Summary
人类neuroprogenitor细胞（的NPC）增殖的条件下扩大。的NPC分化成神经营养因子中的组合的存在下神经元的富培养物。用免疫组化法检测神经元标志物。为了分离神经元的纯人口的NPC分化的PEN膜幻灯片并进行激光捕获显微切割。
Abstract
Neuroprogenitor细胞（的NPC）从人胎脑分离出的表皮生长因子（EGF）和成纤维细胞生长因子（FGF），以提供细胞的大量供应的存在下增殖的条件下展开。的NPC分化中的神经生长因子（NGF）的新组合的存在下，脑源性神经营养因子（BDNF），丁酰腺苷（DBC）与上餐盘涂有聚-L-赖氨酸和小鼠层粘连蛋白 - 视黄酸，以获得神经元丰富的文化。的NPC也有区别在缺乏神经营养因子，DBC和视黄酸和睫状神经营养因子（CNTF），得到星形胶质细胞培养丰富的存在。差异化的NPC的特点是免疫荧光染色的神经元标志物，包括的NeuN，突触素，乙酰胆碱酯酶，突触素及GAP43面板。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和STAT3，星形胶质细胞标志物，在分化的NPC的10-15％进行检测。为了便于细胞类型特异性分子鉴定，激光捕获显微切割进行分离神经元的聚乙烯酯（PEN）膜的载玻片培养。在这项研究中所描述的方法提供了有价值的工具，以促进我们的神经变性的分子机制的理解。
Introduction
寿命长的神经发生是已知发生在侧脑室的脑室下区和在成年哺乳动物脑1的齿状回的颗粒下层。 Neuroprogenitor细胞（的NPC）来自这些地区的起源是多能细胞，它可以分化成神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞2。的NPC所产生的，因为其潜在的患者的各种神经变性疾病，包括帕金森氏病，肌萎缩性侧索硬化，中风和阿尔茨海默氏病（AD）的3到被移植的兴趣。与研究的NPC一般都集中在这个移植的角度，但NPC来源的神经元的细胞培养模型，以确定神经退行性病变的机制的潜力还没有得到充分发挥。以前的研究一般用有丝分裂后的神经元从啮齿动物脑组织中需要被分离为每个实验中分离，因为它们是不自我更新。虽然人类成神经细胞瘤细胞系包括SH-SY5Y和SK-N-MC细胞可以扩展，它们不具有原代神经元的特征。人类的NPC，在另一方面，提供了两者的优点，因为它们可以被扩展为多通道，并且可以分化产生的细胞群体与原代神经元4,5的特性。在目前的研究中，我们描述了一种新的分化方案，从人胎脑分离市售的NPC获得一致的神经元的富人口。因为这些文化都包含一个小的百分比胶质细胞，我们需要更多的方法来分离神经元的分子鉴定纯人口。激光捕获显微切割（LCM）是一种新颖的技术，其中来自组织切片的细胞同源性的群体可以被选择性地捕获用于基因表达分析6。大脑是一个异类组织包括神经元，神经胶质细胞和其他细胞TYPES。 LCM被用于确定神经元特异性基因表达分析7-10。之前我们已经进行海马神经元的LCM从公元（Tg2576转）鼠脑切片，专门用于显示在海马神经元11表达降低的环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）和BDNF。在本研究中，我们描述了人类的NPC的扩大，神经元分化，免疫荧光染色神经元标志物及LCM神经元对PEN膜玻片培养的分离程序。
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Protocol
1。扩展人类的NPC（ 图1）
- 重振胎儿脑（龙沙，Walkersville，MD，USA），并将它们悬浮培养中的T-75瓶中含有增殖补充，表皮生长因子（10毫微克/毫升）的神经球（ 图1A）的Neurobasal培养基人类的NPC的冷冻股票和FGF（10纳克/毫升）。
- 后在培养3天后，将神经球转移到15毫升管中，离心分离机，在500 rpm离心5分钟。
