Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Измерение механических свойств живых клеток с помощью атомно-силовой микроскопии

Published: June 27, 2013 doi: 10.3791/50497
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Chemical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

Эта статья демонстрирует протокол для характеристики механических свойств живых клеток с помощью микроиндентирования с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ).

Abstract

Механические свойства клеток и внеклеточного матрикса (ECM) играют важную роль во многих биологических процессах, включая дифференцировку стволовых клеток, образование опухолей, и заживление ран. Изменение жесткости клеток и ECM часто являются признаками изменения в физиологии клеток или заболеваний в тканях. Таким образом, жесткость элемент является индексом для оценки состояния клеточных культур. Среди множества методов, применяемых для измерения жесткость клеток и тканей, микро-отступа использованием атомно-силового микроскопа (АСМ) обеспечивает возможность надежного измерения жесткость живых клеток. Этот способ широко применяется для описания микро-масштабе жесткости для различных материалов, начиная с металлических поверхностей мягкой биологической ткани и клетки. Основной принцип этого метода является создание отступа ячейки с иглой АСМ выбранной геометрии и измерения приложенной силы от изгиба кантилевера АСМ. Установка силового отступы кривой в режим Hertzл для соответствующей геометрии наконечника может дать количественные измерения жесткости материала. Эта статья демонстрирует процедуру для характеристики жесткости живых клетках с помощью АСМ. Ключевые шаги в том числе процесс калибровки АСМ, сила-кривой приобретения, а также анализ данных с использованием обычного MATLAB демонстрируются. Ограничения этого метода также обсуждаются.

Introduction

Механические свойства, особенно жесткости отдельных клеток и окружающей их внеклеточного матрикса (ECM) являются критическими для многих биологических процессов, в том числе рост клеток, подвижность, деление, дифференцировку и тканевого гомеостаза. 1 Было показано, что клетки механическую жесткость в основном определяется цитоскелета, особенно сетей актина и промежуточных филаментов и других белков, связанных с ними. 2 Результаты механических испытаний на сетях в пробирке актина и промежуточных филаментов предполагают, что клетки механика во многом зависит от структуры цитоскелета и предварительного напряжения в цитоскелета. 3-5 Жесткость живых клеток затем рассматривается в качестве индекса для оценки структуры цитоскелета, 6, 7 активность миозина и многих других клеточных процессов. Более того, изменения в клеточной механические свойства также часто оказывается тесно свяated с различными условиями заболеваний, таких как образование опухолей и метастазов 8-10 мониторинга механической жесткости живые клетки, следовательно, обеспечить новый способ контроля клеточной физиологии;. для обнаружения и диагностики заболеваний 8;. а также для оценки эффективности медикаментозного лечения 11 , 12

Несколько методов, включая частицы отслеживания микрореология, 13-16 магнитный цитометрии скручивание, 17 микропипетки стремление 18,19 и микроиндентирования 20-22 были разработаны для измерения эластичности клеток. Микрореология отслеживания частиц прослеживает тепловых колебаний либо флуоресцентные частицы субмикронного вводили в клетки или координатных меток внутри клетки цитоскелета. +23 Упругих и вязких свойств клеток рассчитывается из измеренного смещения частиц использованием ФДТ. 14,23 Этот метод позволяет одновременных измерений местныхмеханических свойств с высоким пространственным разрешением в разных местах в клетке. Тем не менее, инъекционное флуоресцентные частицы в клетки может привести к изменению клеточной функции, структуры цитоскелета, и, следовательно, клетки механики. Метод микропипетки пронизывает отрицательного давления в микропипетки с диаметром в диапазоне от 1 до 5 мкм, чтобы сосать небольшой кусок клеточную мембрану в пипетку. Сотовые жесткость рассчитывают из прикладной отрицательное давление и клеточные мембраны деформации. 18 Этот метод, однако, не может обнаружить неоднородное распределение жесткость по всей клетке. Магнитные цитометрии скручивание (ВТС) применяется магнитное поле для создания крутящего момента на супер шарики парамагнитный прикреплен к клеточной мембране. 17 сотовый жесткости происходит в этом методе из соотношения между приложенным крутящий момент и крутящий деформации клеточной мембраны. Это трудно контролировать расположение магнитных шариков в методе МТС, и это также challengiнг охарактеризовать деформация кручения с высоким разрешением. Микроиндентирования относится индентора с четко определенными геометрии пробить в клетку. Отступов силы и в результате углубление в клетках часто следуют предсказания модели Герца. Модуль Юнга клеток, может быть рассчитана по силе отступа кривые путем установки их в герцах модели. Этот способ широко применяется для проверки механических свойств тканей и клеток, несмотря на его ограничения, такие как неопределенность в точке контакта определение, применимость модели Герца, а также возможность физически повредить клетки. Среди многих устройствах для microindentaion 20, атомно-силовой микроскоп (АСМ) является коммерчески доступной и широко применяется для характеристики механических свойств живых клетках и тканях 21,24-27.

