Summary
Menselijke neuroprogenitor cellen (NPC) werden uitgebreid onder uitdijende omstandigheden. NPCs werden gedifferentieerd in neuron-rijke culturen in aanwezigheid van een combinatie van neurotrofinen. Neuronale merkers werden gedetecteerd door immunofluorescentie kleuring. Om een zuivere populatie van neuronen te isoleren, werden NPCs gedifferentieerd PEN membraan glijbanen en lasermicrodissectie werd uitgevoerd.
Abstract
Neuroprogenitor cellen (NPC) geïsoleerd uit de humane foetale hersenen werden onder proliferatieve aandoeningen uitgebreid in de aanwezigheid van epidermale groeifactor (EGF) en fibroblast groeifactor (FGF) een overvloedige toevoer van cellen. NPCs werden gedifferentieerd in de aanwezigheid van een nieuwe combinatie van zenuwgroeifactor (NGF), van hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) en retinoïnezuur op de vaat bekleed met poly-L-lysine en muis laminine te verkrijgen neuron -rijke culturen. NPCs werden gedifferentieerd in afwezigheid van neurotrofinen, DBC en retinoïnezuur en in aanwezigheid van ciliaire neurotrofe factor (CNTF) naar astrocyt-rijke culturen verkregen. Gedifferentieerde NPCs werden gekenmerkt door immunofluorescentiekleuring voor een panel van neuronale markers inclusief NeuN, synapsine, acetylcholinesterase, synaptofysine en GAP43. Gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) en STAT3, astrocyten markers, werden gedetecteerd in 10-15% van de gedifferentieerde NPCs. Ter vergemakkelijkingceltype specifieke moleculaire karakterisering, werd lasermicrodissectie uitgevoerd om neuronen gekweekt op polyethyleennaftalaat (PEN) membraan dia's te isoleren. De in deze studie beschreven methoden leveren waardevolle instrumenten om ons begrip van de moleculaire mechanismen van neurodegeneratie te bevorderen.
Introduction
Permanente neurogenese is gekend om in subventriculaire zone van de laterale ventrikels en de subgranulaire laag van de dentate gyrus van de volwassen zoogdierhersenen 1. Neuroprogenitor cellen (NPC's) die afkomstig zijn uit deze regio's zijn multipotente cellen die kunnen differentiëren tot neuronen, astrocyten en oligodendrocyten 2. NPCs hebben gegenereerd belang omdat zij kunnen worden getransplanteerd in patiënten met diverse neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson, amyotrofische laterale sclerose, beroerte en ziekte (AD) 3 Alzheimer. Onderzoeken met NPC het algemeen gericht op deze transplantatie hoek maar de mogelijkheden van NPC-afgeleide neuronen als celcultuurmodel het mechanisme van neurodegeneratie bepalen niet volledig benut. Eerdere studies hebben algemeen gebruikt na mitotische neuronen geïsoleerd uit inproefdierhersenen weefsels die moeten worden geïsoleerd voor elk experiment zij nietzelfvernieuwende. Hoewel humane neuroblastoma cellijnen zoals SH-SY5Y en SK-N-MC cellen kunnen worden geëxpandeerd, hebben zij niet de kenmerken van primaire neuronen. Menselijke NPCs, anderzijds, hebben zowel voordelen omdat ze kunnen worden uitgebreid voor meerdere doorgangen en kunnen worden gedifferentieerd om een celpopulatie genereren met de kenmerken van primaire neuronen 4,5. In de huidige studie, een nieuwe differentiatie protocol beschrijven we een consistente neuron-rijke bevolking te verkrijgen uit commercieel beschikbare NPC's geïsoleerd uit menselijke foetale hersenen. Omdat deze kweken bevatten een klein percentage van gliacellen, zijn ook andere methoden om een zuivere populatie van neuronen voor moleculaire karakterisering te isoleren. Laser capture microdissectie (LCM) is een nieuwe techniek waarbij een homogene populatie van cellen van een weefselsectie selectief kan worden vastgelegd voor genexpressieanalyse 6. Het brein is een heterogeen weefsel dat bestaat uit neuronen, glia en andere mobiele types. LCM is gebruikt om neuron-specifieke genexpressie te bepalen analyses 7-10. We hebben eerder uitgevoerd LCM van hippocampale neuronen uit AD (Tg2576) muis hersenen secties om verminderde expressie van cyclisch AMP respons element binding protein (CREB) en BDNF blijkt specifiek in de hippocampus neuronen 11. In deze studie beschrijven we procedures voor de uitbreiding van menselijke NPCs, neuronale differentiatie, immunofluorescentie kleuring voor neuronale merkers en LCM voor het isoleren van neuronen gekweekt op objectglaasjes PEN membraan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Uitbreiding van Human NPCs (figuur 1)
- Herleven de bevroren voorraad menselijk NPCs uit foetale hersenen (Lonza, Walkersville, MD, USA) en cultuur ze in suspensie in de T-75 kolven als neurosferen (figuur 1A) in Neurobasal medium dat proliferatie supplementen, EGF (10 ng / ml) en FGF (10 ng / ml).