- 弃去上清液留下〜100μl的培养基上的细胞沉淀，并转移到Eppendorf管中。将100μl细胞沉淀，就足以分裂成2个T-75瓶。如果少，减少瓶中的数量作为neuroprogenitor细胞不能增殖，如果分割薄。
- 磨碎的沉淀用200μl的尖端50倍，同时保持对管底部的200μl的小费。分裂细胞悬液平均分成两部分，并将它们添加到2个T-75瓶（1-2分），一个用于继续扩张，另一个用于分化。
- 通过改变培养基每4-5天，直到神经球达到300-500微米原始大小继续neuroprogenitor细胞扩张（第一瓶）的培养。通过离心改变介质（500转，5分钟），弃去旧培养基，并添加新的媒介。
2。分化人类的NPC成神经元丰富的文化（ 图2）
- 为分化neuroprogenitor细胞向神经元丰富的文化，将单盖玻片到24孔板中并涂覆有聚-L-赖氨酸的100微克/毫升的各孔中加入500微升每孔。孵育菜在室温30分钟。
- 吸出聚-L-赖氨酸溶液中，用无菌水漂洗该板。
- 接着，涂层的钢板用500μl的5μg/ ml的小鼠层粘连蛋白的孔中并孵育30分钟。孵育后，洗井用PBS。
- splitti后4天毫微小区（步骤1.4），转移将烧瓶中的小神经球标记为“对于分化'到包被的培养皿以每孔〜500的神经球在24孔平板的密度。
- 6小时后，当神经球附着到培养皿，取出增殖培养基中，并添加选自Neurobasal培养基的分化培养基，B27添加剂，NGF（20纳克/毫升），BDNF（10毫微克/毫升）中，DBC（100毫米），和视黄酸（2μM）。
3。差异化的NPC的免疫荧光染色（ 图3）
- 以下neuroprogenitor细胞在神经分化培养基中两周的培养时，获得一个神经元的富培养。冲洗的神经元一旦在PBS中，然后修复它们在4％多聚甲醛30分钟。一旦固定，冲洗细胞三次，用PBS。
- 孵育的细胞用透化缓冲液（5％BSA和0.2％的Triton X-100的PBS中）在室温下60分钟。
- 孵育菜O / N在4°C I呐振动筛与多克隆和单克隆抗体的PBS中3％BSA的下列组合：突触素（1:250）的NeuN（1:250）和;乙酰胆碱酯酶（1:500）和突触素（1:250），BDNF（1 ：500）和GAP43（1:250），STAT3（1:500）和GFAP（1:1,000）。
- 用PBS洗涤盖玻片3次，然后孵育它们与抗兔Cy3和抗小鼠FITC二抗在室温下在黑暗中90分钟。孵育后，用PBS洗涤盖玻片3次。
- 将10微升安装介质的载玻片上，取出盖玻片从培养皿用镊子，并把它倒挂在安装介质上。轻轻擦掉多余的安装介质和密封的边缘与指甲油。
- 检查荧光显微镜的免疫染色的神经元。
4。神经元的激光捕获显微切割（ 图4）
- 分化的NPC成神经元丰富的文化对PEN膜幻灯片š以下对于图2中描述的方法用聚-L-赖氨酸和小鼠层粘连蛋白。
- 执行无RNA酶的条件下，所有后续步骤。
- 使用HistoGene染色（大角星），以可视化的细胞染色的文化。
- 发现纯神经元群体缺乏使用与Veritas LCM系统的整个幻灯片的路线图图像星形胶质细胞等领域。使用绘图工具标记的神经元。
- 执行使用计算机控制的精确度和自动化在一个两步骤过程中，这些区域的激光捕获。首先，IR（红外线）被射向多点为70毫瓦和2500微秒的脉冲激光功率设置，以获得膜附着到帽。接着，标记区域使用的UV刀具以10毫伏的低级别设置切除。
- 这些工艺的组合选择性地捕获从PEN膜标记区域到CAPSURE LCM宏观帽。当盖子被提起，与n的膜eurons附着到帽。
- 提取总RNA的使用PicoPure RNA提取试剂盒（大角星），LCM样品和治疗用DNase。
- 使用RiboAMP RNA扩增试剂盒，按照从试剂盒说明书扩增分离出的RNA。
- 利用TaqMan探针来检测人神经丝重链（华南金控）进行实时定量RT-PCR分析。
缩写：
