Summary
Menneske neuroprogenitor celler (NPC) ble utvidet i henhold prolifererende forhold. NPC ble differensiert i neuron rike kulturer i nærvær av en kombinasjon av neurotrophins. Nevrale markører ble oppdaget av immunfluorescens farging. Å isolere en ren populasjon av nevroner, ble NPCer differensiert på PEN membran sklier og laser capture microdissection ble utført.
Abstract
Neuroprogenitor celler (NPC) isolert fra human fetal hjerne ble ekspandert i henhold proliferative tilstander i nærvær av epidermal vekstfaktor (EGF), og fibroblast vekstfaktor (FGF) for å tilveiebringe en rikelig tilførsel av cellene. NPC ble differensiert i nærvær av en ny kombinasjon av nervevekstfaktor (NGF), hjerne-avledet neurotrop faktor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC), og retinsyre på skåler belagt med poly-L-lysin og mus laminin å skaffe neuron rike kulturer. NPC ble også differensieres i fravær av neurotrophins, DBC og retinsyre og i nærvær av ciliær neurotrofisk faktor (CNTF), hvorved astrocyte rike kulturer. Differensierte NPCer ble preget av immunfluorescens farging for et panel av nevrale markører inkludert Neun, synapsin, acetylkolinesterase, synaptophysin og GAP43. Glial fibrillary surt protein (GFAP) og STAT3, astrocyte markører, ble påvist i 10-15% av differensierte NPCer. For å lettecelle-type spesifikke molekylære karakterisering, laser capture microdissection ble utført for å isolere nerveceller dyrket på polyetylen naphthalate (PEN) membran sklier. Metodene som beskrives i denne undersøkelsen gir verdifulle verktøy for å fremme forståelsen av den molekylære mekanismen for neurodegenerering.
Introduction
Livs lang neurogenesis er kjent å forekomme i subventricular sone av den laterale ventrikler og i subgranular lag av dentate gyrus av den voksne hjernen hos pattedyr en. Neuroprogenitor celler (NPC) som stammer fra disse regionene er multipotente celler som kan differensieres til nevroner, astrocytter og oligodendrocytes to. NPC har vakt interesse på grunn av deres potensial til å bli transplantert i pasienter med forskjellige neurodegenerative forstyrrelser inkludert Parkinsons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, slag og Alzheimers sykdom (AD) 3. Studier med NPC har generelt fokusert på denne transplantasjon vinkel, men potensialet for NPC-avledet nerveceller som en cellekulturmodell for å bestemme mekanismen for nevrodegenerasjon er ikke blitt fullt utnyttet. Tidligere studier har generelt brukt post-mitotiske neuroner isolert fra gnager hjernevev som må være isolert for hvert forsøk som de ikke erselvfornyende. Selv om menneskelig neuroblastom cellelinjer inkludert SH-SY5Y og SK-N-MC celler kan utvides, de har ikke de samme egenskapene av primære nevroner. Menneskelige NPC, på den annen side, gir både fordeler fordi de kan utvides for flere passeringer, og kan differensieres for å generere en cellepopulasjon med egenskapene til primære neuroner 4,5. I den aktuelle studien, beskriver vi en ny differensiering protokollen for å oppnå en konsistent nevron-rik befolkningen fra kommersielt tilgjengelige NPCer isolert fra menneskelig fosterets hjerne. Fordi disse kulturene inneholder en liten prosent av gliaceller, trenger vi flere metoder for å isolere en ren populasjon av nevroner for molekylær karakterisering. Laser-fangst microdissection (LCM) er en ny metode der en homogen populasjon av celler fra en vev delen kan være selektivt fanget genekspresjonsanalyser 6 for. Hjernen er et heterogent vev bestående av nerveceller, gliaceller og andre celle types. LCM er blitt brukt til å bestemme neuron-spesifikk genekspresjon analyser 7-10. Vi har tidligere utført LCM av hippocampus nevroner fra AD (Tg2576) mus hjerne seksjoner for å vise redusert uttrykk av syklisk AMP respons element bindende protein (CREB) og BDNF spesielt i hippocampus nevroner 11. I den foreliggende studien, beskriver vi prosedyrer for utvidelse av menneskelige NPCer, neuronal differensiering, immunofluorescent farging for nevronale markører og LCM for isolering av nerveceller dyrket på PEN membran sklier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utvidelse av menneskerettighets NPCer (Figur 1)
- Gjenopplive den frosne lager av menneskelige NPCer fra fosterets hjerne (Lonza, Walkers, MD, USA) og kultur dem i suspensjon i T-75 kolber som neurospheres (Figur 1a) i Neurobasal medium som inneholder spredning kosttilskudd, EGF (10 ng / ml) og FGF (10 ng / ml).
