Måling af mekaniske egenskaber af levende celler bruge Atomic Force Microscopy

Summary

Dette papir viser en protokol til at karakterisere de mekaniske egenskaber af levende celler ved hjælp af microindentation hjælp af en Atomic Force Microscope (AFM).

Abstract

Mekaniske egenskaber af celler og ekstracellulær matrix (ECM) spiller en vigtig rolle i mange biologiske processer, herunder stamceller differentiering, tumordannelse og sårheling. Ændringer i stivhed af celler og ECM er ofte tegn på ændringer i celle fysiologi eller sygdomme i væv. Derfor celle stivhed er et indeks for at vurdere forløbet af cellekulturer. Blandt de mange metoder, der anvendes til at måle stivheden af ​​celler og væv, giver mikro-indrykning ved hjælp af en Atomic Force Microscope (AFM) en måde at pålideligt måle stivheden af ​​levende celler. Denne metode har været almindeligt anvendt til at karakterisere mikroskala stivhed for en række forskellige materialer lige fra metaloverflader til blødt biologisk væv og celler. Det grundlæggende princip i denne metode er at indrykke en celle med en AFM spids valgte geometri og måle den påførte kraft fra bøjning af AFM cantilever. Montering af kraft-indrykning kurve til Hertz tilstandl for den tilsvarende spids geometri kan give kvantitative målinger af materiale stivhed. Dette papir viser proceduren for at karakterisere stivhed levende celler ved hjælp AFM. Vigtige trin, herunder processen med AFM kalibrering, force-kurve erhvervelse og dataanalyse ved hjælp af en Matlab rutine er påvist. Begrænsninger af denne metode er også drøftet.

Introduction

Mekaniske egenskaber, især stivhed, af individuelle celler og deres omgivende ekstracellulære matricer (ECM) er kritisk for mange biologiske processer, herunder cellevækst, motilitet, division, differentiering og vævshomeostase. ^1. Det er blevet påvist, at celle mekanisk stivhed hovedsageligt bestemmes af cytoskelettet, især netværk af actin og intermediære filamenter og andre proteiner forbundet med dem. ² Resultater fra mekaniske tests på in vitro netværk af actin og intermediære filamenter tyder på, at den celle mekanik er i høj grad afhængig af cytoskeletal struktur og pre-stress i cytoskelettet. ^3-5 Stivhed af levende celler er derefter betragtes som et indeks til at evaluere cytoskeletal struktur ^6, myosin aktivitet ⁷ og mange andre cellulære processer. Endnu vigtigere er ændringer i celle mekaniske egenskaber også ofte anset for at være tæt associeretbundet med forskellige sygdomstilstande såsom tumor dannelse og metastase ^8-10 Overvågning den mekaniske stivhed levende celler kan derfor tilvejebringe en ny måde at overvåge celle fysiologi,. at opdage og diagnosticere sygdomme ^8,. og vurdere effektiviteten af medicinsk behandling ^{11 , 12}