AD，阿尔茨海默氏病; BDNF，脑源性神经营养因子; CREB，环AMP应答元件结合蛋白; DBC，双丁酰环腺苷酸; EGF，表皮生长因子; FGF，成纤维细胞生长因子; GFAP，神经胶质纤维酸性蛋白; LCM，激光捕获显微切割，神经生长因子，神经生长因子，全国人大代表，neuroprogenitor细胞，PEN，聚萘二甲酸。
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Representative Results
扩展的NPC（ 图1）
当神经球被分解为单细胞悬浮液通过研磨，枪头需要触摸在管的底部，以便有当将悬浮液用移液管上下一些阻力。中研磨的次数将个体，需要通过反复试验通过在显微镜下检查所得到的细胞悬液决定之间变化。关键是要提供细胞悬液足够的密度，因为扩散会以更快的速度，当的NPC都在密切接触。如果的NPC不生长，细胞密度应增加减少瓶中的数量。我们已经能够扩大神经球长达10-15通道。可以生成人体的NPC的供应因此充裕，减少了使用人类胚胎组织。对于持续供应的NPC和神经元，最好是一开始扩大他们的3-4通道，随后，一半的NPC可以被扩展为神经球，而另一半可以分化为正在进行的实验。或者，的NPC也可以扩展为多通道，冷冻在液氮中的细胞系的情况下，生成供给股的直径，并在需要时恢复。还希望与来自的NPC不同批次衍生的神经元进行实验。
的NPC的神经元分化（ 图2）
的NPC是多能细胞，并且可以分化成神经元，星形胶质细胞少突胶质细胞或根据培养条件。我们的分化方案所涉及的4天龄的神经球在涂覆的培养皿（ 图2A）播种。我们观察到，它是必不可少的种子神经球具有足够的密度以使区分神经元周围扩散，并形成致密的网络的神经元过程。之后的图像1（ 图2B）和4天（ 图播种的URE 2C）被示出。神经元的富培养得到80-90％的神经元和10〜15％的星形胶质细胞，的NPC在NGF，BDNF，DBC和视黄酸两周（ 图2D）的组合的存在下分化后得到的。尽我们所知，在本研究中对神经细胞的分化中描述的协议以前尚未报道的其他人。在低密度区域，的NPC分化成星形胶质细胞（ 图2E）。以获得星形胶质细胞丰富的文化，的NPC可以培养在睫状神经营养因子（10毫微克/毫升）的存在下和在不存在NGF，BDNF，DBC和视黄酸。因此，神经元星形胶质细胞的组合物可分化过程取决于实验的目的来操作。
分化的神经元的特征（ 图3）
为了进一步确定这些分化的NPC，我们进行双重免疫染色神经元标记瓦特第i个多克隆和单克隆抗体，随后暴露于兔和小鼠挂钩的Cy3（红色）和FITC（绿色）的第二抗体。检测到下面的神经元标志物： 图3A：。的NeuN和突触图3B：乙酰胆碱酯酶（AChE）活性和突触素图3C：BDNF和GAP43。因此，分化的NPC有原代神经元的特征。此外，星形胶质细胞标记物STAT3和GFAP的一小群细胞（ 图3A）进行检测。因此，需要对神经元特异性基因表达分析的其他方法。
神经元的激光捕获显微切割（LCM）（ 图4）
虽然LCM可用于从一个培养皿中，LCM的我们的与神经元的失败尝试初始隔离的细胞，因为它们被牢固地连接到包被的培养皿。为了克服这个问题，我们有区别的NPCØÑ载玻片与涂有聚-L-赖氨酸和小鼠层粘连蛋白对PEN膜的插入。将载片置于100毫米的细胞培养皿（ 图4A）内。在PEN膜滑动及LCM上限的安排如图4B所示。培养物进行染色HistoGen染色（大角）以可视化的细胞（ 图4C）。将载玻片放置在显微镜的大角Veritas的仪器。被捕获的神经元标记的绘图工具（ 图4D）。 CAPSURE HS上限被放置在PEN膜。使用紫外激光切割和红外激光捕获的组合，该标志的区域收集到的上限。捕获的神经元都显示在低帽（ 图4F）和高（ 图4F）的放大倍率。
图1。扩展人类的NPC。答的NPC共培养在悬浮在T75烧瓶作为神经球。B.当神经球达到300-500微米的大小，将它们转移至15ml管中，并以1,000 rpm离心5分钟。 将上清液弃去并在200μl培养基中的细胞沉淀物转移到Eppendorf管中并研磨。D.神经球愿被分割显示。以下E.研磨破碎神经球被示出。