Эта статья демонстрирует порядок использования Asylum MFP3D-Bio AFM охарактеризовать клетку механики. AFM не налы обеспечивает высокое разрешение топографию элементов, но и широко применяется для характеристики механических свойств клеток ткани. Принцип отступа АСМ показано на рисунке 1. АСМ кантилевера приближается клетку от нескольких микрометров выше; вступает в контакт с клеткой; отступы ячейки таким образом, чтобы отклонение кантилевера достигает заданной уставки, и отрывается от клетки. Во время этого процесса изгиба кантилевера записывается в виде функции его расположения, как показано на рисунке 1. , Прежде чем связаться с клеткой, кантилевера движется в среде без видимых отклонений. Когда отступа на клетку, кантилевер изгибам и увеличивает отклонение сигнала. Кантилеверов смоделированы как упругих стержней так, чтобы их отклонение пропорционально силе, приложенной к ячейке. Установив максимальный прогиб кантилевера, максимальная величина силы, приложенной к образцу ограничено, чтобы избежать гAmage к клеткам. Часть силовой кривой из точки В в точку С на рисунке 1, где кончик отступы в клетку, не благонадежен для модели Герца, чтобы извлечь клетки жесткость.

Рисунок 1
Рисунок 1. Иллюстрация AFM микроиндентирования и интерпретация кривой усилия. Верхней панели показано движение кантилевера АСМ обусловлен сканер пьезо. Вертикальное расположение консольные г и изгиба кантилевера сигнал г записывается в ходе процесса. Консольные начинается от точки, в несколько микрометров выше клетку. При приближении к клетке, δ образец отступа остается равным нулю, пока не достигнет точки В, где кончик входит в контакт с клеткой. Координаты точки B в сюжете критические значениядля анализа данных, обозначаемых (Z 0, D 0>). От В к С, кантилевер отступы в клетку до изгиба кантилевера не достигает заданного значения, которое установлено, что соотношение между целевой максимальный отступа силы и жесткости кантилевера. После отклонения сигнала достигает заданного максимального значения, консольные затем удаляется из клетки к точке D, где она часто вырваться вниз под зонд-образец адгезия, отделяется от клетки и возвращается на прежнее место при Е. На правой панели показана взаимосвязь между углублением и записанного г и г сигнала. В левой нижней панели представляет собой график кривой, силы, максимальный отступ консольные, из которых пружины измеряется быть 0.07N / м, установлен на уровне 17 нм так, чтобы максимальное отступов силы, приложенной к образец 1,2 NN. Ключевые места во время отступа будут отмечены.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Калибровка жесткость пружины кантилевера