- Etter 3 dager i kultur, overføre neurospheres til et 15 ml rør og sentrifugert ved 500 rpm i 5 min.
- Kast supernatanten etterlate ~ 100 ul medium ifølge cellepelleten og overfør til et Eppendorf-rør. En 100 pl cellepelleten er nok til å dele seg i to T-75 kolber. Hvis mindre, redusere antall kolber som neuroprogenitor celler ikke klarer å spre seg hvis splitte tynn.
- Triturer pellet med en 200 pl 50x spissen samtidig som 200 pl spissen mot bunnen av røret. Dele celle suspensjon likt i to deler og legge dem til to T-75 kolber (1-2 splitt), ett for fortsattekspansjon og en annen for differensiering.
- Fortsett kulturen i neuroprogenitor celler for ekspansjon (første kolbe) ved å endre medium hver 4-5 dager før de neurospheres nå sin opprinnelige størrelse på 300-500 mikrometer. Endre medium ved sentrifugering (500 rpm, 5 min), kast den gamle medium og legge nytt medium.
2. Differensiering av Menneskelig NPCer inn en Neuron-rik kultur (figur 2)
- For differensiering av neuroprogenitor celler i et neuron rik kultur, plassere et enkelt dekkglass i hver brønn av en 24-brønns plate og belegge med 100 ug / ml poly-L-lysin ved tilsetning av 500 ul i hver brønn. Inkuber retter i 30 min ved RT.
- Aspirer poly-L-lysin-løsning og skyll plate med sterilt vann.
- Deretter belegge brønnene i platen med 500 ul av 5 ug / ml mus laminin og inkuber i 30 min. Etter inkubasjon, vaske brønner med PBS.
- 4 dager etter splitting cellene (trinn 1.4), overfører de små neurospheres i kolben som er merket "for differensiering 'inn i de belagte retter til en tetthet på ~ 500 neurospheres per brønn av en 24-brønns plate.
- Etter seks timer, når de neurospheres feste til parabolen, fjerne spredning medium og legge differensiering medium som består av Neurobasal medium, B27 supplement, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mm), og retinsyre (2 pM).
Tre. Immunfluorescens Farging av differensierte NPCer (figur 3)
- Etter kultur neuroprogenitor celler i neuronal differensiering medium for to uker, er et nevron-rik kultur innhentet. Skyll nevroner gang i PBS og deretter fikse dem i 4% paraformaldehyde for 30 min. Når fast, skyll cellene tre ganger med PBS.
- Inkuber cellene med permeabilization buffer (5% BSA og 0,2% Triton X-100 i PBS) ved romtemperatur i 60 min.
- Inkuber rettene O / N ved 4 ° C ina rister med følgende kombinasjon av polyklonale og monoklonale antistoffer i 3% BSA i PBS: Neun (1:250) og synapsin (1:250); acetyl cholinesterase (1:500) og synaptophysin (1:250), BDNF (1 : 500) og GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) og GFAP (1:1.000).
- Vask Dekkglass tre ganger med PBS, og deretter inkubere dem med anti-kanin-Cy3-og anti-mus-FITC sekundære antistoff ved romtemperatur i mørke i 90 min. Etter inkubasjon, vaske Dekk tre ganger med PBS.
- Plasser 10 mL av monteringsmedium på en glass-slide, ta ut dekkglass fra kultur parabolen med tang, og legg den opp ned på monteringsmedium. Forsiktig og tørk vekk overflødig montering medium og forsegle kantene med neglelakk.
- Undersøk immunostained nevroner i en fluorescens mikroskop.