图2。分化人类的NPC。通过研磨和培养4天C.与差异A.神经球被打破，以产生新的神经球。B.四日龄的神经球接种于菜肴涂有聚-L-赖氨酸和小鼠层粘连蛋白。观察NGF，BDNF，DBC和视黄酸在三天后播种存在的NPC和灰。两个星期后，获得D.神经元丰富的文化。 大肠杆菌的NPC分化为星形胶质细胞在低密度区域。 楼的NPC分化成中CNTF（10纳克/毫升）的存在下和在不存在NGF，BDNF，DBC和视黄酸的星形胶质细胞的丰富培养。
图3。神经元和在分化的人的NPC。的NPC分化两周星形胶质细胞标记物的固定和双重免疫染色用多克隆和单克隆抗体指示目标，随后暴露于兔和小鼠相连的Cy3（红色）和FITC（绿色）的第二抗体。检测到下面的神经元标志物：A.的NeuN和突触。B.乙酰胆碱酯酶（AChE）活性和突触。C. BDNF和GAP43。此外，发现了下面的星形胶质细胞标记物：D. STAT3和GFAP。
图4。神经元的激光捕获显微切割。A.的NPC分化上涂有聚左赖氨酸和鼠标的层粘连蛋白包括PEN膜的幻灯片。幻灯片放在100毫米细胞培养皿中。B.在大角星的Veritas仪器PEN膜的滑动及LCM帽的安排如图所示。C.培养沾满HistoGen染色（大角星），以可视化的细胞。D.该被捕获的神经元被标记绘图工具。所捕获的神经元显示在低帽（E）和高（F）马尼fication。 点击这里查看大图 。
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Discussion
我们在本研究中通过自我更新的人neuroprogenitor细胞分化神经元丰富的细胞培养模型和方法，通过激光捕获显微切割分离神经元的纯人口。我们已经使用了NGF，BDNF，DBC和视黄酸对的NPC的神经元分化的组合。 DBC是用来激活CREB，增强神经发生12的转录因子。维甲酸诱导细胞周期退出和减少胶质人口13。在这项研究中所描述的方法采用修改过我们之前的报告14。我们早先用捣碎的神经球，以单细胞悬浮液，然后播种它在包被的培养皿上的步骤。这可导致在低浓度（ 图2E）的区域低效的神经细胞的分化。我们现在已经推出了播种四日龄小神经球（ 图1B），以确保不同点之间的联系的过程婷神经元（ 图1C）。此外，分化补充剂（干细胞技术）被替换为B27添加物（Invitrogen）中，播种后4-5天。目前的方法产生80-90％的神经元一致。这些神经元具有广泛的流程网络可以维持在培养2-3个月，超过从人成神经细胞瘤细胞系的分化得到的神经元模型中具有明显的优势。免疫染色几个神经元标记物，包括神经元核抗原，突触蛋白，乙酰胆碱酯酶，突触素和GAP43下观察分化的NPC（ 图3）。 STAT3和GFAP，也于一小群细胞检测星形胶质细胞的标志物。通过增加视黄酸的浓度为2-5微米，在星形胶质细胞群体可以被进一步降低。然而，这样的培养物不能保持很长一段时间，因为神经胶质细胞生长因子的分泌支持神经元的存活。我们曾观察到，最好进行实验前3-5天，以增加维生素A的浓度。
分化的神经元的异质性呈现在确定细胞类型特异性基因表达分析方面的挑战。因此，我们已优化用于培养神经元的液晶显示模块（ 图4）的条件。在目前的研究中，我们区分在幻灯片上用PEN膜插入并执行LCM的NPC，因为这种技术提出了关于定期细胞培养皿困难与神经元的培养，因为他们牢固。虽然LCM的目标可以通过免疫组织化学分析得到满足，LCM提供了几个优势，包括在RNA水平上对信号进行放大，进行多重分析的能力，并准确定量。当与微阵列技术结合，LCM允许数以千计的基因在特定细胞类型15表达分析。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由退伍军人管理局优异审查补助金（NEUD-004-07F）（以SP）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
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