  1. Загрузка кантилевера АСМ в соответствии с инструкциями производителя. Это необходимо очистить держатель зонда с этанолом перед любым экспериментов. Это поможет ограничить бактериальное загрязнение к культуре во время измерений АСМ.
  2. Калибровка InvOLS (обратное Чувствительность оптического рычага). Этот параметр описывает количество фотодиодов ответа (Вольт) на нанометр отклонений кантилевера.
  3. Загрузите чистое предметное стекло на предметный столик, а затем установить голову АСМ и отрегулируйте лазерного луча и приведение в соответствие с инструкциями производителя. Engage иглой АСМ на стекле.
  4. С пьезо отозвана, перестроить зеркало на фотодиод чтение -2 V. Выполните измерения силовой спектроскопии с точки запуска (максимальный отклик фотодиод) +2 В.
  5. С пьезо отозвана, перестроить зеркало на фотодиод чтение -2 V. Выполните FORCE спектроскопических измерений с точки запуска (максимальный отклик фотодиод) +2 В. Примечание: Значения напряжения здесь являются специфическими для Asylum АСМ. Это значение должно быть установлено в соответствии с инструкциями, предоставляемыми компанией производителем.
    После сбора данных завершена, увеличить, чтобы фирма-области контакта силовой кривой. Выполните линейной аппроксимации в этот регион, чтобы найти наклон, который будет в В / нм. Обратная этого значения описывает Светочувствительность консольно-фотодиод ансамбля.
  6. Сброс зеркало выравнивание к свободному отклонение 0 В.
  7. Калибровка жесткости кантилевера. Тепловой настройки метод используется для определения пружина кантилевера 28.
  8. После калибровки InvOLS, поднимите сканер от образца этапе такие, что нет взаимодействия между зондом и образцом.
  9. Начать захват тепловых данных. Во время этого процесса тепловой вибрации консоли луч RecordeD. Программное обеспечение АСМ анализирует спектр мощности такие тепловые вибрации и участки его в окне данных.
  10. Через несколько секунд сбора данных, выполните подходят к сегменту данных с центром в самой низкочастотной (основного резонанса) пик, чтобы определить жесткость пружины.

2. Загрузки образца

  1. Установить принадлежность Блюдо нагревателя на сцене AFM, если уже не оборудованы.
  2. Установите температуру до 37 ° С, и ждать в течение 20 мин для системы достичь стабильного теплового равновесия.
  3. Место культуры блюдо на сцене AFM и закрепите его с помощью хомута снабжены блюдо нагревателя. Важно, чтобы свести к минимуму времени между удалением блюдо из инкубатора и размещение его на стадии, чтобы избежать травм к клеткам. Для измерений более чем на 30 мин, CO 2 независимых среда должна быть использована для замены нормальной культуральной среде.
  4. Нанесите небольшое падение 37 ° C культуральной среде до кончика тОн АСМ кантилевера, и опустите голову АСМ, пока наконечник не просто погружен в жидкость.
  5. Используя вид сверху ПЗС-камеры, перестроить лазерного луча на кантилевер (выравнивание в жидкости будет иным, чем в воздухе, из-за изменения показателя преломления среды).
  6. Engage иглой АСМ на чистую площадь культуры блюдо.
  7. Выполнить калибровку InvOLS как описано выше, на кантилевер чувствительность в жидкой среде.

Примечание: а) если клетки культивируют на гидрогели, калибровка InvOLS должна быть выполнена заранее против нижней поверхности чашки для культивирования заполнены среды для культивирования клеток. При переключении на образцы клеток, особое внимание должно быть уделено не изменить выравнивание лазерного луча с кантилевера. б) InvOLS должен быть откалиброван всякий раз, когда происходит изменение в лазерном выравнивания. в) Кроме того, рекомендуется принимать InvOLS как среднее значение из нескольких калибровочных кривых, сосле каждой калибровки генерирует различные InvOLS. Изменение InvOLS, однако, мала по сравнению со средним значением. Например, калибровки Bruker DNP-10 кантилевер с жесткостью 0,06 Н / м в жидком в 100 раз производить среднее значение InvOLS 66,3 нм / В, со стандартным отклонением только 0,5 нм / В.

3. Сбор силовые кривые клеточной отступов

  1. Выберите ячейку для отступа. С помощью оптического микроскопа, перемещать этап в положение кантилевера выше ячейки так, чтобы кончик расположен в пери-ядер регионе. Точные регулировки консольном положении может быть осуществлено путем применения смещения к X и Y сканеров.
    Примечание: АСМ кантилевера должна быть снята с поверхности образца при перемещении предметного столика, чтобы выбрать клетку-мишень. Это защищает от консольной стук в образце, так как поверхности образца не может быть плоской.
  2. Переключитесь на режим силовой спектроскопии. Установить отступскорость в пределах 1-10 мкм / сек, достаточно низкой, чтобы избежать гидродинамический эффект.
  3. Установите точку отклонения триггера, который ограничивает максимальный отступ силы, чтобы избежать повреждения клеток. Выберите Относительная запуска вариант, который поправит любой дрейф в отклонении сигнала. Максимальное усилие 2 Nn является хорошей отправной точкой для большинства образцов. Эта величина, однако, должны быть скорректированы в соответствии с образцом жесткости. Для мягких образцов более низкое значение следует использовать, чтобы избежать чрезмерных отступов к образцу. Для жестких образцов высокого значения должны быть использованы для создания измеримых отступа.
  4. Установить сила расстояние, достаточно большое для того, чтобы наконечник будет полностью отделенный от клеточной между силой измерений. Как правило, сила расстояние установлено на 5 мкм.
  5. Управляйте AFM взять одну кривую силы.
  6. Собрать не менее трех кривых силы в разных местах в пери-ядер регионе каждой ячейки. Хотя это полезно для съемки несколькихкривые на каждой ячейке для надежных статистических данных, принимая слишком много графики сил может привести к изменениям в ячейке жесткости из-за стресса от зонда АСМ.
  7. При сборе данных завершена, снять наконечник, и повторите шаги 3.1-3.6 для столько ячеек, сколько необходимо для хороших статистических данных по сотовым жесткость при определенном условии образца. Как правило, клетки 30 измеряются для каждого состояния.