Flere metoder, herunder partikel-sporing microrheology, ^13-16 magnetisk vridning cytometri, ¹⁷ mikropipette aspiration ^18,19 og microindentation ^20-22 er blevet udviklet til at måle elasticiteten af cellerne. Partikel sporing microrheology sporer termiske vibrationer enten submikrone fluorescerende partikler injiceret ind i celler eller referencemærker markører inde i cellen cytoskeleton. ^23. Elastiske og tyktflydende egenskaber af celler beregnes ud fra de målte partikel forskydninger ved hjælp af udsving-dissipation teorem. ^14,23 Denne metode giver samtidige målinger af lokalmekaniske egenskaber med høj rumlig opløsning på forskellige steder i en celle. Dog kan injicere fluorescerende partikler i celler føre til ændringer i cellefunktion, cytoskeleton struktur og dermed Cellemekanik. Mikropipette aspiration metode gælder undertryk i en mikropipette med en diameter fra 1 til 5 m til at suge et lille stykke af cellemembranen ind i pipetten. Celle stivhed beregnes ud fra den anvendte undertryk og cellemembran deformation. ^18. Denne fremgangsmåde kan imidlertid ikke detektere heterogen fordeling af stivhed over cellen. Magnetisk vride cytometri (MTC) gælder magnetfelt til at generere drejningsmoment på super paramagnetiske kugler knyttet til cellemembranen. ^17. Cell stivhed er afledt i denne fremgangsmåde fra forholdet mellem den påførte drejningsmoment og vride deformation af cellemembranen. Det er vanskeligt at styre placeringen af ​​magnetiske perler i MTC metoden, og det er også challenging at karakterisere vride deformation med høj opløsning. Microindentation anvender en indrykning med veldefineret geometri at punch ind i cellen. Den indrykke kraft, og den resulterende indrykning i celler ofte følger forudsigelsen af ​​Hertz model. Youngs moduli af celler kan beregnes ud fra kraft-indrykning kurver ved at montere dem til Hertz model. Denne metode har været almindeligt anvendt til at teste de mekaniske egenskaber af væv og celler på trods af dens begrænsninger såsom usikkerhed i kontakt bestemmelse, anvendeligheden af ​​Hertz-modellen, og potentialet fysisk skade cellerne. Blandt de mange enheder til microindentaion ²⁰ er Atomic Force Microscope (AFM) kommercielt tilgængelige og har været almindeligt anvendt til at karakterisere mekaniske egenskaber af levende celler og væv ^21,24-27.

Dette papir viser proceduren for anvendelse af en asyl MFP3D-Bio AFM til at karakterisere celle mekanik. AFM ikke påly giver høj opløsning topografi af celler, men også har været almindeligt anvendt til at karakterisere de mekaniske egenskaber af vævsceller. Princippet om AFM indrykning er illustreret i figur 1.. AFM cantilever nærmer cellen fra nogle få mikrometer ovenfor; kommer i kontakt med cellen, led cellen, således at cantilever nedbøjningen når et forvalgt setpunkt, og trækker sig væk fra cellen. Under denne proces cantilever afbøjningen registreres som en funktion af dens placering som vist i figur 1.. Før du foretager kontakt med cellen, bevæger cantilever i mediet uden nogen tilsyneladende afbøjning. Når indrykning på cellen, cantilever bøjninger og afbøjning signal stiger. Køreledningsophæng er modelleret som elastiske bjælker, så deres afbøjning er proportional med den kraft, der påføres cellen. Ved at indstille den maksimale cantilever afbøjning, er den maksimale størrelse af kraft, der påføres prøven begrænset for at undgå dAmage til celler. Den del af den kraft, kurve fra punkt b til punkt C i figur 1, hvor spidsen led ind i cellen, er egnet til den hertz model til at udtrække cellen stivhed.

Figur 1. Illustration af AFM microindentation og fortolkning af kraftkurve. Det øverste panel viser bevægelsen af AFM cantilever drevet af piezo scanneren. Den lodrette placering af fritbærende z og cantilever afbøjning signalet d registreres under processen. Cantilever starter fra punkt a, nogle få mikrometer over cellen. Mens nærmer cellen, prøven indrykning δ forbliver nul, indtil den når punkt B, hvor spidsen kommer i kontakt med cellen. Koordinaterne for punkt B i plottet er kritiske værdiertil dataanalyse, der betegnes med (z _0, d _0>). Fra B til C, indtil cantilever led ind i cellen cantilever nedbøjningen når et sæt punkt, som er indstillet til at være forholdet mellem den tilsigtede maksimale indrykning kraft og cantilever fjederkonstant. Når udbøjningen signalet når den indstillede maksimale værdi, cantilever trækkes derefter tilbage fra cellen til punkt D, hvor det ofte trækkes nedad på grund af spids-prøve vedhæftning, frigøres fra cellen og vender tilbage til sin oprindelige placering på e. Højre panel illustrerer forholdet mellem fordybningen og den optagne z og d signal. I den nederste venstre panel er en afbildning af en repræsentativ kraft kurve, den maksimale indrykning af en fritbærende, hvoraf fjederkonstanten måles til at være 0.07N / m, er indstillet til at være 17 nm, således at den maksimale indrykning kraft, der udøves prøve er 1,2 nN. De vigtigste steder under indrykningen er markeret.

