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Bioengineering

परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी का प्रयोग जीवित कोशिकाओं के यांत्रिक गुण मापने

Published: June 27, 2013 doi: 10.3791/50497
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Chemical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

यह कागज का एक परमाणु सेना माइक्रोस्कोप (AFM) का उपयोग microindentation के माध्यम से जीवित कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को चिह्नित करने के लिए एक प्रोटोकॉल को दर्शाता है.

Abstract

कोशिकाओं और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के यांत्रिक गुण स्टेम सेल भेदभाव, ट्यूमर गठन, और घाव भरने सहित कई जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. कोशिकाओं और ईसीएम की कठोरता में परिवर्तन अक्सर सेल फिजियोलॉजी या ऊतकों में रोगों में परिवर्तन के संकेत मिल रहे हैं. इसलिए, सेल कठोरता सेल संस्कृतियों की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए एक सूचकांक है. कोशिकाओं और ऊतकों की कठोरता को मापने के लिए लागू विधियों की भीड़ के बीच में, एक परमाणु सेना माइक्रोस्कोप (AFM) का उपयोग सूक्ष्म खरोज मज़बूती से जीवित कोशिकाओं की कठोरता को मापने के लिए एक तरीका प्रदान करता है. इस पद्धति का व्यापक रूप से धातु सतहों से मुलायम जैविक ऊतकों और कोशिकाओं से लेकर सामग्री की एक किस्म के लिए सूक्ष्म पैमाने पर कठोरता चिह्नित करने के लिए लागू किया गया है. इस विधि के बुनियादी सिद्धांत चयनित ज्यामिति के एक AFM टिप के साथ एक सेल इंडेंट और AFM ब्रैकट के झुकने से लागू बल को मापने के लिए है. हर्ट्ज मोड पर बल खरोज वक्र फिटिंगइसी टिप ज्यामिति के लिए एल सामग्री कठोरता की मात्रात्मक माप दे सकते हैं. इस पत्र AFM का उपयोग जीवित कोशिकाओं की कठोरता को चिह्नित करने की प्रक्रिया को दर्शाता है. एक MATLAB दिनचर्या का उपयोग कर AFM के अंशांकन की प्रक्रिया, बल वक्र अधिग्रहण, और डेटा विश्लेषण सहित महत्वपूर्ण कदम का प्रदर्शन कर रहे हैं. इस विधि की सीमाओं पर भी चर्चा कर रहे हैं.

Introduction

व्यक्ति की कोशिकाओं और उनके आसपास के बाह्य matrices के यांत्रिक गुणों, विशेष रूप से कठोरता, (ईसीएम) सेल के विकास, गतिशीलता, विभाजन, भेदभाव, और ऊतक homeostasis सहित कई जैविक प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं. 1 यह सेल यांत्रिक कठोरता मुख्य रूप से निर्धारित होता है कि प्रदर्शन किया गया है actin और मध्यवर्ती तंतु की इन विट्रो नेटवर्क पर यांत्रिक परीक्षण से cytoskeleton, actin और मध्यवर्ती तंतु और उनके साथ जुड़े अन्य प्रोटीन की विशेष रूप से नेटवर्क. 2 परिणाम सेल यांत्रिकी में cytoskeletal संरचना और पूर्व तनाव पर काफी हद तक निर्भर है कि सुझाव cytoskeleton है. जीवित कोशिकाओं के 3-5 अकड़न तो cytoskeletal संरचना 6, मायोसिन गतिविधि 7 और कई अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए एक सूचकांक के रूप में माना जाता है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, सेल यांत्रिक गुणों में परिवर्तन भी अक्सर निकट एसोसिएशन होना पाया जाता हैइस तरह के ट्यूमर गठन और मेटास्टेसिस के रूप में विभिन्न बीमारी की स्थिति के साथ पैदा 8-10 निगरानी जीवित कोशिकाओं के यांत्रिक कठोरता इसलिए सेल फिजियोलॉजी नजर रखने के लिए एक उपन्यास तरीका प्रदान कर सकते हैं;. का पता लगाने और रोगों 8 निदान करने के लिए,. और दवा उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए 11 , 12