Для характеристики распределения жесткости в пределах одной ячейки, сила-карта режим применяется. В Force-режим карты, установить размер сканирования включить интересующей области; установить соответствующее разрешение, установить отступ параметры, как те, которые выбраны для одной кривой силы; AFM будет растровый через определенный пробной области и принять одно графики сил в каждом пикселе в образце регионе.

4. Анализ данных

Записанный графики сил, анализируются с помощью пользовательской процедуры MATLAB для расчета ячейки жесткости. Ниже приведено краткое описание процедуры MATLAB:

  1. Программа MATLAB идентифицирует контакт координаты точки z0 и D0 (см. рисунок 1) с использованием алгоритма, принятого из опубликованного метода Лина и др. 29.:
  2. Для каждой точки данных на силовой кривой, выполните линейной аппроксимации данных слева от точки интереса, и Герц модели подходят вправо (с использованием выбранной точки в качестве начальной точки соприкосновения), до множества максимальным отступом (200-300 нм рекомендуется).
  3. Для каждой точки, вычислить относительную погрешность RMS подходит как и подвести этих значений.
  4. Точка, которая достигает минимума общей монтажной ошибки выбрана в качестве начальной точки соприкосновения.
    Примечание: Время вычислений может быть уменьшена за счет реализации золотого сечения поиска, а не линейно сканирования всей кривой силы.
  5. Пример δ деформации и отступов силы F рассчитываются следующим образом:
    Уравнение 1
  6. Наименьших квадратов применяется, чтобы соответствовать F против δ данных в пост-контактной области, Z Z ≥ 0, в модели Герца, чтобы извлечь модуль Юнга, E ячейки:
    Уравнение 2
    , Где V является коэффициент Пуассона.
    Примечание: при δ составляет более 10% от толщины образца (высота ячейки), то измеренное клетки жесткость зависит от жесткости подложки. Толщина пери-ядерной области, как правило, порядка нескольких микрометров. Таким образом, только первые 200-300 нм F-кривой δ пригодно для модели Герца.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 2а три представителя силовые кривые взяты из фибробластов 3T3 культивировали на пластиковой поверхности, полиакриламидном геле модулей Юнга 3000 Па и 17000 Па соответственно. После тщательного выявления точек контакта в кривые, отступов силы как функция деформации ячейки представлена ​​на рис 2b. Под силу величины меньше, чем 0,3 Н.Н., пирамидальной формы кончика отступы 3 мкм в клетку культивируют на 3 полиакриламидном геле кПа. В противоположность этому, усилие более 1,6 нн требуется отступ 500 нм в клетки, выращенные на простой блюдо культуры с использованием тех же наконечник. Как видно из этого графика видно, что клетки, культивируемые на мягкий гель полиакриламида мягче, чем клетки, культивируемые на жесткое блюдо культивирования. Установка первого сегмента (δ <30 нм) силы δ кривые модели Герца дает модули Юнга из этих трех клеток, 10 кПа, 1,2 кПа и 1,10 кПа соответственно. Ячейки в культурноэлектронной блюдо в 100 раз жестче, чем клетки, культивируемые на полиакриламидном геле. Солон и соавт. Сообщали о подобных результатах 25. Они обнаружили, что фибробласты активно усилить свое цитоскелета, чтобы соответствовать жесткости подложки они придерживаются. Многие другие типы клеток, также сообщалось стать жесткими при культивировании на жесткой подложки 30.

