Summary
Células neuroprogenitoras Humanos (NPCs) foram expandidas em condições de proliferação. NPCs foram diferenciadas em culturas ricas em neurônios na presença de uma combinação de neurotrofinas. Marcadores neuronais foram detectadas pela técnica de imunofluorescência. Para isolar uma população pura de neurônios, NPCs foram diferenciadas em PEN lâminas de membrana e captura de microdissecção a laser foi realizada.
Abstract
Células neuroprogenitoras (NPCs) isoladas a partir do cérebro de feto humano foram expandidas sob condições proliferativas em presença do factor de crescimento epidérmico (EGF) e factor de crescimento de fibroblastos (FGF), para proporcionar um fornecimento abundante de células. NPCs foram diferenciadas na presença de uma nova combinação de factor de crescimento do nervo (NGF), factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), dibutiril AMPc (DBC) e ácido retinóico em pratos revestidos com poli-L-lisina e laminina rato para obter neurónio ricas culturas. NPCs também foram diferenciadas na ausência de neurotrofinas, a DBC e ácido retinóico e na presença do factor neurotrófico ciliar (CNTF) para produzir culturas ricas em astrócitos. NPCs diferenciadas foram caracterizadas por coloração de imunofluorescência para um painel de marcadores neuronais incluindo NeuN, sinapsina, acetilcolinesterase, sinaptofisina e GAP43. Proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e STAT3, marcadores de astrócitos, foram detectados em 10-15% dos NPCs diferenciadas. Para facilitarCaracterização molecular específicos do tipo de célula, a captura de microdissecção a laser foi realizada para isolar neurónios cultivados em naftalato de polietileno (PEN) de lâminas de membrana. Os métodos descritos neste estudo fornecem ferramentas valiosas para avançar nossa compreensão do mecanismo molecular da neurodegeneração.
Introduction
Neurogénese longo da vida, é conhecido por ocorrer na zona subventricular dos ventrículos laterais e na camada subgranular do giro dentado do cérebro de mamíferos adultos 1. Células neuroprogenitoras (NPCs) que se originam a partir destas regiões são células multipotentes que podem se diferenciar em neurônios, astrócitos e oligodendrócitos 2. NPCs gerado interesse devido ao seu potencial para ser transplantadas em pacientes com várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, acidente vascular cerebral e doença de Alzheimer (AD) 3. Estudos com NPCs geralmente centrada sobre este ângulo de transplante, mas o potencial de neurónios NPC-derivados como um modelo de cultura de células para determinar o mecanismo de neurodegeneração não foi totalmente explorada. Estudos anteriores têm geralmente utilizados os neurónios pós-mitóticos, isolado a partir de tecidos do cérebro de roedores, que devem ser isoladas para cada experiência em que não sejamauto-renovação. Embora as linhas celulares de neuroblastoma humano, incluindo SH-SY5Y e células SK-N-MC pode ser expandido, elas não têm as características de neurónios primários. NPCs humanos, por outro lado, oferecem vantagens porque eles podem ser expandidos para várias passagens e podem ser diferenciados para gerar uma população de células com as características primárias de neurónios 4,5. No presente estudo, descrevemos um novo protocolo de diferenciação para se obter uma população rica em neurônio consistente de NPCs disponíveis comercialmente isoladas de cérebro fetal humano. Porque essas culturas contêm uma pequena porcentagem de células gliais, precisamos de métodos adicionais para isolar uma população pura de neurônios para caracterização molecular. Captura laser microdissecção (LCM) é um nova técnica pela qual uma população homogénea de células a partir de uma secção de tecido podem ser capturadas selectivamente para análise da expressão do gene 6. O cérebro é um tecido heterogêneo composto por neurônios, células gliais e outros ty celularpes. LCM foi utilizado para determinar a expressão de genes específicos de neurónios analisa 7-10. Temos realizado anteriormente LCM de neurônios do hipocampo de AD (Tg2576) seções do cérebro do rato para mostrar a diminuição da expressão de proteína de ligação elemento de resposta ao AMP cíclico (CREB) e BDNF especificamente nos neurônios do hipocampo 11. No presente estudo, descrevemos os procedimentos para a expansão dos NPCs humanos, a diferenciação neuronal, coloração de imunofluorescência para marcadores neuronais e LCM para o isolamento de neurônios cultivados em PEN lâminas de membrana.