4. Laser Capture microdissection av nerveceller (figur 4)
- Skille NPCer inn et nevron-rik kultur på PEN membran lysbildes belagt med poly-L-lysin og laminin mus ifølge fremgangsmåtene beskrevet for figur 2..
- Utfør alle etterfølgende trinnene under RNAse-frie forhold.
- Flekk kulturer bruker HistoGene Stain (Arcturus) for å visualisere cellene.
- Finn områdene rene nevronale populasjoner blottet for astrocytter bruker veikart bilde av hele lysbildet med Veritas LCM-systemet. Marker nervecellene ved hjelp av tegneverktøy.
- Utfør laser fangst av disse områder ved hjelp av datamaskin-styrt presisjon og automatisering i en to-trinns prosess. Først, IR (infrarødt) brennes ved flere flekker med en lasereffektinnstilling på 70 mW og en puls over 2500 usekunder for å få membranen festes til hetten. Deretter blir markert område skåret ut ved hjelp av en UV-skjæreverktøy på et lavt nivå innstilling på 10 mV.
- Kombinasjon av disse prosessene selektivt fanger de markerte områdene fra PEN membran på CapSure LCM makro caps. Når lokket er løftet, membranen med neurons fester seg til cap.
- Isoler total RNA fra LCM prøver ved hjelp av en PicoPure RNA isolering kit (Arcturus) og behandle med DNase.
- Forsterke isolert RNA bruker RiboAMP RNA forsterkning kit følgende instruksjoner fra settet.
- Utfør real time RT-PCR analyse ved hjelp TaqMan prober å oppdage menneskelig neurofilament tung kjede (hNFHc).
Forkortelser:
AD, Alzheimers sykdom, BDNF, hjerne-avledet neurotrop faktor, CREB, cyklisk AMP responselement bindende protein; DBC, Dibutyryl cyklisk AMP, EGF, epidermal vekstfaktor, FGF, fibroblast vekstfaktor, GFAP, glial fibrillary surt protein, LCM, laser fange microdissection; NGF, Nerve vekst faktor; NPC, neuroprogenitor celle, PEN, polyetylen naphthalate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utvidelse av NPC (figur 1)
Når neurospheres er brutt ned til en enkelt cellesuspensjon ved triturering, må pipettespissen til å berøre bunnen av røret, slik at det ikke er noen motstand når suspensjonen blir pipettert opp og ned. Antall ganger av utgnidning vil variere mellom individer og må avgjøres ved prøving og feiling ved å undersøke den resulterende cellesuspensjon under et mikroskop. Det er viktig å sørge for tilstrekkelig tetthet av cellesuspensjonen på grunn av spredning vil være enda hurtigere når NPC kommer i nær kontakt. Hvis NPC ikke vokser, bør celletettheten økes ved å redusere antall kolber. Vi har vært i stand til å utvide neurospheres for opptil 10-15 passasjer. Således rikelig tilførsel av humane NPC kan genereres, noe som reduserer bruken av human fetal vev. For fortsatte tilførsel av NPC-og nerveceller, er det ønskelig å utvide dem først i 3-4 passeringer og deretter, Halvparten av NPCer kan utvides som neurospheres og den andre halvparten kan differensieres for pågående eksperimenter. Alternativt kan NPC kan også utvides for flere passasjer, frosset i flytende nitrogen som i tilfelle av cellelinjer for å generere større tilførsel av bestanden, og gjenopplivet ved behov. Det er også ønskelig å utføre forsøk med neuroner avledet fra forskjellige satser av NPC.