Важно отметить, что выемка может вызвать пластическую деформацию в клетках, что приводит изломы, как показано на фиолетовый кривой. Как правило, такие кривые должны быть исключены из анализа данных. Однако кривая может быть использована для расчета ячейки жесткости, если излом за пределы Место данных. Например, излом фиолетовая кривая происходит примерно 400 нм. Эта кривая может все еще быть проанализированы посредством аппроксимации данных только до δ = 30 нм до модели Герца, получая значение жесткости 1,2 кПа. Важно также, чтобы отрегулировать "запуск точка" в соответствии с гоЖесткость электронной образца. Например, синий кривой берется из мягкой клетки культивировали на 3 полиакриламидном геле кПа. Установка относительно критического уровня отклонения в 5 нм, АСМ отступы 3 мкм в клетку. Такое большое углубление должно быть предотвращено во время измерений клетки жесткость, так как оно может привести к разрыву мембраны клетки и убивает клетку. Многие другие факторы, в том числе приобретение наконечник скорость и скорость передачи данных при приобретении кривой сила может влиять на качество приобретенной силы кривых и, следовательно, в результате жесткость ячеек 31. Чтобы надежных измерений необходимо настроить все эти параметры приобрести "чистый" сила кривые как красный кривой, показанной на фиг.2а, которая имеет плоскую до контакта с частью последующим нелинейным увеличением после контакта части.

Фиг.3а показывает флуоресценции изображение с 3Т3 фибробласты на блюдо культуре клеток. Клетку трансфицируют GFP виментину,тип промежуточных нитей. AFM Force-отображение была выполнена в этом 80 мкм на 80 мкм области, с разрешением 32 х 32 пикселей. Полученные показатели жесткости карта показана на рисунке 3b. Жесткость варьируется в зависимости от клетки. И, ламеллоподиума регионе более жесткая и более разнородны, чем пере-ядерной области, которая окружает жестким ядром.

Рисунок 2
Рисунок 2. Силовой кривой данных и проанализированы силы отступы кривой.) Набор из трех представителей силовой кривой данные, полученные для фибробластов 3T3 культивировали на стекле (красный), 17 кПа полиакриламидном геле (фиолетовый), и 3 кПа полиакриламидном геле (синий). Кривые сдвинуты так, что контактные точки (г 0, 0 г) расположена в начале координат (0,0) координатсистемы. б) отступ силы кривые, рассчитанные) и установка отступа данных в модели Герца, используя только первые 300 нм отступов. Вставка в B) показывает степень соответствия на модели Герца для первых 300 нм отступа; кругах имеются экспериментальные данные, линии представляют нужным данным. Динамическая жесткость кантилевера 0,062 Н / м в этом случае.

Рисунок 3
Рисунок 3. а) флуоресценции изображение фибробластов 3T3, трансфицированных GFP виментину. только часть клетки показано на изображении. Шкала бар составляет 20 мкм. Б) 32 х 32 пикселя жесткости карту той же площади. Каждый пиксель представляет 2,5 мкм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Метод АСМ углубление имеет преимущества, чтобы охарактеризовать механические свойства живых клеток. Хотя и менее чувствительны, чем магнитные цитометрии скручивания и оптический пинцет, который может измерить силы на уровне piconewton 32, АСМ может обнаружить силы сопротивления из образцов от десятков пико-Ньютона до сотен нано-Newton, сопоставимый с Диапазон силы, которая могут быть применены к клеткам с помощью микропипетки 19. Этот диапазон силы отвечает потребностям создание значительных деформаций во всех типах клеток 19. Высокое пространственное разрешение позволяет характеризовать на уровне субмикронных неоднородностей в тканях и в пределах одной клетки 33. Это также позволяет реального времени на измерение ячейки. Некоторые модели АСМ предназначен для биологических образцов может работать в жидкой среде и оснащены подогревом стадии образца, что обеспечивает точный контроль температуры, что делает возможным поддержание физиологического окружающейсреды для живых клеток в процессе измерений. АСМ отступа был успешно применен для измерения механических свойств диапазон типов клеток, 25,34-36 и широко используется для оценки изменения механических свойств клеток, связанный с клеточной дифференцировки и в различных контекстах больного. 30,37