कण ट्रैकिंग microrheology, 13-16 चुंबकीय घुमा cytometry, 17 micropipette आकांक्षा 18,19 और microindentation 20-22 सहित कई तरीकों कोशिकाओं की लोच को मापने के लिए विकसित किया गया है. कण ट्रैकिंग microrheology सेल cytoskeleton अंदर कोशिकाओं या मापकला मार्करों में इंजेक्शन submicron फ्लोरोसेंट कणों या तो थर्मल कंपन बताते हैं. कोशिकाओं के 23 लोचदार और चिपचिपा गुण अस्थिरता अपव्यय प्रमेय का उपयोग करके मापा कण विस्थापन से गणना कर रहे हैं. 14,23 इस विधि की अनुमति देता है स्थानीय के साथ मापएक कक्ष में विभिन्न स्थानों पर उच्च स्थानिक संकल्प के साथ यांत्रिक गुणों. हालांकि, कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट कणों इंजेक्शन लगाने सेलुलर समारोह में परिवर्तन, cytoskeleton संरचना, और इसलिए सेल यांत्रिकी को जन्म दे सकती है. micropipette आकांक्षा विधि पिपेट में कोशिका झिल्ली का एक छोटा सा टुकड़ा चूसना करने के लिए 1 से 5 माइक्रोन से लेकर व्यास की एक micropipette में नकारात्मक दबाव लागू होता है. सेल कठोरता लागू नकारात्मक दबाव और कोशिका झिल्ली विरूपण. 18 इस विधि से गणना की है, तथापि, सेल भर में जकड़न की विषम वितरण का पता नहीं लगा सकते हैं. चुंबकीय घुमा cytometry (MTC) कोशिका झिल्ली से जुड़ी सुपर paramagnetic मोती पर टोक़ उत्पन्न करने के लिए चुंबकीय क्षेत्र पर लागू होता है. 17 सेल कठोरता लागू टोक़ और कोशिका झिल्ली की घुमा विरूपण के बीच रिश्ते से इस विधि में प्राप्त होता है. यह MTC विधि में चुंबकीय मोतियों के स्थान को नियंत्रित करने के लिए मुश्किल है, और यह भी challengi हैउच्च संकल्प के साथ घुमा विरूपण चिह्नित करने के लिए एनजी. Microindentation सेल में पंच के लिए अच्छी तरह से परिभाषित ज्यामिति के साथ एक indenter लागू होता है. indenting बल और कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप खरोज अक्सर हर्ट्ज मॉडल की भविष्यवाणी का पालन करें. कोशिकाओं के युवा moduli हर्ट्ज मॉडल के लिए उन्हें फिटिंग द्वारा बल खरोज घटता से गणना की जा सकती. इस पद्धति का व्यापक रूप से इस तरह के संपर्क बिंदु दृढ़ संकल्प, हर्ट्ज मॉडल की प्रयोज्यता, और शारीरिक रूप से कोशिकाओं को नुकसान करने की क्षमता में अनिश्चितता के रूप में अपनी सीमाओं के बावजूद ऊतक और कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों का परीक्षण करने के लिए लागू किया गया है. Microindentaion 20 के लिए कई उपकरणों के अलावा, परमाणु सेना माइक्रोस्कोप (AFM) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और व्यापक रूप से जीवित कोशिकाओं और ऊतकों 21,24-27 के यांत्रिक गुणों को चिह्नित करने के लिए लागू किया गया है.

इस कागज सेल यांत्रिकी चिह्नित करने के लिए एक शरण MFP3D जैव AFM का उपयोग की प्रक्रिया को दर्शाता है. AFM के नहीं परly कोशिकाओं की उच्च संकल्प स्थलाकृति प्रदान करता है, लेकिन यह भी व्यापक रूप से ऊतक कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को चिह्नित करने के लिए लागू किया गया है. AFM के खरोज के सिद्धांत चित्र 1 में सचित्र है. AFM ब्रैकट ऊपर कुछ माइक्रोमीटर से सेल दृष्टिकोण, सेल के साथ संपर्क में आता है, इंडेंट सेल ब्रैकट विक्षेपन एक चुने हुए सेट बिंदु तक पहुँच जाता है ताकि, और दूर सेल से खींचती है. चित्र 1 में दिखाया के रूप में इस प्रक्रिया के दौरान ब्रैकट विक्षेपन अपने स्थान के एक समारोह के रूप में दर्ज है. सेल के साथ संपर्क बनाने से पहले, ब्रैकट कोई स्पष्ट विक्षेपन बिना माध्यम में चलता रहता है. सेल, ब्रैकट झुकता है और विक्षेपन संकेत बढ़ जाती है पर indenting है. cantilevers उनके विक्षेपन सेल को लागू बल के समानुपाती होता है कि इतना लोचदार मुस्कराते हुए के रूप में मॉडलिंग कर रहे हैं. अधिकतम ब्रैकट विक्षेपन की स्थापना करके, नमूना के लिए लागू बल की अधिकतम परिमाण घ से बचने के लिए सीमित हैकोशिकाओं को amage. सेल में टिप इंडेंट, सेल कठोरता निकालने के लिए हर्ट्ज मॉडल के लिए फिट है जहां चित्रा 1, में ग स्थल से स्थल ख से बल वक्र का भाग.

चित्रा 1
चित्रा 1. AFM के microindentation और बल वक्र की व्याख्या का चित्रण. शीर्ष पैनल पीजो स्कैनर द्वारा संचालित AFM ब्रैकट की गति का पता चलता है. ब्रैकट z और ब्रैकट विक्षेपन संकेत घ के ऊर्ध्वाधर स्थान प्रक्रिया के दौरान दर्ज की गई है. ब्रैकट बिंदु एक, सेल ऊपर कुछ माइक्रोमीटर से शुरू होता है. सेल आ जबकि यह टिप सेल के संपर्क में आता है, जहां बिंदु ख पहुँचता है, जब तक नमूना खरोज δ शून्य रहता है. साजिश में बिंदु ख के निर्देशांक महत्वपूर्ण मान रहे हैंडेटा विश्लेषण के लिए, (जेड 0, डी 0>) से चिह्नित. ख से ग के लिए, सेल में ब्रैकट इंडेंट ब्रैकट विक्षेपन लक्षित अधिकतम indenting शक्ति और निरंतर ब्रैकट वसंत के बीच अनुपात होना तय है जो एक सेट बिंदु तक पहुँच जाता है जब तक. विक्षेपन संकेत पूर्व निर्धारित अधिकतम मूल्य तक पहुँच जाता है, ब्रैकट तो, सेल से यह अक्सर टिप नमूना आसंजन के कारण नीचे की ओर खींचा जा बिंदु जहां घ, को वापस ले लिया सेल और रिटर्न से ई में अपनी आरंभिक स्थान पर detaches है. सही पैनल खरोज और दर्ज z और घ के संकेत के बीच संबंध दिखाता है. निचले बाएँ पैनल पर में वसंत लगातार एम / 0.07N हो मापा जाता है, जिनमें से एक प्रतिनिधि बल वक्र, एक ब्रैकट की अधिकतम खरोज,, की एक साजिश है अधिकतम indenting शक्ति को लागू किया ताकि 17 एनएम होना तय है नमूना 1.2 एन है. खरोज दौरान प्रमुख स्थानों के रूप में चिह्नित कर रहे हैं.