- Na 3 dagen kweken dragen de neurosferen een 15 ml buis en centrifugeer bij 500 rpm gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant met achterlating van ~ 100 ul medium boven de cel pellet en zetten in een Eppendorf buis. Een 100 pl celpellet voldoende te splitsen in 2 T-75 kolven. Indien minder, vermindering van het aantal flessen als neuroprogenitor cellen niet te woekeren als splitsen dun.
- Vermaal de pellet met 200 ul tip 50x terwijl de 200 ul tip tegen de bodem van de buis. Verdeel de celsuspensie even in twee delen en voeg ze toe aan 2 T-75 kolven (1-2 split), een voor voortgezetexpansie en andere voor differentiatie.
- Ga door met de cultuur van de neuroprogenitor cellen voor uitbreiding (eerste fles) door het veranderen van het medium om de 4-5 dagen tot de neurosferen bereiken hun oorspronkelijke formaat van 300-500 micrometer. Verander medium door centrifugeren (500 tpm, 5 min), gooi de oude medium en voeg nieuwe medium.
2. Differentiatie van Human NPCs in een Neuron-rijke cultuur (figuur 2)
- Voor differentiatie van neuroprogenitor cellen in een neuron rijke cultuur, plaats een enkel dekglaasje in elk putje van een 24-wells plaat en jas met 100 ug / ml van poly-L-lysine door het toevoegen van 500 pi in elk putje. Incubeer de gerechten voor 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Zuig het poly-L-lysine-oplossing en spoel de plaat met steriel water.
- Vervolgens vacht de putjes van de plaat met 500 ui 5 ug / ml muis laminine en incubeer gedurende 30 minuten. Na incubatie was de putjes met PBS.
- 4 dagen na splitting van de cellen (stap 1.4), breng de kleine neurosferen in de kolf de vermelding "For differentiatie 'in de gecoate gerechten in een dichtheid van ~ 500 neurosferen per putje van een 24-wells plaat.
- Na 6 uur, als de neurosferen hechten aan de schaal, verwijdert de proliferatie medium en voeg differentiatiemedium bestaande uit Neurobasal medium, B27 supplement, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), en retinoïnezuur (2 uM).
3. Immunofluorescentiekleuring van gedifferentieerde NPCs (figuur 3)
- Na kweek van neuroprogenitor cellen in neuronale differentiatie medium voor twee weken, is een neuron-rijke cultuur verkregen. Spoel de neuronen keer in PBS en vervolgens oplossen in 4% paraformaldehyde gedurende 30 minuten. Eenmaal vastgesteld, spoel de cellen driemaal met PBS.
- Incubeer de cellen met permeabilisatie buffer (5% BSA en 0,2% Triton X-100 in PBS) bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten.
- Incubeer de gerechten O / N bij 4 ° C ina shaker met de volgende combinatie van polyklonale en monoklonale antilichamen in 3% BSA in PBS: NeuN (1:250) en synapsin (1:250); acetyl cholinesterase (1:500) en synaptofysine (1:250); BDNF (1 : 500) en GAP43 (1:250); STAT3 (1:500) en GFAP (1:1000).
- Was de dekglaasjes driemaal met PBS en vervolgens geïncubeerd ze met anti-konijnen-Cy3 en anti-muis-FITC secundaire antilichamen bij kamertemperatuur in het donker gedurende 90 minuten. Na incubatie was de dekglaasjes driemaal met PBS.
- Plaats 10 ul van montage medium op een glasplaatje, neem de dekglaasje van de cultuur schotel met een tang, en plaats het ondersteboven op de montage medium. Zachtjes, veeg de overtollige montage medium en sluit de randen met nagellak.
- Onderzoek de immunostained neuronen in een fluorescentiemicroscoop.
4. Lasermicrodissectie van neuronen (figuur 4)
- Differentiëren NPCs in een neuron-rijke cultuur op PEN membraan dias bekleed met poly-L-lysine en muis laminine volgens de methode beschreven bij figuur 2 procedures.
- Voer alle daaropvolgende stappen onder RNAse-vrije omstandigheden.
- Vlekken op de culturen met behulp HistoGene Stain (Arcturus) om de cellen te visualiseren.
- Zoek het gebied van pure neuronale populaties verstoken van astrocyten met behulp van de routekaart beeld van de volledige dia met de Veritas LCM systeem. Markeer de neuronen met behulp van de tekengereedschappen.
- Voer laser capture van deze gebieden met computergestuurde precisie en automatisering in twee stappen. Eerste, IR (infrarood) wordt afgevuurd op meerdere plekken met een laservermogen instelling van 70 mW en een puls van 2500 usee om het membraan hechten aan de dop. Vervolgens wordt het gemarkeerde gebied uitgesneden met UV snijgereedschap op een laag niveau-instelling van 10 mV.
- Combinatie van deze processen selectief vangt de gemarkeerde gebieden van het PEN membraan op CapSure LCM macro caps. Wanneer de kap wordt opgetild, de membraan met de neurons houdt zich aan de dop.
- Isoleer totaal RNA van LCM monsters met behulp van een PicoPure RNA isolatie kit (Arcturus) en behandelen met DNase.
- Versterken de geïsoleerde RNA met behulp RiboAMP RNA amplificatie kit volgens de instructies van de kit.
- Voer Real time RT-PCR-analyse met TaqMan probes menselijk neurofilament zware keten (hNFHc) detecteren.
Afkortingen:
AD, ziekte van Alzheimer, BDNF, brain-derived neurotrophic factor, CREB, cyclisch AMP respons element bindend eiwit, DBC, dibutyryl cyclisch AMP, EGF, epidermale groeifactor, FGF, fibroblast groeifactor, GFAP, glia fibrillair zuur eiwit, LCM, laser vangen microdissection, NGF, Zenuwgroeifactor, NPC, neuroprogenitor cel, PEN, polyethyleennaftalaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uitbreiding van NPCs (figuur 1)
Wanneer neurospheres worden afgebroken om een enkele celsuspensie door trituratie, de pipetpunt moet de bodem van de buis raakt zodat er enige weerstand wanneer de suspensie op en neer gepipetteerd. Het aantal malen trituratie variëren tussen individuen en moet worden beslist proefondervindelijk door onderzoek van de resulterende celsuspensie onder een microscoop. Het is cruciaal om voldoende dichtheid celsuspensie verschaffen omdat de proliferatie zullen sneller wanneer de NPCs in nauw contact. Als NPCs niet groeien, dient de celdichtheid worden verhoogd door vermindering van het aantal kolven. We kunnen de neurospheres tot 10-15 passages breiden is. Aldus overvloedige aanbod van menselijke NPCs worden gegenereerd, waardoor het gebruik van menselijk foetaal weefsel. Voor de continuïteit van de levering van NPCs en neuronen, is het wenselijk om ze in eerste instantie uit te breiden voor 3-4 passages en vervolgensHelft van de NPCs kunnen worden uitgebreid neurosferen en de andere helft kan worden gedifferentieerd lopende experimenten. Alternatief kan NPCs ook worden uitgebreid voor meer doorgangen, in vloeibare stikstof ingevroren en bij cellijnen grotere hoeveelheid bestanden genereren en herleven wanneer nodig. Het is ook wenselijk om experimenten met neuronen afkomstig van verschillende batches van NPC.
Neuronale differentiatie van NPCs (figuur 2)
NPC zijn multipotente cellen en kan worden onderscheiden in neuronen, astrocyten of oligodendrocyten, afhankelijk van de kweekomstandigheden. Onze differentiatie protocol betrokken zaaien van 4 dagen oude neurosferen in gecoat gerechten (Figuur 2A). We vonden dat het essentieel is om voldoende dicht neurosferen zaad zodat de differentiërende neuronen verspreid over en vormen een dicht netwerk van neuronale processen. Beelden na 1 (Figuur 2B) en 4 dagen (Figure 2C) van zaaien worden getoond. Neuron-rijke culturen opbrengst 80-90% neuronen en astrocyten 10-15% werden verkregen na differentiatie van NPCs in aanwezigheid van een combinatie van NGF, BDNF, DBC en retinoïnezuur gedurende twee weken (figuur 2D). Aan het beste van onze kennis, de in deze studie voor de neuronale differentiatie beschreven protocol is niet eerder gemeld door anderen. In gebieden met een lage dichtheid, NPCs gedifferentieerd in astrocyten (figuur 2E). Om een astrocyt-rijke cultuur verkrijgen, kan NPCs worden gekweekt in de aanwezigheid van CNTF (10 ng / ml) en in afwezigheid van NGF, BDNF, DBC en retinoïnezuur. Dus de neuron-astrocyt samenstelling kan worden gemanipuleerd tijdens differentiatie afhankelijk van het doel van het experiment.
Karakterisering van gedifferentieerde neuronen (figuur 3)
Om verder te karakteriseren deze gedifferentieerde NPCs, voerden we dual immunostaining voor neuronale markers with polyklonale en monoklonale antilichamen, gevolgd door blootstelling aan konijn en muis secundaire antilichamen gekoppeld aan Cy3 (rood) en FITC (groen) respectievelijk. De volgende neuronale merkers werden ontdekt: Figuur 3A:. NeuN en synapsin Figuur 3B:. Acetyl cholinesterase (Ache) en synaptofysine figuur 3C: BDNF en GAP43. Aldus de gedifferentieerde NPCs de kenmerken van primaire neuronen. Bovendien astrocyten markers STAT3 en GFAP werden gedetecteerd in een kleine populatie van cellen (Figuur 3A). Daarom bijkomende zijn nodig voor een neuron-specifieke genexpressie analyse.
Laser capture microdissectie (LCM) van Neuronen (figuur 4)
Hoewel LCM kan worden gebruikt voor isolatie van cellen van een kweekschaal, onze aanvankelijke pogingen LCM met neuronen mislukt omdat zij stevig zijn bevestigd aan de beklede schotels. Om dit probleem te verhelpen, we onderscheiden NPCs on dia's met PEN membraan inzetstukken bekleed met poly-L-lysine en muis laminin. De glijbaan werd geplaatst in een 100 mm celkweekschaal (Figuur 4A). De regelingen van de PEN membraan glijbaan en LCM caps zijn weergegeven in figuur 4B. Kweken werden gekleurd met HistoGen kleuring (Arcturus) naar de cellen (Figuur 4C) visualiseren. De glijbaan werd in de microscoop geplaatst in het Arcturus Veritas instrument. De neuronen worden gevangen werden gemarkeerd met tekengereedschappen (Figuur 4D). CapSure HS Caps werden op de PEN membraan geplaatst. Met behulp van een combinatie van UV-lasersnijden en IR laser capture, werden de gemarkeerde gebieden verzameld op de dop. De gemaakte neuronen worden getoond op de dop bij lage (Figuur 4F) en hoge (Figuur 4F) vergroting.
Figuur 1.Uitbreiding van de menselijke NPCs. A. NPCs werden in suspensie gekweekt in T75 kolven als neurosferen. B. Bij de neurosferen tot de grootte van 300-500 urn, werden ze overgebracht naar 15 ml buisjes en gecentrifugeerd bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. C. Het supernatant werd verwijderd en de cel pellet in 200 ui medium werd overgebracht naar Eppendorf buizen en aangewreven. D. Neurosferen klaar om te worden gesplitst, worden weergegeven. E. Gebroken neurospheres volgende fijnwrijving worden getoond.
Figuur 2. Differentiatie van menselijke NPCs. A. Neurosferen werden gebroken door trituratie en gedurende vier dagen om nieuwe neurosferen te genereren. B. Vier dagen oude neurosferen werden gezaaid in gerechten bekleed met poly-L-lysine en muis laminine. C. differentiatietie NPCs werd waargenomen in aanwezigheid van NGF, BDNF, DBC en retinoïnezuur drie dagen na zaaien. D. Neuron-rijke kweek werd verkregen na twee weken. E. NPCs gedifferentieerd in astrocyten in gebieden van lage dichtheid. F. NPCs gedifferentieerd in een astrocyt-rijke cultuur in aanwezigheid van CNTF (10 ng / ml) en in afwezigheid van NGF, BDNF, DBC en retinoïnezuur.
Figuur 3. Neuronale en astrocyte merkers in gedifferentieerde menselijke NPCs. NPC gedifferentieerd gedurende twee weken werden vastgesteld en dubbele immunostained voor aangegeven doelen met polyklonale en monoklonale antilichamen, gevolgd door blootstelling aan konijn en muis secundaire antilichamen gekoppeld aan Cy3 (rood) en FITC (groen) respectievelijk. De volgende neuronale merkers werden ontdekt: A. NeuN en synapsin.B. Acetyl cholinesterase (AChE) en synaptofysine. C. BDNF en GAP43. Daarnaast werden de volgende astrocyten markers gedetecteerd: D. STAT3 en GFAP.
Figuur 4. Lasermicrodissectie van neuronen. A. NPCs werden onderscheiden op een PEN membraan glijbaan bekleed met poly-L lysine en muis laminin. De glijbaan werd geplaatst in een 100 mm celkweekschaal. B. De arrangementen van PEN membraan glijbaan en LCM cap in de Arcturus Veritas instrument worden weergegeven. C. Culturen werden gekleurd met HistoGen vlek (Arcturus) om de cellen te visualiseren. D. neuronen worden gevangen werden gemarkeerd met tekengereedschappen. De gemaakte neuronen worden getoond op de dop bij lage (E) en hoge (F) Magnicatie. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij beschrijven in deze studie een neuron-rijke celcultuurmodel door differentiatie van zelf-vernieuwing neuroprogenitor menselijke cellen en een methode om een zuivere populatie van neuronen isoleren laser capture microdissectie. We hebben een combinatie van NGF, BDNF, DBC en retinoïnezuur voor neuronale differentiatie van NPCs gebruikt. DBC wordt gebruikt om CREB een transcriptiefactor die neurogenese 12 verbetert activeren. Retinoïnezuur induceert celcyclus verlaten en vermindert de gliale bevolking 13. De methode beschreven in deze studie bevat wijzigingen in ons vorige rapport 14. Wij hadden eerder gebruikt de stap van tritureren de neurosferen een enkele celsuspensie en zaaien in beklede schotels. Dit kan leiden tot inefficiënt neuronale differentiatie in gebieden met lage dichtheid (figuur 2E). We hebben nu introduceerde de procedure van het zaaien vier dagen oude kleine neurosferen (Figuur 1B) de contacten tussen differentiatie zorgenting neuronen (figuur 1C). Bovendien is de differentiatie supplement (Stem Cell Technologies) vervangen B27 supplement (Invitrogen), 4-5 dagen na het zaaien. De huidige methode levert 80-90% neuronen consequent. Deze neuronen met een uitgebreid netwerk van processen in kweek worden gehandhaafd voor 2-3 maanden, een duidelijk voordeel boven de neuronale model gevolg van differentiatie van humane neuroblastoma cellijnen. Immunokleuring meerdere neuronale merkers zoals NeuN, synapsine, acetylcholinesterase, synaptofysine en GAP43 waargenomen met gedifferentieerde NPCs (figuur 3). STAT3 en GFAP, markers van astrocyten werden ook gedetecteerd in een kleine populatie van cellen. Door verhogen van de concentratie van retinoïnezuur 2-5 uM, kan de astrocyt populatie verder worden verlaagd. Echter, dergelijke culturen niet worden gehandhaafd gedurende een lange duur omdat gliale cellen ondersteunen neuronale overleving met secretie van groeifactoren. We hebben opgemerkt datis wenselijk retinoic grotere concentratie 3-5 dagen voordat de experimenten.
Het heterogene karakter van gedifferentieerde neuronen presenteert uitdagingen op het gebied van het bepalen van cel-type-specifieke genexpressie profilering. Daarom hebben we de voorwaarden voor LCM gekweekte neuronen (figuur 4) geoptimaliseerd. In de huidige studie, we onderscheiden NPCs op dia's met PEN membraan inserts en uitgevoerd LCM omdat deze techniek gepresenteerd moeilijkheden met neuronen gekweekt op regelmatige celcultuur gerechten zoals ze stevig zijn bevestigd. Hoewel de doelstellingen van LCM kan worden voldaan door immunohistochemische analyse, LCM biedt verschillende voordelen waaronder de mogelijkheid om het signaal te versterken op het RNA niveau uitvoeren multiplex analyse en nauwkeurige kwantificatie. In combinatie met microarray, LCM kan expressie analyse van duizenden genen in bepaalde celtypes 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten te verklaren.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Merit Beoordeling subsidie (NEUD-004-07F) van de Veterans Administration (SP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
- Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
- Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
- Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
- Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
- Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
- Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
- Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60 (2011).
- Dworkin, S., Mantamadiotis, T. Targeting CREB signalling in neurogenesis. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).
- Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
- Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
- Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).