Neuronal Differensiering av NPC (figur 2)
NPCer er multipotente celler og kan bli differensiert i nevroner, astrocytter eller oligodendrocytes avhengig av forholdene kultur. Vår differensiering protokollen involvert seeding av 4-dagers gamle neurospheres i belagt retter (figur 2a). Vi har observert at det er viktig å frø tilstrekkelig tetthet av neurospheres slik at de unike nevroner spres rundt og danne et tett nettverk av neuronal prosesser. Bilder etter en (figur 2B) og 4 dager (figure 2C) for såing er vist. Neuron rike kulturer, hvorved 80-90% neuroner og astrocytter 10-15% ble oppnådd etter differensiering av NPC i nærvær av en kombinasjon av NGF, BDNF, DBC og retinsyre i to uker (figur 2D). Så langt vi kjenner til, den protokollen som er beskrevet i denne studien for nevronale differensiering har ikke tidligere blitt rapportert av andre. I områder med lav tetthet, NPCer differensiert i astrocytter (figur 2E). For å oppnå en astrocyte rike kultur, kan NPC dyrkes i nærvær av CNTF (10 ng / ml) og i fravær av NGF, BDNF, DBC og retinsyre. Dermed nevron-astrocyte sammensetning kan manipuleres ved differensiering, avhengig av formålet med forsøket.
Karakterisering av Differensiert nevroner (figur 3)
For ytterligere å karakterisere disse differensierte NPCer, utførte vi dual farging for nevrale markører wed polyklonale og monoklonale antistoffer, etterfulgt av eksponering overfor kanin-og muse sekundære antistoffer knyttet til Cy3 (rød) og FITC (grønn) hhv. Følgende nevrale markører ble oppdaget: figur 3A:. Neun og synapsin Figur 3B:. Acetylkolinesterasehemmere (Ache) og synaptophysin Figur 3C: BDNF og GAP43. Dermed blir differensierte NPCer har karakteristikkene av primære nevroner. I tillegg ble astrocyte markører STAT3 og GFAP detektert i en liten populasjon av celler (figur 3A). Derfor trengs flere metoder nevron spesifikke genuttrykk analyse for.
Laser Capture microdissection (LCM) av nerveceller (figur 4)
Selv LCM kan anvendes for isolering av celler fra en dyrkningsskål, våre innledende forsøk på LCM med nevroner mislykkede fordi de er fast festet til de belagte retter. For å overkomme dette problemet, differensiert vi NPCer on lysbilder med PEN membran inserts belagt med poly-L-lysin og mus laminin. Raset ble plassert inne i en 100 mm cellekultur fatet (Figur 4A). Arrangementer av PEN membran sklie og LCM caps er vist i figur 4B. Kulturer ble farget med HistoGen flekken (Arcturus) for å visualisere cellene (Figur 4C). Raset ble plassert i mikroskopet i Arcturus Veritas instrument. Nervecellene til å bli fanget ble merket med tegneverktøy (Figur 4D). CapSure HS Caps ble plassert på PEN-membran. Ved hjelp av en kombinasjon av UV-laserskjæring, og IR-laser fangst, ble de merkede områder samles på lokket. Den fanget nevroner er vist på hetten ved lave (Figur 4F) og høy (figur 4F) forstørrelse.
Figur 1.Utvidelse av menneskelige NPCer. A. NPC ble dyrket i suspensjon i T75-kolber som neurospheres. B. Når neurospheres nådd størrelse på 300-500 mikrometer, ble de overført til 15 ml rør og sentrifugert ved 1000 rpm i 5 min. C. Supernatanten ble kastet, og cellepelleten i 200 ul medium ble overført til Eppendorf-rør og triturert. D. neurospheres klar til å deles er vist. E. brutte neurospheres etter triturering er vist.
Figur 2. Differensiering av menneskelige NPCer. A. neurospheres ble brutt av utgnidning og kultivert i fire dager for å generere nye neurospheres. B. Fire daggamle neurospheres ble sådd i retter belagt med poly-L-lysin og mus laminin. C. differentiasjon av NPC ble observert i nærvær av NGF, BDNF, DBC og retinsyre i tre dager etter såing. D. Neuron-rik kultur ble oppnådd etter to uker. E. NPC differensiert i astrocytter i områder med lav tetthet. F. NPC differensiert i et astrocyte-rik kultur i nærvær av CNTF (10 ng / ml) og i fravær av NGF, BDNF, DBC og retinsyre.
Figur 3. Neuronal og astrocyte markører i differensierte menneskelige NPCer. NPCer differensiert i to uker ble fikset og dual immunostained for angitt mål med polyklonale og monoklonale antistoffer, etterfulgt av eksponering for kanin og mus sekundære antistoffer knyttet til Cy3 (rød) og FITC (grønn) hhv. Følgende nevrale markører ble oppdaget: A. Neun og synapsin.B. acetylkolinesterasehemmere (AChE) og synaptophysin. C. BDNF og GAP43. I tillegg ble følgende astrocyte markører oppdaget: D. STAT3 og GFAP.