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Protocol

1. ब्रैकट के वसंत लगातार जांचना

  1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार है AFM में ब्रैकट लोड. यह किसी भी प्रयोगों से पहले इथेनॉल के साथ ब्रैकट धारक साफ करने के लिए आवश्यक है. इस AFM के मापन के दौरान संस्कृति के लिए जीवाणु संक्रमण को सीमित करने में मदद मिलेगी.
  2. InvOLS (उलटा ऑप्टिकल लीवर संवेदनशीलता) जांचना. यह पैरामीटर ब्रैकट विक्षेपन की नैनोमीटर प्रति photodiode की प्रतिक्रिया (वोल्ट) की राशि का वर्णन करता है.
  3. नमूना मंच पर एक साफ कांच स्लाइड लोड, तो निर्माता के निर्देशों के अनुसार AFM सिर स्थापित और लेजर बीम और संरेखण समायोजित करें. गिलास स्लाइड पर AFM टिप व्यस्त हैं.
  4. पीजो वापस ले लिया साथ, -2 के एक photodiode पढ़ने के लिए दर्पण फिर से संगठित करना वी. +2 के एक ट्रिगर बिंदु (अधिकतम photodiode की प्रतिक्रिया) के साथ एक बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप प्रदर्शन करना वी.
  5. पीजो वापस ले लिया साथ, -2 के एक photodiode पढ़ने के लिए दर्पण फिर से संगठित करना वी. एक के लिए प्रदर्शन करना2 वी. नोट की एक ट्रिगर बिंदु (अधिकतम photodiode की प्रतिक्रिया) के साथ RCE स्पेक्ट्रोस्कोपी माप: यहां वोल्टेज मूल्यों शरण AFM के लिए विशिष्ट हैं. यह मान निर्माता द्वारा प्रदान की विशेषताओं के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए.
    डाटा अधिग्रहण के पूरा होने पर, बल वक्र की फर्म से संपर्क क्षेत्र में ज़ूम. वी / एनएम में होगा जो ढलान को खोजने के लिए इस क्षेत्र के लिए एक रेखीय फिट प्रदर्शन करना. इस मूल्य के पारस्परिक ब्रैकट photodiode के कलाकारों की टुकड़ी के ऑप्टिकल संवेदनशीलता का वर्णन करता है.
  6. 0 के एक मुक्त डिफ्लेक्शन को दर्पण संरेखण रीसेट वी.
  7. ब्रैकट वसंत लगातार जांचना. एक थर्मल धुन विधि ब्रैकट 28 के निरंतर वसंत निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  8. InvOLS औजार के बाद, टिप और नमूना के बीच कोई बातचीत कर रहे हैं कि इस तरह नमूना मंच से स्कैनर दूर बढ़ा.
  9. थर्मल डेटा पर कब्जा करने के लिए शुरू. इस प्रक्रिया के दौरान, ब्रैकट बीम का थर्मल कंपन Recorde हैघ. AFM के सॉफ्टवेयर में इस तरह के एक थर्मल कंपन और एक डेटा खिड़की में भूखंडों यह की एक शक्ति स्पेक्ट्रम का विश्लेषण करती है.
  10. डाटा अधिग्रहण के कुछ सेकंड बाद, वसंत निरंतर निर्धारित करने के लिए सबसे कम आवृत्ति (मौलिक गूंज) शिखर पर केन्द्रित डेटा खंड के लिए एक फिट करते हैं.

2. नमूना लोड हो रहा है

  1. AFM के मंच पर डिश हीटर गौण स्थापित करें, पहले से ही लैस नहीं तो.
  2. 37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान सेट, और एक स्थिर थर्मल संतुलन तक पहुंचने की व्यवस्था के लिए 20 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें.
  3. AFM के मंच पर संस्कृति पकवान प्लेस और पकवान हीटर के साथ प्रदान की क्लैंप का उपयोग कर इसे सुरक्षित. यह इनक्यूबेटर से पकवान को हटाने और कोशिकाओं को आघात से बचने के लिए, मंच पर रखकर बीच के समय को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. 30 मिनट से अधिक समय के माप के लिए, सीओ 2 स्वतंत्र मध्यम सामान्य मध्यम संस्कृति को बदलने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  4. टी की टिप करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस संस्कृति के माध्यम से एक छोटी सी बूंद लागू करेंवह AFM ब्रैकट, और टिप सिर्फ तरल में डूबे हुए है जब तक AFM के सिर को कम.
  5. ऊपर से देखने सीसीडी कैमरा का उपयोग करना, ब्रैकट (तरल में संरेखण क्योंकि माध्यम के अपवर्तनांक में परिवर्तन की हवा में से अलग हो जाएगा) पर लेजर बीम फिर से संगठित करना.
  6. संस्कृति पकवान की एक साफ क्षेत्र पर AFM टिप व्यस्त हैं.
  7. तरल वातावरण में ब्रैकट संवेदनशीलता के लिए, जैसा कि ऊपर वर्णित InvOLS के अंशांकन प्रदर्शन करना.