Важным этапом рассчитать жесткость от силы кривая является определение точки, в которой кончик первой вступает в контакт с клеткой. Неопределенность в точке контакта может повлиять на модуль упругости 31. Для жестких материалов, отклонение сигнала резко возрастает после контакта зонд-образец, и точкой контакта легко определить как поворотный момент в кривыми. Такой резкий поворотный момент, однако, часто не появляется в силу-кривые из клеток, в связи с низкой жесткостью ячейки (см. рисунок 2). Код MATLAB разработан точно найти точки контакта в силу кривыхиз мягких образцов с использованием алгоритма, предложенного Лин и др.. +29 кода может справиться с силой кривые из мягких образцов, что позволяет автоматизировать процесс анализа данных путем автоматического поиска точки контакта и установка отступов данные модели Герца. Код MATLAB применяется для определения точек контакта в 60 сила кривыми на том же месте в полиакриламидном геле, из которых была мерой жесткости равным 7,2 кПа, при объемной реологических измерений. Код обнаружен контактные пункты в этих кривых. Диапазон изменения положения точки контакта меньше, чем 15 нм. На основе этих точках контакта, рассчитанного среднего жесткость 6,9 кПа, стандартное отклонение составляет 0,2 кПа, а максимальный диапазон изменения 0,6 кПа. Результаты этого эксперимента обеспечить меры для оценки погрешности измерения жесткость. 15 нм неопределенность в результатах точке контакта в неопределенности жесткость, которая составляет менее 10% от среднего ценныеé. Для мягкие гели с очень низким уровнем отклонение сигнала, неопределенность в точке контакта может быть выше, чем 30 нм, что приводит к неопределенности жесткость выше, чем 30%. Код доступен в качестве дополнения к этой статье.

АСМ может надежно измерять жесткость в диапазоне от менее чем 100 Па до 10 6 Па, охватывающих диапазон жесткости для большинства тканей и клеток. Для надежного измерения, важно, чтобы выбрать кантилеверов АСМ с константы пружины хорошо подобраны к образцу жесткости. Когда кантилевер является слишком жестким, его отклонение слишком мала, чтобы обнаружить и это может повредить клетки; если кантилевер является слишком мягким, он не отступа ячейки достаточно получить надежные свойства материала и его тепловых колебаний может доминировать в силу кривой. Консолей 0,06 Н / м с пирамидой наконечник применимы для большинства типов клеток, культивируемых на жесткой блюда культуры. Эти консолей, однако, не применимы для измерения клетки, культивируемые намягких субстратах. Как показано на фиг.2, клетки культивировали на 3000 полиакриламидном геле Па настолько мягкий, что 3 мкм отступа требуется, чтобы генерировать 5 нм отклонение в кантилевера. Кривая силы настолько плоским, что существует очень мало разницы между предварительного контакта и пост-контактной области. Это приводит к большой неопределенности в точке контакта и, следовательно, результирующие значения жесткости. Использование более мягкого консольные лишь незначительно улучшает контраст между предварительного контакта и после контакта регионах. Для измерения таких мягких материалов, с большими консолями сферическим наконечником рекомендуется. 0,06 Н / м консольные с шаровым наконечником 10 мкм в диаметре может быть применен для измерения образцов с жесткостью ниже 100 Па Консоли со сферическим наконечником коммерчески доступны от многих поставщиков. Они могут также быть выполнена на заказ путем склеивания микросферы tipless консолей. Сферический советы обеспечивают больший отклонение сигнала и предотвратить повреждение клеточных мембран. However, они не применимы для высокого разрешения жесткости отображение из-за их большой площади контакта с клетками. таблице 1 приведен список зондов для АСМ рекомендуется для измерений ячейки жесткости.

Модель Жесткость пружины (Н / м) Тип кончика Радиус закругления (нм)
Bruker DNP10-D 0,06 Пирамида 20
Bruker MLCT-B/C/E 0.01/0.02/0.03 Пирамида 20
Novascan PT.GS 0.01/0.03/0.06 Стеклянный шар 2000/5000/10000
Novascan PT.PS 0.01/0.03/0.06 Полистирол сферы 1000/4500/10000

Таблица 1. СебеЛекция зондов для АСМ с действующим постоянной весны и геометрии зонда для сотовых отступа.