Figur 4. Laser fangst microdissection av nerveceller. A. NPCer ble differensiert på en PEN membran lysbilde belagt med poly-L-lysin og mus laminin. Raset ble plassert inne i en 100 mm cellekultur parabolen. B. arrangementer av PEN membran lysbilde og LCM cap i Arcturus Veritas instrumentet er vist. C. Kulturer ble farget med HistoGen flekken (Arcturus) for å visualisere cellene. D. nevroner å bli fanget ble merket med tegneverktøy. Den fanget nevroner er vist på hetten ved lave (E) og høy (F) Magnifiseringen. Klikk her for å se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver i denne studien et nevron-rik cellekulturmodell ved differensiering av selvfornyende menneskelige neuroprogenitor celler og en metode for å isolere en ren populasjon av nevroner med laser capture microdissection. Vi har brukt en kombinasjon av NGF, BDNF, DBC og retinsyre for nevronal differensiering av NPCer. DBC brukes til å aktivere CREB, en transkripsjonsfaktor som forbedrer neurogenesis 12. Retinsyre induserer cellesyklus exit og reduserer glial befolkningen 13. Metoden som beskrives i denne studien omfatter modifikasjoner enn vår forrige rapport 14. Vi hadde tidligere brukt det skritt å triturating de neurospheres til en enkelt celle suspensjon og deretter seeding det i belagt retter. Dette kan føre til ineffektiv neuronal differensiering i områder med lav tetthet (fig. 2E). Vi har nå innført prosedyren for seeding fire-dagers gamle små neurospheres (Figur 1B) for å sikre kontakt mellom differentiaskaps nevroner (figur 1C). I tillegg er differensiering supplement (Stem Cell Technologies) erstattet med B27 supplement (Invitrogen), 4-5 dager etter såing. Den nåværende metoden gir 80-90% nevroner konsekvent. Disse nervecellene med et omfattende nettverk av prosesser kan opprettholdes i kultur i 2-3 måneder, en klar fordel over nervemodellen som følge av differensiering av menneskelige neuroblastom cellelinjer. Farging for flere nevrale markører inkludert Neun, synapsin, acetylkolinesterase, synaptophysin og GAP43 ble observert med differensierte NPCer (figur 3). STAT3 og GFAP, ble markører av astrocytter også påvist i en liten populasjon av celler. Ved å øke konsentrasjonen av retinsyre på 2-5 pM, kan astrocyte populasjonen bli ytterligere redusert. Imidlertid kan slike kulturer ikke bli opprettholdt for en lengre periode, fordi gliaceller støtter neuronal overlevelse ved sekresjon av vekstfaktorer. Vi har observert at deter ønskelig å øke konsentrasjonen retinoic 3-5 dager før utføring av forsøkene.
Den heterogene natur differensierte nevroner gir utfordringer i forhold til å bestemme celletypespesifikke genuttrykk profilering. Vi har derfor optimalisert betingelsene for LCM av dyrkede neuroner (figur 4). I den aktuelle studien, vi differensiert NPCer på lysbilder med PEN membran inserts og utført LCM fordi denne teknikken present vanskeligheter med nerveceller dyrket på vanlige cellekultur retter som de er godt festet. Selv om målene for LCM kan bli møtt av immunhistokjemisk analyse, tilbyr LCM flere fordeler, inkludert muligheten til å forsterke signalet på RNA-nivå, utføre multiplex analyse, og nøyaktig kvantifisering. Når det kombineres med microarray, tillater LCM uttrykk analyse av tusenvis av gener i utvalgte celletyper 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter å fortolle.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Merit gjennomgang stipend (NEUD-004-07F) fra Veterans Administration (SP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
- Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
- Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
- Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
- Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
- Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
- Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
- Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60 (2011).
- Dworkin, S., Mantamadiotis, T. Targeting CREB signalling in neurogenesis. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).
- Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
- Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
- Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).