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Protocol
1. Expansão dos NPCs Humanos (Figura 1)
- Reviver o lote congelado de NPCs humanos a partir de cérebro fetal (Lonza, Walkersville, MD, EUA) e cultura deles em suspensão em frascos T-75 como neuroesferas (Figura 1A), em meio neurobasal contendo suplementos de proliferação, EGF (10 ng / ml) e FGF (10 ng / ml).
- Após 3 dias em cultura, as neuroesferas transferir para um tubo de 15 ml e centrifugar a 500 rpm durante 5 min.
- Descartar o sobrenadante deixando ~ 100 ul de gama média acima do pellet celular e transferir para um tubo Eppendorf. A pelota de 100 células mL é suficiente para dividir em dois T-75 frascos. Se menos, reduzir o número de garrafas que as células não conseguem proliferar neuroprogenitoras se dividir fina.
- Tritura-se o sedimento com 200 ul de ponta 50x, mantendo a ponta 200 ul contra o fundo do tubo. Divida a suspensão de células igualmente em duas partes e adicioná-los a 2 T-75 frascos (1-2 split), um para a continuidadeexpansão e outro para a diferenciação.
- Continuar a cultura das células neuroprogenitoras para expansão (primeiro balão), alterando o meio cada 4-5 dias, até que as neuroesferas atingir o seu tamanho original de 300-500 mM. Mude meio por centrifugação (500 rpm, 5 min), descarte o meio de idade e adicionar novo meio.
2. Diferenciação de NPCs Humano em uma Cultura Neuron-ricos (Figura 2)
- Para a diferenciação das células em cultura neuroprogenitoras rico neurónio, colocar uma única lamela para cada poço de uma placa de 24 poços e com revestimento de 100 ug / ml de poli-L-lisina através da adição de 500 uL em cada poço. Incubar os pratos durante 30 min a RT.
- Aspirar o poli-L-lisina solução e lave a placa com água estéril.
- Em seguida, revestir as cavidades da placa com 500 ul de 5 ug / ml de laminina rato e incubar durante 30 min. Após a incubação, lavar os poços com PBS.
- 4 dias após a splitting as células (passo 1.4), transferir os pequenos neuroesferas do frasco rotulado "para a diferenciação 'nos pratos revestidos, a uma densidade de ~ 500 neuroesferas por poço de uma placa de 24 poços.
- Depois de 6 horas, quando as neuroesferas anexar ao prato, remover o meio de proliferação e diferenciação adicionar meio consistindo em meio neurobasal, suplemento B27, o NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), a DBC (100 mM), e ácido retinóico (2 uM).
3. Coloração de imunofluorescência diferenciadas NPCs (Figura 3)
- Após cultura de células neuroprogenitoras em meio a diferenciação neuronal durante duas semanas, uma cultura rica em neurônio é obtida. Lavar os neurónios uma vez com PBS e, em seguida, corrigi-los em paraformaldeído a 4% durante 30 min. Uma vez fixo, lavar as células três vezes com PBS.
- Incubar as células com tampão de permeabilização (5% de BSA e 0,2% de Triton X-100 em PBS) à temperatura ambiente durante 60 min.
- Incubar os pratos O / N a 4 ° C ind agitador com a seguinte combinação de anticorpos monoclonais e policlonais em 3% de BSA em PBS: NeuN (1:250) e sinapsina (1:250); acetilcolinesterase (1:500) e sinaptofisina (1:250); BDNF (1 : 500) e GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) e GFAP (1:1.000).
- Lavar as lamelas três vezes com PBS e depois incubar com anti-coelho-Cy3 e anticorpos secundários, anti-ratinho FITC no escuro à TA durante 90 min. A seguir à incubação, as lamelas lavar três vezes com PBS.
- Coloque 10 ml de meio de montagem sobre uma lâmina de vidro, tirar a lamela da placa de cultura com uma pinça, e colocá-lo de cabeça para baixo no meio de montagem. Delicadamente, limpe qualquer meio de montagem excesso e selar as bordas com unha polonês.
- Examine os neurônios imunomarcadas em um microscópio de fluorescência.
4. Captura Laser Microdissecção de neurônios (Figura 4)
- Diferenciar NPCs em uma cultura rica em neurônios em PEN slides membranas revestidos com poli-L-lisina e laminina rato seguindo os procedimentos descritos para a Figura 2.
- Executar todas as etapas subseqüentes em condições RNase.
- Mancha as culturas usando HistoGene Stain (Arcturus) para visualizar as células.
- Encontrar as áreas de populações neuronais puros desprovidos de astrócitos, utilizando a imagem de mapa de estrada de todo o slide com o sistema Veritas LCM. Marque os neurônios usando as ferramentas de desenho.
- Realizar captura a laser destas áreas utilizando precisão e automação controlado por computador num processo de dois passos. Primeiro, IR (infravermelho) é acionado em vários pontos com um ajuste de potência do laser de 70 mW e um pulso de 2.500 ms para obter a membrana anexar ao cap. Em seguida, a área marcada é extirpado usando uma ferramenta de corte UV para um nível baixo nível de 10 mV.
- Combinação destes processos de captura selectivamente as zonas marcadas a partir da membrana para PEN CapSure LCM macro cápsulas. Quando a tampa é levantada, a membrana com o neurons adere à tampa.
- Isolar o RNA total a partir de amostras de LCM, utilizando um kit de isolamento de RNA PicoPure (Arcturus) e trata-se com ADNase.
- Amplificar o ARN isolado utilizando o kit de amplificação de RNA RiboAMP seguindo as instruções do kit.
- Realizar a análise em tempo real de RT-PCR utilizando sondas TaqMan para detectar neurofilamento humano de cadeia pesada (hNFHc).
Abreviações:
AD, doença de Alzheimer, o BDNF, o factor neurotrófico derivado do cérebro, CREB, cíclico proteína de ligação de elemento de resposta a AMP; DBC, dibutiril AMP cíclico; EGF, factor de crescimento epidérmico; FGF, factor de crescimento de fibroblastos; GFAP, proteína ácida fibrilar glial, LCM, laser capturar microdissection; NGF, fator de crescimento do nervo; NPC, neuroprogenitoras célula; PEN, naftalato de polietileno.
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Representative Results
Expansão dos NPCs (Figura 1)
Quando neuroesferas são quebradas até uma suspensão de células individuais por meio de trituração, a ponta da pipeta deve tocar no fundo do tubo, de modo que existe uma certa resistência, quando a suspensão é pipetado para cima e para baixo. O número de vezes de trituração vai variar entre os indivíduos e tem de ser decidido, por tentativa e erro, examinando a suspensão de células resultantes com um microscópio. É fundamental para proporcionar densidade suficiente de suspensão de células, porque a proliferação será em um ritmo mais rápido do que os NPCs entrar em contato próximo. Se NPCs não crescem, a densidade de células deve ser aumentada pela redução do número de frascos. Temos sido capazes de expandir as neurospheres para até 10-15 passagens. Assim fornecimento abundante de NPCs humanos podem ser gerados, reduzindo o uso de tecido fetal humano. Para o abastecimento contínuo de NPCs e neurônios, é desejável para expandi-los, inicialmente, por 3-4 passagens e, posteriormente,, Metade dos NPCs pode ser expandido como neuroesferas e a outra metade pode ser diferenciado por experiências em curso. Alternativamente, NPCs também pode ser expandida para mais passagens, congelados em nitrogênio líquido, como no caso de linhas de células para gerar maior oferta de ações, e reviveu quando necessário. É também desejável efectuar experiências com os neurónios derivados de diferentes lotes de NPCs.
Neuronal Diferenciação de NPCs (Figura 2)
NPCs são células multipotentes e podem ser diferenciados em neurónios, astrócitos e oligodendrócitos, dependendo das condições de cultura. Nosso protocolo diferenciação envolvido sementeira de 4 dias de idade neuroesferas em pratos revestidos (Figura 2A). Observou-se que é essencial para semear uma densidade suficiente de modo a que as neuroesferas neurónios diferenciados, distribuídos em torno e formar uma rede densa de processos neuronais. Imagens após 1 (Figura 2B) e 4 dias (Fig.ure 2C) da semeadura são mostrados. Culturas ricas em Neuron rendimento de 80-90% os neurónios e os astrócitos 10-15%, foram obtidos após a diferenciação de NPCs, na presença de uma combinação de NGF, BDNF, a DBC e ácido retinóico, durante duas semanas (Figura 2D). Ao melhor de nosso conhecimento, o protocolo descrito neste estudo para a diferenciação neuronal não foi relatado anteriormente por outros. Em áreas de baixa densidade, NPCs diferenciado em astrócitos (Figura 2E). Para obter uma cultura rico em astrócitos, NPCs podem ser cultivadas na presença de CNTF (10 ng / ml) e na ausência de NGF, BDNF, a DBC e ácido retinóico. Assim, a composição neurônio-astrócitos podem ser manipulados durante a diferenciação de acordo com o objetivo do experimento.
Caracterização de neurónios diferenciados (Figura 3)
Para caracterizar ainda mais esses NPCs diferenciados, foi realizada dupla marcação para marcadores neuronais wom policlonal e anticorpos monoclonais, seguido de exposição a anticorpos secundários de coelho e de ratinho ligados a Cy3 (vermelho) e FITC (verde), respectivamente. Foram detectadas as seguintes marcadores neuronais: Figura 3A:. NeuN e sinapsina Figura 3B:. Acetilcolinesterase (Ache) e synaptophysin Figura 3C: BDNF e GAP43. Assim, as NPCs diferenciadas têm as características de neurónios primários. Além disso, os marcadores de astrócitos GFAP e STAT3 foram detectados numa pequena população de células (Figura 3A). Portanto, são necessários métodos adicionais para a análise da expressão de genes específicos de neurónios.
Captura Laser Microdissecção (LCM) de neurônios (Figura 4)
Embora LCM pode ser usado para isolamento de células a partir de uma placa de cultura, as nossas tentativas iniciais de LCM com neurónios falharam porque eles estão firmemente ligados às placas revestidas. Para superar este problema, o diferenciado NPCsn slides com PEN inserções de membrana revestidas com poli-L-lisina e laminina rato. A lâmina foi colocada dentro de uma cultura de células de 100 milímetros prato (Figura 4A). Os arranjos do diapositivo membrana PEN e tampões LCM são apresentados na Figura 4B. As culturas foram manchadas com HistoGen mancha (Arcturus) para visualizar as células (Figura 4C). A lâmina foi colocada no microscópio no instrumento Arcturus Veritas. Os neurônios a serem capturadas foram marcadas com ferramentas de desenho (Figura 4D). Caps CapSure SH foram colocados na membrana PEN. Usando uma combinação de corte a laser UV e IR captura laser, as áreas marcadas foram coletados no tampão. Os neurónios capturados são mostrados na tampa de baixo (Figura 4F) e alta (Figura 4F) de ampliação.
Figura 1.Expansão dos NPCs humanos. A. NPCs foram cultivadas em suspensão em frascos de T75 como neuroesferas. B. Quando as neuroesferas atingiram o tamanho de 300-500 mM, foram transferidas para tubos de 15 ml e centrifugado a 1000 rpm durante 5 min. C. O sobrenadante foi descartado e a pelete de células em 200 ul de meio foi transferido para tubos Eppendorf e triturado. D. neuroesferas pronto para ser dividido são mostrados. E. neuroesferas quebrados seguintes trituração são mostrados.
Figura 2. Diferenciação de NPCs humanos. A. As neuroesferas foram quebradas por meio de trituração e cultivadas durante quatro dias para gerar novas neuroesferas. B. Quatro neuroesferas dias de idade foram cultivadas em placas revestidas com poli-L-lisina e laminina rato. C. Differentiação de NPCs foi observada na presença de NGF, BDNF, a DBC e ácido retinóico em três dias após a semeadura. cultura D. Neuron-rica foi obtida depois de duas semanas. E. NPCs diferenciadas em astrócitos em áreas de baixa densidade. F. NPCs diferenciadas numa cultura rico em astrócitos na presença de CNTF (10 ng / ml) e na ausência de NGF, BDNF, a DBC e ácido retinóico.