Ограничения представлены методы должны быть также помечены. Модели Герца, который был применен, чтобы соответствовать отступы данные упрощенной модели. Он прогнозирует силы отступы отношения бесконечно малых углублений чисто упругого материалов осесимметричных инденторами. Некоторые из допущения модели Герца, не применяются к ячейке отступа.

Модель предполагает, Hertz и однородной линейно-упругого материала, в то время как клетки неоднородна (см. Рисунок 3) и нелинейно-упругого. В ламеллоподиума региона, она достаточно неоднородно из-за неоднородности структуры цитоскелета актина. Механическая жесткость ячейки Сообщается как средняя жесткость извлечены из трех или более силовые кривые получены из относительно однородных перинуклеарные региона. 25,36 Восстановленные NetworKS актина и промежуточных филаментов штаммозависимы жесткости материалов, то есть они более жесткие, при больших деформациях. 38,39 Такое нелинейной упругости наблюдается уже живых клетках, но не учитываются в модели Герца. Чтобы ограничить влияние нелинейной упругости по сообщениям о клетке жесткость, только первые 300 нм отпечатка данных пригодно для модели Герца.

Кроме того, предполагается в модели Герца, что материалы являются чисто упругими. Тем не менее, клетки и их цитоскелета вязкоупругих материалов с жесткостью зависит от времени шкалы измерений. При коротком временном масштабе, изгиба кантилевера в основном происходит от упругой реакции клеток. При длительном масштабе времени, однако, образец ползает и дает более мягкий ответ. Временной масштаб отступа AFM контролируется скорость наконечника. Следовательно, наблюдаемые различия в ячейке жесткости имеет смысл только когда сила кривые приобретаются с тем же отступом Veloгорода. Для количественного извлечения зависит от частоты вязкоупругость клеток, АСМ "модуляции силы" метод был разработан с применением высоких частот малых колебаний амплитудой на большие отступы 21,27.

Предположение о бесконечной толщины образца в модели Герца не применяется для клеток. Клетки, как правило, несколько микрон в околоядерной региона, а несколько сотен нанометров в регионе ламели. Были внесены коррективы для учета конечной толщины образца. 31,40 Данные, полученные от силы-отображение содержит как отступы данных и высоту ячейки. Местное толщина образца может быть вычислен из данных о высоте. Будущие работы, необходимые для осуществления корректировки толщины образца при анализе силы для отображения данных.