Protocol

1.. Kalibrer fjederkonstanten for Cantilever

1. Indlæse cantilever i AFM henhold til producentens anvisninger. Det er nødvendigt at rense cantilever holderen med ethanol før eventuelle eksperimenter. Dette vil medvirke til at begrænse bakteriel forurening til kultur under AFM målinger.
2. Kalibrer InvOLS (Inverse Optical Lever følsomhed). Dette parameter beskriver den mængde fotodiode reaktion (volt) pr nanometer af cantilever afbøjning.
3. Indlæse en rent objektglas ned på prøven scenen, derefter installere AFM hoved og justere laserstrålen og tilpasning i henhold til producentens anvisninger. Engager AFM tip på objektglas.
4. Med piezo trukket tilbage, justere spejlet til en fotodiode læsning af -2 V. Udfør en kraft spektroskopi måling med en trigger point (maksimum fotodiode respons) på +2 V.
5. Med piezo trukket tilbage, justere spejlet til en fotodiode læsning af -2 V. Udfør en foRCE spektroskopi måling med en trigger point (maksimum fotodiode respons) på +2 V. Note: Spændingsværdierne her er specifikke for Asyl AFM. Denne værdi skal indstilles i henhold til de specifikationer, som producenten.
   Efter datafangst er færdig, zoome ind til virksomheden-kontakt region af force kurven. Udfør en lineær tilpasning til denne region for at finde den hældning, som vil være i V / nm. Den gensidige af denne værdi beskriver den optiske følsomhed cantilever-fotodiode ensemble.
6. Nulstil spejlet tilpasningen til en gratis afbøjning af 0 V.
7. Kalibrer cantilever fjederkonstanten. En termisk-tune metode anvendes til at bestemme fjederkonstanten af armen ^28..
8. Efter kalibrering af InvOLS, hæve scanneren væk fra prøven scenen sådan, at der ikke er nogen interaktion mellem spidsen og prøven.
9. Begynde at optage termiske data. Under denne proces, er den termiske vibration af udliggerbjælke recorded.. AFM software analyserer en power spektrum af en sådan termisk vibration og plots det i en data-vinduet.
10. Efter et par sekunder af dataopsamling, udføre en tilpasning til data segment centreret ved den laveste frekvens (grundresonans) peak at bestemme fjederkonstanten.

2.. Ilægning af Sample

1. Installer Dish Heater tilbehør på AFM scenen, hvis de ikke allerede er udstyret.
2. Indstil temperaturen til 37 ° C, og vent i 20 minutter for at systemet kan nå en stabil termisk ligevægt.
3. Placer dyrkningsskålen på AFM scenen og fastgør den ved hjælp af klemmen forsynet med skålen varmelegeme. Det er vigtigt at minimere tiden mellem fjernelse af skålen fra inkubatoren og placere den på scenen, for at undgå traumer til cellerne. For målinger længere end 30 minutter, bør CO ₂ uafhængige medie anvendes til at erstatte den normale dyrkningsmedium.
4. Påfør en lille dråbe på 37 ° C dyrkningsmedium til spidsen af ​​tHan AFM cantilever, og sænk AFM hovedet indtil spidsen netop er nedsænket i væske.
5. Brug af ovenfra CCD kamera, laserstrålen justere på cantilever (tilpasningen i væsken vil være anderledes end i luften på grund af ændringen i brydningsindeks af mediet).
6. Engager AFM tip om et rent område af kulturen parabol.
7. Udføre kalibrering af InvOLS som beskrevet ovenfor, for cantilever følsomhed i flydende miljø.

Bemærk: a) Hvis celler dyrkes på hydrogeler, bør kalibreringen af InvOLS udføres på forhånd mod bundfladen af en kultur fad fyldt med cellekulturmedier. Når du skifter til celleprøver, særlig opmærksomhed skal rettes mod ikke ændre laserstrålen tilpasningen til cantilever. b) InvOLS skal kalibreres, når der er en ændring i laserjusteringssystem. c) Det er også anbefales at tage InvOLS som gennemsnittet af værdien fra flere kalibreringskurver, siden hver kalibrering genererer en anden InvOLS. Variationen i InvOLS er dog lille sammenlignet med den gennemsnitlige værdi. For eksempel, en Bruker DNP-10 cantilever kalibrering med fjederkonstant 0,06 N / m i væsken ved 100 gange frembringe en gennemsnitlig InvOLS værdi af 66,3 nm / V, med standardafvigelse på kun 0,5 nm / V.

3.. Indsamling Tving Kurver for Cell indrykning

1. Vælg en celle for indrykning. Ved hjælp af det optiske mikroskop, flytte scenen at placere cantilever over cellen, således at spidsen ligger i peri-kerner region. Præcis justering af cantilever stilling kan opnås ved at anvende forskydninger i X-og Y-scannere.
   Bemærk: AFM cantilever skal trækkes tilbage fra prøven overfladen, mens du flytter prøven scenen for at vælge et mål celle. Dette beskytter cantilever fra banker i prøven, fordi prøven overfladen måske ikke flad.
2. Skift force spektroskopi mode. Indstil indrykningsats inden for området 1-10 um / sek, lav nok til at undgå hydrodynamiske virkninger.
3. Indstil deformation tærskelværdi, som begrænser den maksimale indrykning kraft for at undgå skader på celler. Vælg Relativ udløser mulighed, som vil korrigere for enhver tendens i nedbøjning signal. En maksimal kraft 2. nN er et godt udgangspunkt for de fleste prøver. Denne værdi, bør imidlertid tilpasses efter prøven stivhed. For bløde prøver en lavere værdi bør anvendes for at undgå overdreven indrykning til prøven. For stive prøver en høj værdi bør anvendes til at generere målbar indrykning.
4. Indstil kraft afstand stor nok til at sikre, at spidsen vil være fuldt adskilt fra cellen mellem kraftmålinger. Normalt er den kraft afstand sat til 5 um.
5. Kommandere AFM til at tage en enkelt kraft kurve.
6. Saml mindst tre force kurver på forskellige steder i peri-kerner region af hver celle. Selv om det er gavnligt at tage flerekurver på hver celle for pålidelige statistiske data, idet alt for mange kræfter kurver kan føre til ændringer i celle stivhed på grund af stress fra AFM sonden.
7. Når dataindsamlingen er færdig, trækker spidsen, og gentag trin 3,1-3,6 for så mange celler som er nødvendig for gode statistiske oplysninger om celle stivhed under en vis prøve tilstand. Normalt er 30 celler måles for hver betingelse.

At karakterisere fordelingen af ​​stivhed i en enkelt celle, er force-kortfunktion anvendt. I Force-map, indstille en scanning størrelse at omfatte regionen interesse fastsætte en passende beslutning; indstille indrykning parametre som dem, der udvælges til enkelt kraft kurver, AFM vil derefter raster over definerede prøve området og tage en enkelt kraft kurver ved hver pixel i prøven regionen.

4.. Dataanalyse

De indspillede force kurver er analyseret ved hjælp af en brugerdefineret MATLAB proceduren for beregning af cellen stivhed. Det følgende er en kortfattet beskrivelse af MATLAB procedure:

1. MATLAB-programmet identificerer kontaktpunktet koordinerer z0 og d0 (se figur 1) ved hjælp af en algoritme adopteret fra en offentliggjort metode Lin et al ^29..:
2. For hvert datapunkt i kraft kurve, udføre en lineær fit af data til venstre for punktet af interesse, og et Hertz model passer til højre (med den valgte punkt som det første punkt i kontakt), til den indstillede maksimal indrykning (200-300 nm anbefales).
3. For hvert punkt, beregne den relative RMS fejl af både krampeanfald og opsummere disse værdier.
4. Det punkt, der opnår den mindste samlede fitting fejl er valgt som den første kontaktpunkt.
   Bemærk: Computation tid kan reduceres ved at implementere en gylden-sektion søgning snarere end lineært scanne hele kraftkurve.
5. Sample deformation δ og indrykke kraft F, beregnes som:
   
6. En mindste kvadraters montering påføres sætte F vs δ data i post-kontakt region, z ≥ z ₀ til Hertz model til at udtrække Youngs modul, E af cellen:
   
   , Hvor v er Poissons forhold.
   Bemærk: Når δ er mere end 10% af prøven tykkelse (cellehøjden) er den målte celle stivhed påvirkes af underlaget stivhed. Tykkelsen af ​​peri-nukleare region er normalt i størrelsesordenen nogle få mikrometer. Derfor er kun de første 200-300 nm af F-δ kurve passer til Hertz model.

Representative Results

2a viser tre repræsentative force kurver taget fra 3T3 fibroblaster dyrket på plastic overflade polyakrylamidgel af Youngs moduli 3.000 Pa og 17.000 Pa, hhv. Efter omhyggeligt at identificere de kontaktpunkter i kurverne, er indrykning kraft som funktion af celle deformation afbildet i figur 2b. Under en kraft størrelsesorden mindre end 0,3 nN, et pyramideform tip led 3 mikrometer i en celle dyrket på en 3 kPa polyacrylamidgel. I modsætning hertil er en kraft mere end 1,6 nN kræves til led 500 nanometer i cellen dyrket på almindelig dyrkningsskål med samme spids. Det fremgår klart af denne graf, at cellen dyrket på blød polyacrylamidgel er blødere end den celle dyrket på den stive dyrkning skålen. Montering af første segment (δ <30 nm) af kraft-δ kurver til Hertz-modellen giver Youngs moduli af disse tre celler som 10 kPa, 1,2 kPa og 1,10 kPa hhv. Celler på kultue skålen er 100 gange stivere end celler dyrket på polyacrylamidgeler. Solon et al. Har rapporteret lignende resultater ^25. De fandt, at fibroblaster aktivt stivne deres cytoskeletons at matche stivheden af ​​substrater de tilslutter sig. Mange andre celletyper er også blevet rapporteret at blive stivere ved dyrkning på stivere substrater ^30.

Det er vigtigt at bemærke, at fordybningen kan forårsage plastisk deformation i celler, hvilket resulterer knæk som illustreret i lilla kurve. Normalt bør sådanne kurver udelukkes fra dataanalyse. Dog kan kurven stadig bruges til at beregne celle stivhed hvis knækket er ud over området for montering data. For eksempel opstår knæk på lilla kurve ved cirka 400 nm. Denne kurve kan stadig analyseres ved tilpasning af dataene kun op til δ = 30 nm til Hertz model til opnåelse af en stivhed værdi på 1,2 kPa. Det er også vigtigt at justere "udløsende punkt" ifølge the prøve stivhed. For eksempel er den blå kurve taget fra en blød celle dyrket på en 3 kPa polyacrylamidgel. Indstilling af den relative afbøjning trigger punkt 5 nm, AFM tip indrykninger 3 mikrometer ind i cellen. Sådan en stor indskæring bør forhindres i cellen stivhed målingerne, da det kan briste cellemembranen og dræbe cellen. Mange andre faktorer, herunder tip hastighed og dataopsamling sats i kraft kurven købet kan påvirke kvaliteten af erhvervede kraft kurver og dermed den resulterende stivhed af celler ^31. Foretage pålidelige målinger er det nødvendigt at justere alle disse parametre for at erhverve "rene" force kurver som den røde kurve er vist i figur 2a, som har en flad præ-kontakt del efterfulgt af en lineær stigende efter-kontaktdel.

3a viser et fluorescens billede fra en 3T3 fibroblast på en celledyrkningsskål. Cellen er transficeret med GFP vimentin,en type af intermediære filamenter. AFM Force-mapping er blevet udført i denne 80 um med 80 um området, med en opløsning på 32 x 32 pixels. Den resulterende stivhed kort er vist i figur 3b. Stivheden varierer over cellen. Og den lamellipodium regionen er stivere og mere heterogen end den peri-nukleare region, der omgiver den stive kerne.

Figur 2. Kraftkurve data og den analyserede force-indrykning kurve. A) Et sæt på tre repræsentative kraftkurve data erhvervet til 3T3 fibroblaster dyrket på glas (rød), 17 kPa polyakrylamidgel (lilla) og 3 kPa polyakrylamidgel (blå). Kurverne er flyttet, så kontakt (z _0, d ₀₎ er placeret på oprindelsen (0,0) af koordinatsystemetsystem. b) indrykning-force kurver beregnet af a) og montering af de indrykning data til Hertz model kun at bruge de første 300 nm indrykning. Indsat i b) viser goodness of fit til Hertz model for de første 300 nm af indrykning, cirkler er eksperimentelle data linjer repræsenterer fit data. Fjederkonstanten for cantilever er 0.062 N / m i dette tilfælde.

Figur 3. a) Fluorescens billede af en 3T3-fibroblast transficeret med GFP vimentin. Kun en del af cellen er vist på billedet. Målestokken repræsenterer 20 um. B) En 32 x 32 pixel stivhed kort over det samme område. Hver pixel repræsenterer 2,5 um.

Discussion

AFM indrykning metode har fordele ved at karakterisere mekaniske egenskaber af levende celler. Omend mindre følsomme end den magnetiske vride cytometri og optisk pincet, der kan måle kræfterne på piconewton level ^32, kan AFM detektere modstanden kraft fra prøver spænder fra snesevis af pico-Newton til hundredvis af nano-Newton, der kan sammenlignes med spænde af kraft, kan anvendes til celler ved hjælp af en mikropipette ^19.. Denne serie af force passer til de behov for at skabe målbare deformationer i alle typer af celler ^19. Den høje rumlige opløsning gør det muligt at karakterisere på submicron plan heterogeniteter i væv og inden for de enkelte celler ^33. Det giver også real-time levende celle målinger. Adskillige AFM modeller designet til biologiske prøver kan fungere i et flydende miljø og er udstyret med opvarmede prøve etaper, som giver præcis temperaturstyring, hvilket gør det muligt at opretholde et fysiologisk miljøjøet for levende celler under målingerne. AFM indrykning er blevet anvendt til måling af mekaniske egenskaber af en række celletyper, ^25,34-36 og har været anvendt i udstrakt grad til at vurdere ændringer i mekaniske egenskaber af celler i forbindelse med cellulær differentiering og i forskellige syge sammenhænge. ^30,37

Et vigtigt skridt til at beregne stivhed fra force-kurve er at identificere det punkt, hvor spidsen først får kontakt med cellen. Usikkerheden i kontaktpunkt kan påvirke elasticitetsmodulet ^31.. For stive materialer, øger afbøjning signalet brat efter tip-prøven kontakt, og kontaktpunktet er let identificeres som vendepunkt i kurverne. Sådan en skarp vendepunkt, imidlertid ofte ikke i kraft-kurverne fra celler, på grund af den lave celle stivhed (se figur 2). En Matlab kode er udviklet til præcist at finde kontaktpunkterne i kraft kurverfra bløde prøver ved hjælp af algoritmen foreslået af Lin et al. ^29. Koden kan håndtere kraft kurver fra bløde prøver, hvilket gør os i stand til at automatisere processen med dataanalyse ved automatisk at søge efter den kontaktpunkt og montering af indrykning data til Hertz model. MATLAB-koden anvendes til at bestemme de kontaktpunkter i 60 force kurver taget på samme placering af et polyakrylamidgel, hvoraf stivhed var foranstaltningen for at være 7,2 kPa ved bulk-rheologimodificerende målinger. Koden opdaget kontakt punkter i disse kurver. Rækken af ​​variation i kontakt placering er mindre end 15 nm. Baseret på disse kontaktpunkter, den beregnede gennemsnitlige stivhed er 6,9 kPa, standardafvigelsen er 0,2 kPa, og den maksimale rækkevidde af variation 0,6 kPa. Resultater fra dette eksperiment give et mål til at vurdere usikkerheden på den målte stivhed. De 15 nm usikkerhed kontaktpunkt resulterer i en usikkerhed i stivhed, som er mindre end 10% af den gennemsnitlige værdifuldee. Til blødere geler med meget lavt deformation signal, kan usikkerheden i kontaktpunktet være så højt som 30 nm, hvilket fører til en usikkerhed i stivhed så højt som 30%. Koden er tilgængelig som et supplement til denne artikel.

AFM kan pålideligt måle stivheden varierer fra mindre end 100 Pa til 10 ⁶ Pa, som dækker området af stivhed til de fleste væv og celler. For pålidelige målinger, er det vigtigt at vælge de AFM støtteben med Fjederkonstanterne godt matchede til prøven stivhed. Når cantilever er for stiv, dens afbøjning er for lille til at opdage og det kan beskadige cellen, hvis cantilever er for blødt, vil det ikke led cellen tilstrækkeligt til at opnå pålidelige materialeegenskaber og sine termiske vibrationer kan dominere kraftkurve. Støtteben på 0,06 N / m med en pyramide tip er gældende for de fleste celletyper dyrket på stive kultur retter. Disse udkragninger, er imidlertid ikke relevant at måle celler dyrket påbløde underlag. Som vist i figur 2, cellen dyrket på en 3.000 Pa polyacrylamidgel er så bløde, at en 3 um indrykning er nødvendig for at generere en 5 nm afbøjning i cantilever. Den kraft kurve er så flad, at der er meget lille forskel mellem det præ-kontakt og post-kontakt region. Dette fører til store usikkerhed i kontaktpunktet og dermed de resulterende stivhedsværdier. Ved hjælp af en blødere cantilever kun lidt forbedrer kontrasten mellem den præ-kontakt og post-kontakt regioner. Til måling sådanne bløde materialer, er støtteben med store sfæriske spids anbefales. En 0,06 N / m cantilever med en sfærisk spids af 10 mikrometer i diameter kan anvendes til at måle prøver med stivhed lavere end 100 Pa Cantilevers med sfærisk spids er kommercielt tilgængelige fra mange leverandører. De kan også være custom-made ved at lime mikrosfærer til spidsfrie cantilevere. De sfæriske tip giver større deformation signal og forhindre beskadigelse af cellemembranen. However, er de ikke for høj opløsning stivhed kortlægning grund af deres store kontaktflade med cellerne. Tabel 1 indeholder en liste over AFM prober anbefales til celle stivhed målinger.

Model	Fjederkonstant (N / m)	Spidstype	Tip radius (nm)
Bruker DNP10-D	0.06	Pyramid	20
Bruker MLCT-B/C/E	0.01/0.02/0.03	Pyramid	20
Novascan PT.GS	0.01/0.03/0.06	Glas kugle	2.000 / 5.000 / 10.000
Novascan PT.PS	0.01/0.03/0.06	Polystyren Sphere	1.000 / 4.500 / 10.000

Tabel 1.. Et SEsamlings AFM prober med gældende fjederkonstant og tip geometri for celle indrykning.

Begrænsningerne i den præsenterede metode bør også markeret. Hertz model, der har været anvendt til at passe indrykning data er en forsimplet model. Den forudsiger kraft-indrykning forholdet for forsvindende fordybningerne i rent elastiske materialer ved aksesymmetrisk indenters. Nogle af antagelserne i Hertz-modellen gælder ikke til cellen indrykning.

Hertz Modellen antager homogen og lineært elastisk materiale, mens en celle er heterogen (se figur 3) og lineært elastisk. I lamellipodium regionen, er det snarere inhomogen grund af den heterogene struktur actin cytoskeleton. Den mekaniske stivhed i en celle er rapporteret som den gennemsnitlige stivhed udvundet fra tre eller flere force kurver erhvervet fra den relativt homogene perinukleære region. ^25,36 Rekonstitueret netværks af actin og mellemliggende glødetråd er strain-afstivende materialer, dvs de er stivere ved større deformationer. ^38,39 sådan en ikke-lineær elasticitet er blevet observeret for levende celler, men ikke tegnede sig for i Hertz model. For at begrænse effekten af ​​ikke-lineær elasticitet på den rapporterede celle stivhed, er kun de første 300 nm af indrykningen data passer til Hertz model.

Det antages også i Hertz model, at materialerne er rent elastisk. Men celler og deres cytoskelet er viskoelastiske materialer med stivhed afhængig tidsskala af målinger. På kortere tidshorisont, hovedsageligt cantilever afbøjning kommer fra den elastiske respons af celler. På lang tidshorisont, men prøven kryber og giver en blødere respons. Tiden omfanget af AFM indrykning er kontrolleret af tip hastighed. Derfor er den observerede forskel i celle stivhed kun mening, når kraften kurver er anskaffet med samme indrykning veloby. Til kvantitativt udtrække frekvensafhængige viskoelasticitet af celler, har AFM "force modulation"-metoden er udviklet ved at anvende højfrekvente lille amplitude svingninger på en større fordybning ^21,27.

Antagelsen af ​​uendelig prøve tykkelse i Hertz-modellen gælder ikke for cellerne. Celler er typisk nogle få mikrometer tyk i perinukleære regionen og et par hundrede nanometer tykke i lamel-regionen. Korrektioner er foretaget for at tage højde for de begrænsede stikprøve tykkelse. ^31,40 data indhentet fra force-mapping indeholder både indrykning data og celle højde data. Local prøve tykkelse kan beregnes ud fra højdedata. Det fremtidige arbejde er nødvendigt for at gennemføre de prøvetykkelsen korrektioner i analysen for force-kortdata.

Sammenfattende præsenterer dette papir en protokol til at karakterisere den mekaniske stivhed levende celler ved hjælp af en asyl MFP3D-Bio atomic force MICRoscope. Principperne for AFM drift og MATLAB dataanalyse procedure gælder for alle andre AFM modeller. I de seneste år, har optisk mikroskopi teknikker, herunder lysfelt, konfokal mikroskopi, og total indre refleksion fluorescensmikroskopi (TIRF) blevet kombineret med AFM for real-time scanning af celler til mekaniske stimuli. ^41,42 Disse opsætninger også tillade samtidige målinger af celle mekanik og billedbehandling af de cytoskeletale komponenter. Korrelere de lokale stivhed data til distribution af lokale cytoskelet komponenter vil give indsigtsfulde oplysninger om, hvordan cytoskeletale komponenter bidrager til celle mekanik.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atomic Force Microscope	Asylum Research	MFP3D-BIO