Figura 3. Neuronal e marcadores de astrócitos em NPCs humanos diferenciados. NPCs diferenciadas para duas semanas foram fixadas e dupla imunocoradas para alvos indicados com anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais, seguido de exposição a anticorpos secundários de coelho e de ratinho ligados a Cy3 (vermelho) e FITC (verde), respectivamente. Foram detectadas as seguintes marcadores neuronais: A. NeuN e sinapsina.B. acetilcolinesterase (AChE) e synaptophysin. C. BDNF e GAP43. Além disso, foram detectados os seguintes marcadores de astrócitos: D. STAT3 e GFAP.
Figura 4. Captura a laser microdissecção dos neurônios. A. NPCs foram diferenciadas em um slide membrana PEN revestidas com poli L-lisina e mouse laminina. A lâmina foi colocada dentro de um 100 milímetros de cultura de células prato. B. Os arranjos de slides membrana PEN e tampa LCM no instrumento Arcturus Veritas são mostrados. C. As culturas foram manchadas com HistoGen mancha (Arcturus) para visualizar as células. D. A neurônios a serem capturadas foram marcadas com ferramentas de desenho. Os neurónios capturados são mostrados na tampa em baixo (E) e alta (F) magnificação. Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
Nós descrevemos neste estudo um modelo de cultura de células ricas em neurônio pela diferenciação de células neuroprogenitoras humanos auto-renovação e um método para isolar uma população pura de neurônios por captura de microdissecção a laser. Nós usamos uma combinação de NGF, BDNF, DBC e ácido retinóico para a diferenciação neuronal de NPCs. DBC é usada para ativar CREB, um fator de transcrição que aumenta a neurogênese 12. O ácido retinóico induz saída do ciclo celular e reduz a população da glia 13. O método descrito neste estudo incorpora modificações mais nosso relatório anterior 14. Nós já havia utilizado a etapa de trituração dos neurospheres a uma suspensão única célula e, em seguida, semeando-lo em pratos revestidos. Isto pode levar a diferenciação neuronal ineficiente em áreas de baixa densidade (Figura 2E). Temos agora introduzido o procedimento de semeadura de quatro dias de idade neuroesferas pequenos (Figura 1B), para assegurar um contacto entre diferenneurónios ting (Figura 1C). Além disso, o suplemento de diferenciação (Stem Cell Technologies) é substituído com suplemento B27 (Invitrogen), 4-5 dias após a sementeira. O método atual produz 80-90% neurônios de forma consistente. Estes neurônios com uma extensa rede de processos podem ser mantidas em cultura durante 2-3 meses, uma vantagem distinta sobre o modelo neuronal resultante de diferenciação de linhas de células de neuroblastoma humano. Imunocoloração para vários marcadores neuronais incluindo NeuN, sinapsina, acetilcolinesterase, sinaptofisina e GAP43 foram observados com NPCs diferenciadas (Figura 3). STAT3 e GFAP, marcadores de astrócitos foram também detectadas em uma pequena população de células. Aumentando a concentração de ácido retinóico de 2-5 fiM, a população dos astrócitos podem ser ainda mais reduzidos. No entanto, essas culturas não pode ser mantida durante um longo tempo, pois as células gliais suporta a sobrevivência neuronal por secreção de factores de crescimento. Temos observado queÉ desejável para aumentar a concentração retinóico 3-5 dias antes da realização das experiências.
A heterogeneidade dos neurônios diferenciados apresenta desafios em termos de determinação de células de tipo específico, perfil de expressão gênica. Portanto, nós otimizamos as condições para a LCM de neurônios cultivados (Figura 4). No estudo atual, nós diferenciado NPCs em slides com caneta inserções de membrana e LCM executada porque esta técnica apresenta dificuldades com neurônios cultivados em pratos de cultura de células regulares como eles são bem encaixada. Embora os objectivos de GCV podem ser satisfeitas por meio de análise imuno-histoquímica, LCM oferece várias vantagens, incluindo a capacidade para amplificar o sinal ao nível do ARN, realizar a análise multiplex, e quantificação precisas. Quando combinado com o microarray, LCM permite a análise de milhares de genes em tipos de células seleccionadas 15 expressão.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse a declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por Mérito comentário concessão (NEUD-004-07F) da Administração de Veteranos (para SP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
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