Таким образом, этот документ представляет собой протокол для характеристики механической жесткостью жизни клеток с использованием Asylum MFP3D-Bio атомные силы микрoscope. Принципы работы АСМ, а также анализа данных MATLAB процедуры применимы ко всем другим моделям АСМ. В последние годы, оптическая микроскопия, включая светлое поле, конфокальной микроскопии и полного внутреннего отражения флуоресцентной микроскопии (TIRF) были объединены с АСМ в режиме реального времени визуализации клеток к механическим раздражителям. 41,42 Эти установки также позволяет одновременное измерение ячейку механика и визуализация компонентов цитоскелета. Сопоставление локальных данных жесткость распределения локальных компоненты цитоскелета обеспечит полезной информации о том, как компоненты цитоскелета вклад в клетке механики.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Авторы благодарят доктора Пола Janmey в Университете Пенсильвании за предоставление клеточные линии, используемые в работе. КЯ также признать JF Байфилд и Эван Андерсон за их проницательный обсуждения методов АСМ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atomic Force Microscope Asylum Research MFP3D-BIO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  2. Wagner, O. I., et al. Softness, strength and self-repair in intermediate filament networks. Exp. Cell Res. 313, 2228-2235 (2007).
  3. Wang, N., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 7765-7770 (2001).
  4. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282, 606-616 (2002).
  5. Kasza, K. E., et al. Filamin A is essential for active cell stiffening but not passive stiffening under external force. Biophysical Journal. 96, 4326-4335 (2009).
  6. Elson, E. L. Cellular mechanics as an indicator of cytoskeletal structure and function. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 397-430 (1988).
  7. Schafer, A., Radmacher, M. Influence of myosin II activity on stiffness of fibroblast cells. Acta Biomaterialia. 1, 273-280 (2005).
  8. Guck, J., et al. Optical deformability as an inherent cell marker for testing malignant transformation and metastatic competence. Biophysical Journal. 88, 3689-3698 (2005).
  9. Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2, 780-783 (2007).
  10. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nature Nanotechnology. 7, 757-765 (2012).
  11. Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study. Biophysical Journal. 78 (00), 520-535 (2000).
  12. Cross, S. E., Jin, Y. S., Lu, Q. Y., Rao, J., Gimzewski, J. K. Green tea extract selectively targets nanomechanics of live metastatic cancer cells. Nanotechnology. 22, 215101 (2011).
  13. Hoffman, B. D., Crocker, J. C. Cell mechanics: dissecting the physical responses of cells to force. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 259-288 (2009).
  14. Hoffman, B. D., Massiera, G., Van Citters, K. M., Crocker, J. C. The consensus mechanics of cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10259-10264 (2006).
  15. Lau, A. W., Hoffman, B. D., Davies, A., Crocker, J. C., Lubensky, T. C. Microrheology, stress fluctuations, and active behavior of living cells. Physical Review Letters. 91, 198101 (1981).
  16. Liu, J., et al. Microrheology probes length scale dependent rheology. Physical Review Letters. 96, 118104 (2006).
  17. Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5, 636-640 (2006).
  18. Oh, M. J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness. J. Vis. Exp. (67), e3886 (2012).
  19. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of Biomechanics. 33, 15-22 (2000).
  20. Levental, I., et al. A simple indentation device for measuring micrometer-scale tissue stiffness. J. Phys-Condens. Mat. 22, (2010).
  21. Mahaffy, R. E., Park, S., Gerde, E., Kas, J., Shih, C. K. Quantitative analysis of the viscoelastic properties of thin regions of fibroblasts using atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86, 1777-1793 (2004).
  22. Radmacher, M. Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine: The Quarterly Magazine of the Engineering in Medicine & Biology Society. 16, 47-57 (1997).
  23. Crocker, J. C., Hoffman, B. D. Multiple-particle tracking and two-point microrheology in cells. Methods in Cell Biology. 83, 141-178 (2007).
  24. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. J. Vis. Exp. (54), e2911 (2011).
  25. Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophysical Journal. 93, 4453-4461 (2007).
  26. Wu, H. W., Kuhn, T., Moy, V. T. Mechanical properties of l929 cells measured by atomic force microscopy: Effects of anticytoskeletal drugs and membrane crosslinking. Scanning. 20, 389-397 (1998).
  27. Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophysical Journal. 70, 556-567 (1996).
  28. Levy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13, 33-37 (2002).
  29. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129, 430-440 (2007).
  30. Davis, J. T., Wen, Q., Janmey, P. A., Otteson, D. C., Foster, W. J. Muller cell expression of genes implicated in proliferative vitreoretinopathy is influenced by substrate elastic modulus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3014-3019 (2012).
  31. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: Measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Method Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  32. Lele, T. P., et al. Tools to study cell mechanics and mechanotransduction. Methods in Cell Biology. 83 (07), 443-472 (2007).
  33. A-Hassan, E., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74, 1564-1578 (1998).
  34. Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. Non-Hertzian approach to analyzing mechanical properties of endothelial cells probed by atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128, 176-184 (2006).
  35. Xiong, Y., Lee, A. C., Suter, D. M., Lee, G. U. Topography and nanomechanics of live neuronal growth cones analyzed by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 96, 5060-5072 (2009).
  36. Byfield, F. J., et al. Absence of filamin A prevents cells from responding to stiffness gradients on gels coated with collagen but not fibronectin. Biophysical Journal. 96, 5095-5102 (2009).
  37. Cross, S. E., et al. AFM-based analysis of human metastatic cancer cells. Nanotechnology. 19, 384003 (2008).
  38. Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
  39. Wen, Q., Janmey, P. A. Polymer physics of the cytoskeleton. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 15, 177-182 (2011).
  40. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (02), 2798-2810 (2002).
  41. Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J. Vis. Exp. (44), e2072 (2010).
  42. Lim, S. M., Kreipe, B. A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells. Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).

Tags

Биофизики выпуск 76 биоинженерии клеточной биологии молекулярной биологии физики химической технологии биомеханика биоинженерии (общий) AFM сотовые жесткость микроиндентирования силовой спектроскопии атомно-силовая микроскопия микроскопия
Измерение механических свойств живых клеток с помощью атомно-силовой микроскопии
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, G., Burnham, N. A.,… More

Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50497, doi:10.3791/50497 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter