpellet ist genug, um in zwei T-75-Flaschen aufgeteilt. Wenn weniger, reduzieren Sie die Anzahl der Fläschchen, als neuroprogenitor Zellen nicht zu vermehren, wenn aufgeteilt dünn.
- Verreiben des Pellets mit einer Spitze 200 ul 50x, während die 200 ul Spitze gegen den Boden des Röhrchens. Teilen Sie die Zellsuspension in zwei gleiche Teile und fügen Sie sie in zwei T-75-Flaschen (1-2 split), eine für die FortsetzungExpansion und eine weitere Differenzierung.
- Fahren Sie mit der Kultur der neuroprogenitor Zellen für die Erweiterung (erste Kolben), indem das Medium alle 4-5 Tage, bis die Neurosphären ihrer ursprünglichen Größe von 300-500 um zu erreichen. Ändern Medium durch Zentrifugation (500 rpm, 5 min), entsorgen Sie das alte Medium und neue Medium.
2. Differenzierung von humanen NPCs in ein Neuron reiche Kultur (Abbildung 2)
- Für die Differenzierung von Zellen in eine neuroprogenitor Neuron reiche Kultur, legen Sie eine einzelne Deckglas in jede Vertiefung einer 24-Well-Platte und Mantel mit 100 ug / ml Poly-L-Lysin durch Zugabe von 500 ul in jede Vertiefung. Geschirr Inkubation 30 min bei RT.
- Saugen Sie den Poly-L-Lysin-Lösung und spülen Sie die Platte mit sterilem Wasser.
- Nächstes Beschichtung der Vertiefungen der Platte mit 500 ul 5 ug / ml Maus-Laminin und Inkubation für 30 min. Nach der Inkubation, Waschen der Vertiefungen mit PBS.
- 4 Tage nach splitting der Zellen (Schritt 1.4), übertragen Sie die kleinen Neurosphären in den Kolben mit der Bezeichnung "Für Differenzierung" in die beschichteten Schalen in einer Dichte von ~ 500 Neurosphären pro Vertiefung einer 24-Well-Platte.
- Nach 6 Stunden, wenn die Neurosphären in die Schale legen, entfernen Sie das Proliferationsmedium und fügen Differenzierungsmedium, bestehend aus Neurobasalmedium, B27 ergänzen, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), und Retinsäure (2 uM).
3. Immunfluoreszenz-Färbung von Differentiated NPCs (Abbildung 3)
- Nach Kultur der Zellen in neuroprogenitor neuronalen Differenzierungsmedium für zwei Wochen, wird ein Neuron-reiche Kultur erhalten. Spülen Sie die Neuronen einmal in PBS und dann fix sie in 4% Paraformaldehyd für 30 min. Einmal befestigt, spülen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
- Inkubieren der Zellen mit Permeabilisierung Puffer (5% BSA und 0,2% Triton X-100 in PBS) bei Raumtemperatur für 60 min.
- Geschirr O / N Inkubieren bei 4 ° C ina Shaker mit der folgenden Kombination von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern in 3% BSA in PBS: NeuN (1:250) und Synapsin (1:250); Acetylcholinesterase (1:500) und Synaptophysin (1:250), BDNF (1 : 500) und GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) und GFAP (1:1000).
- Dreimal Waschen Sie die Deckgläser mit PBS inkubiert und dann sie mit Anti-Kaninchen-Cy3-und Anti-Maus-FITC Sekundärantikörper bei RT in Dunkelheit für 90 min. Nach der Inkubation, waschen Sie die Deckgläser dreimal mit PBS.
- Zeigen 10 ul Montagemedium auf einen Objektträger, nehmen Sie das Deckglas von der Kulturschale mit einer Pinzette, und legen Sie es auf den Kopf an der Montage Medium. Sanft, wischen Sie überschüssiges Medium Montage und die Ränder mit Nagellack.
- Untersuchen der immun Neuronen in einem Fluoreszenzmikroskop.
4. Laser Mikrodissektion von Neuronen (Fig. 4)
- Differenzieren NPCs in einem Neuron-reiche Kultur auf PEN-Membran SchieberS mit Poly-L-Lysin und Laminin der Maus nach den für Fig. 2 beschriebenen Verfahren beschichtet.
- Führen Sie alle weiteren Schritte unter RNase-freien Bedingungen.
- Stain die Kulturen mit HistoGene Stain (Arcturus), um die Zellen zu visualisieren.
- Finden Sie die Bereiche der reinen neuronalen Populationen frei von Astrozyten mit der Straßenkarte Bild des gesamten Folie mit dem Veritas LCM-System. Markieren Sie die Neuronen mit Hilfe der Zeichenwerkzeuge.
- Laser-Capture durchführen dieser Bereiche mit computergesteuerten Präzisions und Automatisierung in einem zweistufigen Prozess. Zuerst wird IR (Infrarot) an mehreren Stellen mit einer Laserleistungseinstellung von 70 mW und einer Puls 2.500 &mgr; gebrannt, um die Membran zu befestigen, um die Kappe. Als nächstes wird der markierte Bereich unter Verwendung eines UV-Schneidwerkzeug bei einem niedrigen Pegeleinstellung von 10 mV ausgeschnitten.
- Kombination dieser Verfahren selektiv erfasst die markierten Bereiche aus der PEN-Membran auf CapSure LCM Makro Kappen. Wenn die Kappe angehoben wird, die Membran mit dem neurons hält sich an die Mütze.
- Isolieren Gesamt-RNA aus LCM-Proben unter Verwendung eines PicoPure RNA-Isolierung-Kit (Arcturus) und Behandlung mit DNase.
- Amplify die isolierte RNA mit RNA-Amplifikation Kit RiboAMP folgenden Anweisungen aus dem Kit.
- Führen Sie Echtzeit-RT-PCR-Analyse unter Verwendung von TaqMan-Sonden für die menschliche Neurofilament schweren Kette (hNFHc) zu erfassen.
Abkürzungen:
AD, Alzheimer-Krankheit, BDNF, brain-derived neurotrophic factor, CREB, cyclische AMP-Antwortelement bindendes Protein, DBC, cyclische Dibutyryl AMP, EGF, epidermaler Wachstumsfaktor, FGF, Fibroblastenwachstumsfaktor, GFAP, saures Gliafaserprotein; LCM Laser Mikrodissektion, NGF, Nervenwachstumsfaktor; NPC, neuroprogenitor Zelle; PEN, Polyethylennaphthalat.
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Representative Results
Ausbau der NPCs (Abbildung 1)
Wenn Neurosphären werden auf einer Einzelzellsuspension durch Verreiben gebrochen, muss der Pipettenspitze, um den Boden des Röhrchens zu berühren, so dass es einen gewissen Widerstand, wenn die Suspension auf und ab pipettiert. Die Anzahl der Verreibung wird zwischen Individuen und muß durch Versuch und Irrtum durch Untersuchen der resultierenden Zellsuspension unter dem Mikroskop bestimmt werden variieren. Es ist kritisch, um eine ausreichende Dichte der Zellsuspension bereitzustellen, weil die Proliferation wird mit einer schnelleren Rate, wenn die NSC in engen Kontakt. Wenn NSC nicht wachsen, sollte die Zelldichte durch Verringerung der Anzahl der Kolben erhöht werden. Wir waren in der Lage, die Neurosphären bis zu 10-15 Passagen erweitern. Somit reichliche Zufuhr von menschlichen NSC erzeugt werden, wodurch die Verwendung von menschlichen fötalen Gewebe. Für weitere Versorgung von NPCs und Neuronen, ist es wünschenswert, sie zunächst für 3-4 Passagen erweitern und anschließendDie Hälfte der NPCs können als Neurosphären erweitert werden und die andere Hälfte für die laufenden Experimente unterschieden werden. Alternativ kann auch für NSC mehrere Durchlässe, in flüssigem Stickstoff wie in dem Fall von Zelllinien eingefroren, um größere Versorgungs Bestände erzeugen ausgebaut und bei Bedarf wiederbelebt. Es ist auch wünschenswert, Experimente mit Neuronen aus verschiedenen Chargen von NSC abgeleitet zuführen.
Neuronale Differenzierung von NPCs (Abbildung 2)
NSC sind multipotenten Zellen und können in Abhängigkeit von den Kulturbedingungen in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten differenzieren. Unsere Differenzierung Protokoll beteiligt Aussaat von 4 Tage alten Neurosphären in beschichteten Schalen (2A). Wir haben beobachtet, dass es wichtig ist, eine ausreichende Dichte der Neurosphären Saatgut, so dass die differen Neuronen verteilt herum und bilden ein dichtes Netz von neuronalen Prozessen. Bilder nach 1 (2B) und 4 Tage (Abb.Abbildung 2C) der Aussaat werden gezeigt. Neuron-reichen Kulturen ergab 80-90% Neuronen und Astrozyten 10-15% wurden nach der Differenzierung von NSC in Gegenwart einer Kombination von NGF, BDNF, DBC und Retinsäure für zwei Wochen (Fig. 2D) erhalten. Um das Beste aus unserem Wissensstand sind die in dieser Studie für die neuronale Differenzierung beschriebenen Protokoll wurde bisher nicht von anderen berichtet. In Gebieten mit geringer Dichte, differenzierte NPCs in Astrozyten (2E). Um eine Astrozyten-reiche Kultur zu erhalten, können NSCs in Gegenwart von CNTF (10 ng / ml) und in Abwesenheit von NGF, BDNF, DBC und Retinsäure kultiviert werden. Damit das Neuron-Astrozyten Zusammensetzung kann während der Differenzierung in Abhängigkeit von dem Ziel des Versuchs manipuliert werden.
Charakterisierung differenzierter Neuronen (Fig. 3)
Zur weiteren Charakterisierung diese differenzierten NPCs, führten wir Doppelimmunfärbung für neuronale Marker with polyklonale und monoklonale Antikörper, gefolgt von Exposition gegenüber Kaninchen-und Maus-sekundären Antikörper zu Cy3 (rot) und FITC (grün), die jeweils verbunden sind. Die folgenden neuronalen Marker wurden entdeckt: 3A:. NeuN und Synapsin 3B:. Acetylcholinesterase (AChE) und Synaptophysin 3C: BDNF und GAP43. Daher haben die differen NSC die Eigenschaften der primären Neuronen. Zusätzlich wurden Astrozyten GFAP Marker STAT3 und in einer kleinen Population von Zellen (Fig. 3A) erfaßt. Daher sind weitere Verfahren für Neuronen-spezifische Gen-Expressionsanalyse erforderlich.
Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) der Neuronen (Fig. 4)
Obwohl LCM kann für die Isolierung von Zellen aus einer Kulturschale, unseren ersten Versuchen der LCM mit Neuronen fehlgeschlagen verwendet, da sie fest mit den beschichteten Schalen befestigt werden. Um dieses Problem zu überwinden, unterschieden wir NPCs on PEN-Folien mit Membranplatten mit Poly-L-Lysin und Laminin der Maus beschichtet. Der Objektträger wurde in einem 100 mm Zellkulturschale (4A) angeordnet ist. Die Anordnungen der PEN-Membran Rutsche und LCM Kappen sind in 4B gezeigt. Die Kulturen wurden mit HistoGen Fleck (Arcturus) angefärbt, um die Zellen (4C) zu visualisieren. Der Objektträger wurde in das Mikroskop in der Arcturus Veritas Instrument platziert. Die zu erfassenden Neuronen wurden mit Zeichenwerkzeugen (4D) gekennzeichnet. CapSure HS Caps wurden auf der PEN-Membran platziert. Verwendung einer Kombination von UV-und IR-Laserschneiden Laser Capture wurden die markierten Bereiche auf der Kappe gesammelt. Die erfassten Neuronen auf der Kappe bei niedriger (Fig. 4F) und hoch (Fig. 4F) Vergrößerung dargestellt.
Fig. 1 ist.Erweiterung der menschlichen NPCs. A. NSC wurden in Suspension in T75-Kolben als Neurosphären. B. Bei der Neurosphären erreicht die Grße von 300-500 &mgr; m, sie auf 15 ml-Röhrchen überführt und bei 1000 rpm für 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Zellpellet in 200 ul Medium wurden in Eppendorf-Röhrchen überführt und pulverisiert. D. Neurosphären bereit, aufgeteilt gezeigt. E. Defektes Neurosphären nach Verreiben gezeigt.
2. Differenzierung von humanen NPCs. A. Neurosphären wurden durch Verreiben und für vier Tage kultiviert gebrochen neue Neurosphären zu erzeugen. B. Vier Tage alte Neurosphären wurden mit Poly-L-Lysin-und Maus-Laminin beschichteten Platten ausgesät. C. Differentiation von NPCs wurde in Anwesenheit von NGF, BDNF, DBC und Retinsäure in drei Tagen nach der Aussaat beobachtet. D. Neuron reiche Kultur wurde nach zwei Wochen erhalten. E. NPCs in Gebieten mit geringer Dichte in Astrozyten differenziert. F. NPCs in Astrozyten-reiche Kultur in Gegenwart von CNTF (10 ng / ml) und in Abwesenheit von NGF, BDNF, DBC und Retinsäure differenziert.
3. Astrozyten und neuronalen Marker in differenzierten menschlichen NSC. NSC zwei Wochen differenziert wurden fixiert und für Doppel angegebenen Ziele mit polyklonalen und monoklonalen Antikörpern immungefärbt, gefolgt von Exposition gegenüber Kaninchen-und Maus-sekundären Antikörper zu Cy3 (rot) und FITC (grün), die jeweils verbunden sind. Die folgenden neuronalen Marker wurden festgestellt: A. NeuN und Synapsin.B. Acetylcholinesterase (AChE) und Synaptophysin. C. BDNF und GAP43. Zusätzlich wurden die folgenden Astrozyten Marker nachgewiesen: D. STAT3 und GFAP.
4. Laser Mikrodissektion von Neuronen. A. NPCs wurden auf einem PEN-Membran Objektträger mit Poly-L Lysin-und Maus-Laminin differenziert. Der Objektträger wurde in einem 100 mm-Zellkulturschale gegeben. B. Die Anordnungen der PEN-Membran Rutsche und LCM Kappe in der Arcturus Veritas Instrument werden angezeigt. C. Die Kulturen wurden mit HistoGen Fleck (Arcturus) angefärbt, um die Zellen zu visualisieren. D. Die Neuronen erfasst werden wurden mit Zeichenwerkzeugen markiert. Die erfassten Neuronen auf der Kappe auf niedrig (E) und High (F) gezeigt Magnifizierung. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
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Discussion
Wir beschreiben in dieser Studie ein Neuron-reichen Zellkulturmodell durch die Differenzierung von selbst erneuernden menschlichen neuroprogenitor Zellen und eine Methode, um eine reine Population von Neuronen durch Laser-Mikrodissektion isolieren. Wir haben eine Kombination von NGF, BDNF, DBC und Retinsäure für die neuronale Differenzierung von NPCs verwendet. DBC wird zur CREB, ein Transkriptionsfaktor, der Neurogenese 12 verbessert aktivieren. Retinsäure induziert Zellzyklusaustritt und reduziert die Glia-Bevölkerung 13. Die in dieser Studie beschriebenen Methode beinhaltet Änderungen gegenüber unseren früheren Bericht 14. Wir hatten früher verwendet den Schritt des Verreiben der Neurosphären zu einer Einzelzellsuspension und dann säen sie in beschichteten Schalen. Dies kann zu einer ineffizienten neuronalen Differenzierung in Bereichen mit niedriger Dichte (2E) führen. Wir haben nun das Verfahren der Aussaat vier Tage alten kleinen Neurosphären (Abbildung 1B), die Kontakte zwischen Differenzierung sicherstellen eingeführtting Neuronen (Abbildung 1C). Darüber hinaus wird die Differenzierung Zuschlag (Stem Cell Technologies) mit B27 Ergänzung (Invitrogen) ersetzt, 4-5 Tage nach der Aussaat. Die aktuelle Methode liefert 80-90% Neuronen konsequent. Diese Neuronen mit einem umfangreichen Netzwerk von Prozessen kann in der Kultur für 2-3 Monate beibehalten werden, einen deutlichen Vorteil gegenüber dem Modell aus neuronalen Differenzierung von humanen Neuroblastom-Zelllinien entstehen. Immunfärbung für mehrere neuronalen Marker NeuN einschließlich, Synapsin, Acetylcholinesterase, Synaptophysin und GAP43 wurden mit differenzierten NSC (Abbildung 3) beobachtet. STAT3 und GFAP wurden Marker von Astrozyten auch in einer kleinen Population von Zellen festgestellt. Durch die Erhöhung der Konzentration von Retinsäure auf 2-5 um, kann die Population von Astrozyten weiter reduziert werden. Jedoch können solche Kulturen nicht für eine lange Dauer beibehalten werden, da Gliazellen unterstützen das neuronale Überleben durch die Sekretion von Wachstumsfaktoren. Wir haben beobachtet, dass esist wünschenswert, Retinsäure-Konzentration 3-5 Tage vor der Durchführung der Experimente zu erhöhen.
Die Heterogenität der differenzierten Neuronen stellt Herausforderungen in Bezug auf die Bestimmung der Zelltyp-spezifischen Genexpressionsprofilen. Daher haben wir die Bedingungen für LCM von kultivierten Neuronen (Fig. 4) optimiert. In der aktuellen Studie, unterschieden wir NPCs auf Folien mit PEN-Membraneinsätze durchgeführt und LCM, weil diese Technik vorgestellt Schwierigkeiten mit kultivierten Neuronen auf regelmäßige Zellkulturschalen, wie sie fest angebracht sind. Obwohl die Ziele der LCM durch immunhistochemische Analyse getroffen werden, LCM bietet mehrere Vorteile, einschließlich der Fähigkeit, das Signal auf RNA-Ebene zu verstärken, führen Multiplexanalyse und genaue Quantifizierung. Wenn mit Microarray kombiniert, ermöglicht LCM-Expressionsanalyse von Tausenden von Genen in bestimmten Zelltypen 15.
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Disclosures
Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Merit Bewertung Zuschuss (NEUD-004-07F) von der Veterans Administration (SP) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
- Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
- Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
- Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
- Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
- Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
- Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
- Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60 (2011).
- Dworkin, S., Mantamadiotis, T.
- Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
- Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
- Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).