नोट: कोशिकाओं hydrogels पर संवर्धित कर रहे हैं, तो एक), InvOLS की जांच सेल संस्कृति मीडिया के साथ भरा एक संस्कृति डिश के नीचे की सतह के खिलाफ अग्रिम में किया जाना चाहिए. सेल के नमूने में जाने के दौरान, विशेष ध्यान ब्रैकट साथ लेजर बीम संरेखण बदल नहीं करने के लिए भुगतान किया जाना है. ख) InvOLS लेजर संरेखण में कोई परिवर्तन होता है जब भी recalibrated हो गया है. ग) यह भी कई अंशांकन घटता, एस से मूल्य के औसत के रूप में InvOLS लेने की सिफारिश की हैप्रत्येक अंशांकन एक अलग InvOLS उत्पन्न ince. InvOLS में भिन्नता मतलब मूल्य की तुलना करने, तथापि, छोटा है. उदाहरण के लिए, 100 गुना से 0.06 एन तरल में / मी निरंतर वसंत के साथ एक Bruker DNP-10 ब्रैकट औजार केवल 0.5 एनएम / के मानक विचलन के साथ, 66.3 एनएम / वी का एक मतलब InvOLS मूल्य उत्पादन वी.

3. सेल इंडेंटेशन के बल घटता एकत्रित

  1. खरोज के लिए एक कक्ष का चयन करें. ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप की सहायता के साथ, टिप पेरी नाभिक क्षेत्र में स्थित है, इतना है कि सेल ऊपर ब्रैकट स्थिति के लिए मंच के लिए कदम. ब्रैकट स्थिति का सटीक समायोजन एक्स और वाई स्कैनर के लिए ऑफसेट लगाने से पूरा किया जा सकता है.
    नोट: AFM ब्रैकट एक लक्ष्य कक्ष का चयन करने के लिए नमूना मंच चलती है जबकि नमूना सतह से वापस ले लिया गया है. नमूना सतह सपाट नहीं हो सकता, क्योंकि यह नमूना में दस्तक से ब्रैकट बचाता है.
  2. स्पेक्ट्रोस्कोपी मोड सेना में स्विच करें. इंडेंटेशन सेटhydrodynamic के प्रभाव से बचने के लिए काफी कम 1-10 सुक्ष्ममापी / सेकंड की सीमा के भीतर की दर से.
  3. कोशिकाओं को नुकसान से बचने के लिए अधिकतम indenting शक्ति जो सीमा विक्षेपन ट्रिगर बिंदु, सेट करें. विक्षेपन संकेत में किसी भी बहाव के लिए सही होगा जो सापेक्ष ट्रिगर विकल्प का चयन करें. 2 एन की एक अधिकतम शक्ति सबसे अधिक नमूनों के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है. यह मान, तथापि, नमूना कठोरता के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए. मुलायम के नमूने के लिए एक कम मूल्य नमूना करने के लिए अत्यधिक खरोज से बचने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. कड़ी नमूने के लिए एक उच्च मूल्य औसत दर्जे का खरोज उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  4. टिप पूरी तरह से बल माप के बीच सेल से अलग हो जाएगा कि यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त बड़ी ताकत दूरी निर्धारित करें. आमतौर पर, बल दूरी 5 माइक्रोन से कम निर्धारित है.
  5. एक भी बल वक्र लेने के लिए AFM कमान.
  6. प्रत्येक कोशिका के पेरी नाभिक क्षेत्र में विभिन्न स्थानों पर कम से कम तीन बल घटता लीजिए. यह कई लेने के लिए फायदेमंद हैभी कई बल घटता लेने विश्वसनीय सांख्यिकीय आंकड़ों के लिए प्रत्येक कक्ष पर घटता, AFM जांच से तनाव के कारण सेल कठोरता में परिवर्तन हो सकता है.
  7. डेटा संग्रह पूर्ण होने पर, टिप वापस लेने, और एक निश्चित नमूना शर्त के तहत सेल कठोरता पर अच्छा सांख्यिकीय आंकड़ों के लिए जरूरत के रूप में दोहराने के रूप में कई कोशिकाओं के लिए 3.1-3.6 कदम. आमतौर पर, 30 कोशिकाओं को हर हालत के लिए मापा जाता है.

एक एकल कोशिका के भीतर कठोरता के वितरण के लिए चिह्नित करना, बल नक्शा मोड लागू किया जाता है. सेना के नक्शे मोड में, ब्याज के क्षेत्र में शामिल करने के लिए एक स्कैन आकार सेट, एक उचित प्रस्ताव तैयार, एकल बल घटता के लिए चयनित लोगों के रूप में खरोज मानकों सेट, AFM को तो परिभाषित नमूना क्षेत्र भर रेखापुंज जाएगा और एकल बल घटता ले नमूना क्षेत्र में प्रत्येक पिक्सेल पर.

4. डेटा विश्लेषण

दर्ज बल घटता सेल कठोरता की गणना के लिए एक कस्टम MATLAB प्रक्रिया का उपयोग विश्लेषण कर रहे हैं. निम्नलिखित MATLAB प्रक्रिया का एक संक्षिप्त विवरण है:

  1. . MATLAB कार्यक्रम संपर्क बिंदु लिन एट अल द्वारा प्रकाशित एक विधि से अपनाया एक एल्गोरिथ्म 29 का उपयोग करते हुए (चित्रा 1 देखें) z0 और d0 निर्देशांक को पहचानती है:
  2. सेट अप करने के लिए बल की अवस्था में प्रत्येक डेटा बिंदु के लिए ब्याज की बिंदु के बाईं ओर करने के लिए डेटा की एक रेखीय फिट करते हैं, और एक हर्ट्ज मॉडल सही (संपर्क का प्रारंभिक बिंदु के रूप में चयनित बिंदु का उपयोग) के लिए फिट अधिकतम खरोज (200-300 एनएम) की सिफारिश की.
  3. प्रत्येक बिंदु के लिए, दोनों फिट बैठता है की रिश्तेदार आरएमएस त्रुटि की गणना और इन मूल्यों का योग.
  4. न्यूनतम कुल फिटिंग त्रुटि उपलब्ध हो जाता है, जो बिंदु संपर्क के प्रारंभिक बिंदु के रूप में चयन किया गया है.
    नोट: संगणना समय बल्कि रैखिक पूरे बल वक्र स्कैनिंग से एक सुनहरा अनुभाग खोज को लागू करने से कम किया जा सकता है.
  5. नमूना विरूपण δ और बल एफ indenting के रूप में गणना कर रहे हैं:
    1 समीकरण
  6. एक कम से कम वर्ग फिटिंग बनाम एफ फिट करने के लिए लागू किया जाता है बाद संपर्क क्षेत्र में δ डेटा, Z ≥ जेड 0, युवा मापांक, सेल की ई निकालने के लिए हर्ट्ज मॉडल के लिए:
    2 समीकरण
    , जहां वी पॉसों के अनुपात है.
    नोट: δ नमूना मोटाई (सेल ऊंचाई) की 10% से अधिक हो गया है, मापा सेल कठोरता सब्सट्रेट कठोरता से प्रभावित है. पेरी परमाणु क्षेत्र की मोटाई आमतौर पर कुछ micrometers के आदेश पर है. इसलिए, एफ δ वक्र का केवल प्रथम 200-300 एनएम हर्ट्ज मॉडल के लिए फिट है.

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Representative Results

चित्रा 2a क्रमशः प्लास्टिक सतह, यंग moduli 3,000 पा और 17,000 पा के polyacrylamide जेल, पर सभ्य 3T3 fibroblasts से लिया तीन प्रतिनिधि बल घटता दिखाता है. ध्यान से घटता में संपर्क बिंदुओं की पहचान करने के बाद, सेल विरूपण के समारोह के रूप में indenting बल चित्रा 2b में साजिश रची है. 0.3 एन, एक 3 किलो पास्कल polyacrylamide जेल पर सुसंस्कृत एक सेल में एक पिरामिड आकार टिप इंडेंट 3 माइक्रोमीटर से छोटा परिमाण का एक बल के तहत. इसके विपरीत, एक बल से अधिक 1.6 एन उसी टिप का उपयोग सादे संस्कृति पकवान पर हो सेल में 500 नैनोमीटर इंडेंट करने के लिए आवश्यक है. यह नरम polyacrylamide जेल पर सभ्य सेल कड़ी संवर्धन पकवान पर सभ्य सेल की तुलना में नरम है कि इस ग्राफ से स्पष्ट है. हर्ट्ज मॉडल को बल δ घटता के पहले खंड (δ <30 एनएम) फिटिंग क्रमश: 10 किलो पास्कल, 1.2 किलो पास्कल, और 1.10 किलो पास्कल के रूप में इन तीन कक्षों के युवा moduli देता है. संस्कृतियों पर कक्षई पकवान polyacrylamide जैल पर संवर्धित कोशिकाओं की तुलना में 100 गुना stiffer रहे हैं. Solon एट अल. इसी तरह के परिणाम 25 को सूचित किया है. वे fibroblasts सक्रिय रूप से वे का पालन substrates की कठोरता मैच के लिए उनके cytoskeletons ठोस बनाना पाया. कठोर substrates के 30 सुसंस्कृत जब कई अन्य प्रकार की कोशिकाओं को भी कठोर बनने के लिए सूचित किया गया है.

यह खरोज कोशिकाओं में प्लास्टिक विरूपण पैदा कर सकता है कि यह नोट करना महत्वपूर्ण है, जो बैंगनी वक्र में सचित्र रूप सनक का परिणाम है. आम तौर पर, इस तरह घटता डेटा विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए. हालांकि, वक्र अभी भी गुत्थी फिटिंग डेटा की सीमा से परे है अगर सेल कठोरता की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, बैंगनी वक्र में गुत्थी लगभग 400 एनएम पर होता है. यह वक्र अभी भी 1.2 किलो पास्कल की कठोरता मूल्य उपज हर्ट्ज मॉडल तक ही δ को 30 एनएम = डेटा फिटिंग द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है. यह वें के अनुसार "ट्रिगर बिंदु" समायोजित करने के लिए भी महत्वपूर्ण हैई नमूना कठोरता. उदाहरण के लिए, नीले वक्र एक 3 किलो पास्कल polyacrylamide जेल पर सुसंस्कृत एक नरम सेल से लिया जाता है. सेल में 5 एनएम, AFM टिप इंडेंट 3 माइक्रोमीटर से कम सापेक्ष विक्षेपन ट्रिगर बिंदु स्थापना. यह टूटना कोशिका झिल्ली सकता है और सेल को मारने के बाद से इस तरह के एक बड़े खरोज, सेल कठोरता माप के दौरान रोका जाना चाहिए. बल की अवस्था अधिग्रहण के दौरान टिप वेग और डाटा अधिग्रहण दर सहित कई अन्य कारकों का अधिग्रहण बल घटता है और इसलिए कोशिकाओं 31 के परिणामस्वरूप कठोरता की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं. विश्वसनीय माप बनाने के लिए यह एक nonlinear में वृद्धि के बाद से संपर्क भाग के बाद फ्लैट पूर्व संपर्क हिस्सा है जो चित्रा 2 में दिखाया लाल वक्र के रूप में "साफ" बल घटता प्राप्त करने के लिए इन सभी मापदंडों को समायोजित करने के लिए आवश्यक है.

चित्रा 3a एक सेल संस्कृति पकवान पर एक 3T3 तंतुप्रसू से एक प्रतिदीप्ति छवि को दर्शाता है. सेल, GFP vimentin साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैमध्यवर्ती तंतु का एक प्रकार है. AFM के सेना मानचित्रण 32 x 32 पिक्सल के एक संकल्प के साथ, 80 माइक्रोन क्षेत्र से इस 80 माइक्रोन में प्रदर्शन किया गया है. परिणामस्वरूप कठोरता नक्शा चित्रा 3b में दिखाया गया है. कठोरता सेल में बदलता है. और, lamellipodium क्षेत्र कड़ा नाभिक है कि चारों ओर पेरी परमाणु क्षेत्र की तुलना में stiffer और अधिक विषम है.

चित्रा 2
चित्रा 2. सेना वक्र डेटा और विश्लेषण बल खरोज वक्र. एक) कांच पर संवर्धित 3T3 fibroblasts के लिए अधिग्रहीत की तीन प्रतिनिधि बल वक्र डेटा का एक सेट (लाल), 17 किलो पास्कल polyacrylamide जेल (बैंगनी), और 3 किलो पास्कल polyacrylamide जेल (नीला). घटता संपर्क बिंदु (जेड 0, डी 0) के समन्वय के मूल (0,0) में स्थित है इतना है कि स्थानांतरित कर रहे हैंप्रणाली. ख) खरोज बल घटता खरोज के केवल पहले 300 एनएम का उपयोग कर हर्ट्ज मॉडल को खरोज डेटा की एक) और फिटिंग से गणना की. ख) में इनसेट खरोज के पहले 300 एनएम के लिए हर्ट्ज मॉडल के लिए फिट की भलाई से पता चलता है, हलकों प्रयोगात्मक डेटा हैं, लाइनों फिट डेटा का प्रतिनिधित्व करते हैं. ब्रैकट निरंतर वसंत 0.062 एन इस मामले में / मी है.

चित्रा 3
चित्रा 3. एक) एक 3T3 तंतुप्रसू के प्रतिदीप्ति छवि GFP vimentin साथ ट्रांसफ़ेक्ट. सेल का केवल एक हिस्सा छवि में दिखाया गया है. स्केल बार 20 माइक्रोन ही क्षेत्र की. ख) एक 32 x 32 पिक्सेल कठोरता नक्शे का प्रतिनिधित्व करता है. प्रत्येक पिक्सेल 2.5 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है.

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Discussion

AFM के खरोज विधि जीवित कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों को चिह्नित करने के फायदे हैं. Piconewton 32 के स्तर पर बलों के उपाय कर सकते हैं जो चुंबकीय घुमा cytometry और ऑप्टिकल चिमटी, की तुलना में कम संवेदनशील देरी, AFM के बल से लेकर तुलनीय पिको न्यूटन के दसियों से नैनो न्यूटन के सैकड़ों से लेकर नमूनों से प्रतिरोध शक्ति का पता लगा सकते हैं कि एक micropipette 19 का उपयोग कोशिकाओं को लागू किया जा सकता है. बल की यह रेंज कोशिकाओं 19 के सभी प्रकार में औसत दर्जे का विकृतियों पैदा करने की जरूरत है फिट बैठता है. उच्च स्थानिक संकल्प यह संभव submicron स्तर पर 33 ऊतकों में और एकल कक्षों के भीतर विषमताओं को चिह्नित करने के लिए बनाता है. यह भी वास्तविक समय रहते सेल माप की अनुमति देता है. जैविक नमूने के लिए तैयार की गई अनेक AFM के मॉडल एक तरल पदार्थ वातावरण में काम कर सकते हैं और सटीक तापमान नियंत्रण प्रदान करते हैं जो गर्म नमूना चरणों से लैस कर रहे हैं, यह संभव है एक शारीरिक पर्यावरण को बनाए रखने के लिए कर रही हैमाप के दौरान जीवित कोशिकाओं के लिए ronment. AFM के खरोज सफलतापूर्वक प्रकार की कोशिकाओं, 25,34-36 की एक सीमा के यांत्रिक गुणों को मापने के लिए लागू किया गया है और सेलुलर भेदभाव के साथ जुड़े कोशिकाओं के यांत्रिक गुणों में और विभिन्न रोगग्रस्त संदर्भों में आकलन परिवर्तन के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. 30,37

बल की अवस्था से कठोरता की गणना के लिए एक महत्वपूर्ण कदम टिप पहली सेल के साथ संपर्क में आता है, जहां बिंदु की पहचान है. संपर्क बिंदु में अनिश्चितता लोचदार मापांक 31 प्रभावित कर सकते हैं. कठोर सामग्री के लिए, विक्षेपन संकेत अचानक टिप नमूना संपर्क के बाद बढ़ जाती है, और संपर्क बिंदु आसानी से घटता में निर्णायक बिंदु के रूप में पहचान की है. इस तरह के एक तेज मोड़, तथापि, अक्सर कम सेल कठोरता (देखें चित्र 2) की वजह से कोशिकाओं से बल घटता है, में प्रकट नहीं होता. एक matlab कोड सही बल घटता में संपर्क अंक खोजने के लिए विकसित किया गया हैलिन एट अल द्वारा प्रस्तावित एल्गोरिथ्म का उपयोग कर नरम नमूने से. 29 कोड हमें स्वचालित रूप से संपर्क बिंदु के लिए खोज और हर्ट्ज मॉडल को खरोज डेटा फिटिंग द्वारा डेटा विश्लेषण की प्रक्रिया को स्वचालित करने के लिए सक्षम बनाता है जो मुलायम के नमूने, से बल घटता संभाल कर सकते हैं. MATLAB कोड कठोरता थोक rheology माप से 7.2 किलो पास्कल होने का उपाय था जिनमें से एक polyacrylamide जेल के एक ही स्थान पर ले जाया 60 बल घटता में संपर्क अंक निर्धारित करने के लिए लागू किया जाता है. कोड इन घटता अंक में संपर्क का पता चला. संपर्क बिंदु स्थान में बदलाव की सीमा 15 एनएम से छोटी है. इन संपर्क अंक के आधार पर गणना मतलब कठोरता 6.9 किलो पास्कल है, मानक विचलन 0.2 किलो पास्कल, और विभिन्नता 0.6 किलो पास्कल की अधिकतम सीमा है. इस प्रयोग से परिणाम मापा कठोरता की अनिश्चितता का मूल्यांकन करने के लिए एक उपाय प्रदान करते हैं. मतलब valu के कम से कम 10% है जो कठोरता में एक अनिश्चितता, में संपर्क बिंदु परिणामों में 15 एनएम अनिश्चितताई. विक्षेपन संकेत के बहुत कम स्तर के साथ नरम जैल के लिए, संपर्क बिंदु में अनिश्चितता 30 एनएम, 30% के रूप में उच्च के रूप में कठोरता में एक अनिश्चितता की ओर जाता है के रूप में उच्च किया जा सकता है. कोड इस लेख के लिए एक पूरक के रूप में उपलब्ध है.

AFM को मज़बूती से सबसे ऊतकों और कोशिकाओं के लिए कठोरता की रेंज को कवर कम से कम 100 फिलीस्तीनी अथॉरिटी से 10 6 पा लेकर कठोरता, उपाय कर सकते हैं. विश्वसनीय माप के लिए, यह अच्छी तरह से नमूना कठोरता के लिए मिलान वसंत स्थिरांक के साथ AFM cantilevers के चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है. ब्रैकट भी कठिन है, तो उसके नीचे को झुकाव का पता लगाने के लिए बहुत छोटा है और यह सेल को नुकसान पहुंचा सकता है, ब्रैकट भी नरम है, यह विश्वसनीय सामग्री संपत्ति प्राप्त करने के लिए पर्याप्त रूप से सेल इंडेंट नहीं करेंगे और अपने थर्मल कंपन बल वक्र हावी कर सकते हैं. एक पिरामिड टिप के साथ 0.06 एन / मी की Cantilevers कड़ी संस्कृति बर्तन पर संवर्धित सबसे अधिक प्रकार की कोशिकाओं के लिए लागू होते हैं. ये cantilevers, तथापि, पर संवर्धित कोशिकाओं को मापने के लिए लागू नहीं कर रहे हैंमुलायम substrates है. चित्रा 2 में दिखाया गया है, एक 3000 पा polyacrylamide जेल पर सभ्य सेल एक 3 माइक्रोन खरोज ब्रैकट में एक एनएम 5 विक्षेपन उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है कि बहुत नरम है. बल वक्र पूर्व संपर्क और बाद के संपर्क क्षेत्र के बीच में बहुत कम अंतर है कि इतना फ्लैट है. इस संपर्क बिंदु में बड़ी अनिश्चितता और इसलिए परिणामस्वरूप कठोरता मूल्यों की ओर जाता है. एक नरम ब्रैकट का प्रयोग केवल थोड़ा पूर्व संपर्क और बाद के संपर्क क्षेत्रों के बीच इसके विपरीत में सुधार. माप के लिए इस तरह नरम सामग्री, बड़े गोलाकार टिप के साथ cantilevers सिफारिश कर रहे हैं. व्यास में 10 micrometers के एक गोलाकार टिप के साथ एक 0.06 एन / मीटर ब्रैकट गोलाकार टिप के साथ 100 फोनों Cantilevers से कठोरता कम कई विक्रेताओं से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं के साथ नमूनों को मापने के लिए लागू किया जा सकता है. उन्होंने यह भी हो सकता है कस्टम tipless cantilevers के लिए चिपकाने microspheres के द्वारा. गोलाकार सुझावों बड़ा विक्षेपन संकेत प्रदान करते हैं और कोशिका झिल्ली को नुकसान को रोकने. एचowever, वे कोशिकाओं के साथ उनके बड़े संपर्क क्षेत्र की वजह से उच्च संकल्प कठोरता मैपिंग के लिए लागू नहीं कर रहे हैं. 1 टेबल सेल कठोरता मापन के लिए सिफारिश की AFM जांच की एक सूची प्रदान करता है.

मॉडल स्प्रिंग निरंतर (एन / एम) युक्ति के प्रकार टिप त्रिज्या (एनएम)
Bruker DNP10 डी 0.06 पिरामिड 20
Bruker MLCT-B/C/E 0.01/0.02/0.03 पिरामिड 20
Novascan PT.GS 0.01/0.03/0.06 ग्लास क्षेत्र 2,000 / 5,000 / 10,000
Novascan PT.PS 0.01/0.03/0.06 Polystyrene क्षेत्र 1,000 / 4,500 / 10,000

तालिका 1. एक सेसेल खरोज के लिए लागू वसंत निरंतर और टिप ज्यामिति के साथ AFM जांच का रूपांतर.

प्रस्तुत विधि की सीमाओं को भी चिह्नित किया जाना चाहिए. खरोज डेटा फिट करने के लिए लागू किया गया है कि हर्ट्ज मॉडल एक साधारण मॉडल है. यह axisymmetric indenters द्वारा विशुद्ध रूप से लोचदार सामग्री की अत्यल्प indentations के लिए बल खरोज संबंध भविष्यवाणी की है. हर्ट्ज मॉडल की मान्यताओं के कुछ सेल खरोज के लिए लागू नहीं है.

एक सेल विषम (चित्रा 3 देखें) और nonlinearly लोचदार है, जबकि हर्ट्ज मॉडल, सजातीय और रैखिक लोचदार सामग्री मानता है. Lamellipodium क्षेत्र में, यह कारण actin cytoskeleton के विषम संरचना करने के लिए नहीं बल्कि inhomogeneous है. एक सेल के यांत्रिक कठोरता अपेक्षाकृत सजातीय perinuclear क्षेत्र से अधिग्रहीत तीन या अधिक बल घटता से निकाले औसत कठोरता के रूप में सूचना दी है. 25,36 networ के पुनर्गठनactin और मध्यवर्ती रेशा के एस तनाव stiffening सामग्री रहे हैं, यानी वे बड़े विकृतियों पर stiffer रहे हैं. 38,39 इस तरह के एक nonlinear लोच जीवित कोशिकाओं के लिए मनाया जाता है, लेकिन हर्ट्ज मॉडल के लिए जिम्मेदार नहीं किया गया है. रिपोर्ट में सेल कठोरता पर अरेखीय लोच के प्रभाव को सीमित करने के लिए, खरोज डेटा के केवल पहले 300 एनएम हर्ट्ज मॉडल के लिए फिट है.

यह भी सामग्री विशुद्ध लोचदार हैं कि हर्ट्ज मॉडल में माना जाता है. हालांकि, सेल और उनके cytoskeleton viscoelastic सामग्री माप के समय के पैमाने पर निर्भर कठोरता के साथ कर रहे हैं. कम समय के पैमाने पर, ब्रैकट विक्षेपन मुख्य रूप से कोशिकाओं की लोचदार प्रतिक्रिया से आता है. लंबे समय के पैमाने पर, तथापि, नमूना ढोंगी और एक नरम प्रतिक्रिया देता है. AFM के खरोज के समय के पैमाने टिप वेग से नियंत्रित किया जाता है. बल घटता ही खरोज velo के साथ प्राप्त कर रहे हैं इसलिए, सेल कठोरता में मनाया अंतर केवल सार्थक हैशहर. मात्रात्मक कोशिकाओं की आवृत्ति निर्भर viscoelasticity निकालने के लिए, AFM के "बल मॉडुलन" विधि एक बड़ा खरोज 21,27 पर उच्च आवृत्ति छोटे आयाम दोलनों लगाने से विकसित किया गया है.

हर्ट्ज मॉडल में अनंत नमूना मोटाई की धारणा कोशिकाओं के लिए लागू नहीं होता. कोशिकाओं को आम तौर पर एक perinuclear क्षेत्र में मोटी कुछ micrometers, और लामेल्ला क्षेत्र में मोटी सौ नैनोमीटर कुछ कर रहे हैं. सुधार परिमित नमूना मोटाई के लिए खाते में कर दिया गया है. बल मैपिंग से अधिग्रहीत 31,40 डाटा खरोज डेटा और सेल ऊंचाई डेटा दोनों शामिल हैं. स्थानीय नमूना मोटाई ऊंचाई डेटा से गणना की जा सकती. भविष्य के काम के बल मानचित्रण डेटा के विश्लेषण में नमूना मोटाई सुधार लागू करने के लिए आवश्यक है.

सारांश में, इस कागज एक शरण MFP3D जैव परमाणु शक्ति माइकर का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं के यांत्रिक कठोरता चिह्नित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुतoscope. AFM के आपरेशन के सिद्धांतों और MATLAB डेटा विश्लेषण प्रक्रिया अन्य सभी AFM के मॉडल को लागू कर रहे हैं. हाल के वर्षों में, उज्ज्वल क्षेत्र, confocal माइक्रोस्कोपी, और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRF) सहित ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीक यांत्रिक उत्तेजनाओं को कोशिकाओं के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए AFM के साथ संयुक्त कर दिया गया है. 41,42 इन setups भी एक साथ माप की अनुमति सेल यांत्रिकी और cytoskeletal घटकों की इमेजिंग. स्थानीय cytoskeletal घटकों के वितरण के लिए स्थानीय कठोरता डेटा correlating cytoskeletal घटकों सेल यांत्रिकी में योगदान पर व्यावहारिक जानकारी प्रदान करेगा.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों ने इस पत्र में इस्तेमाल सेल लाइनों प्रदान करने के लिए पेन्सिलवेनिया विश्वविद्यालय में डॉ. पॉल Janmey धन्यवाद. QW भी AFM के तकनीक पर उनके व्यावहारिक विचार विमर्श के लिए जेएफ Byfield और इवान एंडरसन को स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atomic Force Microscope Asylum Research MFP3D-BIO

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Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50497, doi:10.3791/50497 (2013).

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