Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

Published: June 27, 2013 doi: 10.3791/50497
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Chemical Engineering, Worcester Polytechnic Institute

Summary

Deze paper toont een protocol om de mechanische eigenschappen van levende cellen te karakteriseren door middel van microindentation gebruik van een Atomic Force Microscope (AFM).

Abstract

Mechanische eigenschappen van cellen en extracellulaire matrix (ECM) spelen een belangrijke rol in vele biologische processen waaronder stamcel differentiatie, tumorvorming en wondgenezing. Veranderingen in stijfheid van cellen en ECM vaak tekenen van veranderingen in celfysiologie of ziektes in weefsels. Daarom cel stijfheid is een index om de status van celkweken evalueren. Onder de vele methoden die aan de stijfheid van cellen en weefsels te meten, micro-inkeping met een Atomic Force Microscope (AFM) biedt een manier om betrouwbare wijze de stijfheid van levende cellen. Deze methode is op grote schaal toegepast op de micro-schaal stijfheid karakterisering van verschillende materialen, variërend van metalen oppervlakken zachte biologische weefsels en cellen. Het basisprincipe van deze werkwijze is om een ​​cel inspringen met een AFM tip van geselecteerde geometrie en meet de uitgeoefende kracht de buiging van de AFM cantilever. Montage van de kracht-inkeping bocht naar de Hertz-modusl voor de bijbehorende tip geometrie kunnen kwantitatieve metingen van het materiaal stijfheid te geven. Deze paper toont de procedure om de stijfheid van levende cellen met behulp van AFM karakteriseren. Belangrijkste stappen waaronder het proces van de AFM kalibratie, kracht-curve acquisitie en data-analyse met behulp van een MATLAB routine worden gedemonstreerd. Beperkingen van deze methode worden ook besproken.

Introduction

Mechanische eigenschappen, met name stijfheid van afzonderlijke cellen en de omliggende extracellulaire matrix (ECM) zijn essentieel voor vele biologische processen zoals celgroei, motiliteit, celdeling, differentiatie en weefsel homeostase. 1 Het is aangetoond dat cellen mechanische stijfheid mate wordt bepaald door het cytoskelet, vooral de netwerken van actine en intermediaire filamenten en andere eiwitten gekoppeld. 2 Resultaten van de mechanische testen van de in vitro netwerken van actine en intermediaire filamenten suggereren dat de cel mechanica is grotendeels afhankelijk van de cytoskelet structuur en de voorspanning in het cytoskelet. 3-5 Stijfheid van levende cellen wordt vervolgens beschouwd als een index om de cytoskelet structuur 6, myosine activiteit 7 en vele andere cellulaire processen te evalueren. Belangrijker, veranderingen in cel mechanische eigenschappen vaak blijkt nauw associated met diverse aandoeningen zoals tumorvorming en metastase 8-10 Monitoring de mechanische stijfheid van levende cellen kan derhalve een nieuwe manier om celfysiologie volgen;. te detecteren en diagnosticeren ziekten 8;. en de doeltreffendheid van geneesmiddelen behandelingen evalueren 11 , 12

Meerdere werkwijzen waaronder deeltjes volgen microrheology, 13-16 magnetische verdraaien cytometry, 17 micropipet aspiratie 18,19 en microindentation 20-22 zijn ontwikkeld om de elasticiteit van de cellen te meten. Deeltje volgen microrheology traceert de thermische trillingen van beide submicrondeeltjes fluorescerende deeltjes geïnjecteerd in cellen of ijkmarkeringen in de cel cytoskelet. 23 Elastisch en visceuze eigenschappen van cellen worden berekend op basis van de gemeten deeltjes verplaatsingen met de fluctuatie-dissipatie theorema. 14,23 Deze methode maakt gelijktijdige metingen van lokalemechanische eigenschappen met een hoge ruimtelijke resolutie op verschillende plaatsen in een cel. Echter, injecteren fluorescerende deeltjes in cellen kan leiden tot veranderingen in cellulaire functie, cytoskelet structuur en dus de cel mechanics. De micropipet aspiratie methode is onderdruk in een micropipet met een diameter van 1 tot 5 urn op een klein stukje celmembraan zuigen in de pipet. Cell stijfheid wordt berekend uit de toegepaste onderdruk en celmembraan vervorming. 18 Deze werkwijze kan echter niet de ongelijkmatige verdeling van de stijfheid over de cel te detecteren. Magnetische twisting cytometrie (MTC) van toepassing magnetisch veld koppel aan super paramagnetische beads bevestigd aan het celmembraan genereren. Cell 17 stijfheid wordt verkregen in deze werkwijze van de relatie tussen de toegepaste torsie en de kronkelende vervorming van de celmembraan. Het is moeilijk om de locatie van de magnetische korrels in de werkwijze MTC controleren, en het is ook challenging tot de kronkelende vervorming met een hoge resolutie te karakteriseren. Microindentation geldt een indenter met goed gedefinieerde geometrie om punch in de cel. Het inspringen kracht en de resulterende inspringen in cellen volgen vaak de voorspelling van de Hertz-model. Young's moduli van de cellen kan worden berekend uit de kracht-indrukking curven aanpassen ervan aan de Hertz model. Deze methode is op grote schaal toegepast op de mechanische eigenschappen van de weefsels en cellen te testen, ondanks zijn beperkingen, zoals onzekerheid in contactpunt vastberadenheid, toepasbaarheid van de Hertz-model, en het potentieel om fysiek te beschadigen de cellen. Onder de vele apparaten voor microindentaion 20, de Atomic Force Microscope (AFM) is in de handel verkrijgbaar en is op grote schaal toegepast op de mechanische eigenschappen van levende cellen en weefsels 21,24-27 karakteriseren.

Deze paper toont de procedure van het gebruik van een asiel MFP3D-Bio AFM naar cel mechanica karakteriseren. AFM niet oply levert hoge-resolutie topografie van cellen, maar ook op grote schaal toegepast om de mechanische eigenschappen van weefselcellen karakteriseren. Het principe van AFM indrukking wordt geïllustreerd in figuur 1. De AFM cantilever nadert de cel van enkele micrometers hierboven, maakt contact met de cel streepjes de cel zodat de cantilever doorbuiging een voorgeselecteerd setpunt bereikt, en trekt vanaf de cel. Tijdens dit proces wordt de cantilever doorbuiging wordt geregistreerd als een functie van de locatie zoals weergegeven in figuur 1. Alvorens contact met de cel, de cantilever beweegt het medium zonder enige duidelijke afwijking. Wanneer inspringen op de cel, de cantilever bochten en de afbuigsignaal toeneemt. De cantilevers worden gemodelleerd als elastische balken zodat hun afbuiging evenredig is met de op het cel kracht. Door het instellen van de maximale cantilever doorbuiging, is de maximale grootte van de kracht toegepast op de steekproef beperkt tot d voorkomenAmage aan cellen. Het gedeelte van de kracht curve van punt b in figuur 1, waarbij de punt streepjes in de cel, is bekwaam tot het hertz model om de cel stijfheid extraheren naar punt c.

Figuur 1
Figuur 1. Illustratie van de AFM microindentation en interpretatie van de geldende curve. Het bovenste paneel toont de beweging van AFM cantilever gedreven door de piëzo-scanner. De verticale locatie van cantilever z en cantilever uitwijkingssignaal d wordt geregistreerd gedurende het proces. De cantilever begint vanaf punt een, enkele micrometers boven de cel. Bij het naderen van de cel, het monster inkeping δ blijft nul tot het punt b, wanneer de punt in contact komt met de cel bereikt. De coördinaten van punt b in de plot zijn kritieke waardenvoor gegevensanalyse, aangeduid met (z 0, d 0>). Van b naar c, de cantilever streepjes in de cel totdat de cantilever doorbuiging bereikt een instelling, die is ingesteld op de verhouding tussen de beoogde maximum inspringen kracht en de cantilever veerconstante zijn. Zodra de afbuigsignaal de ingestelde maximale waarde heeft bereikt, wordt de cantilever vervolgens teruggetrokken uit de cel naar punt d, waar het vaak naar beneden worden getrokken als gevolg van tip-sample adhesie, los van de cel en keert terug naar zijn oorspronkelijke locatie bij e. Het rechter paneel toont de relatie tussen de inkeping en de opgenomen z en d signaal. In op de lagere linker paneel is een plot van een representatieve kracht curve, de maximale inspringen van een cantilever, waarvan de veerconstante wordt gemeten om te 0.07N / m, is ingesteld om 17 nm, zodat de maximale inspringen kracht toegepast op steekproef is 1.2 nN. De belangrijkste locaties tijdens de insprong zijn gemarkeerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kalibreer het voorjaar Constant van Cantilever

  1. Laad de cantilever in de AFM volgens de instructies van de fabrikant. Het is noodzakelijk om de cantilever houder schoon met ethanol voordat experimenten. Dit zal helpen bacteriële besmetting tijdens de AFM metingen te beperken tot cultuur.
  2. Kalibreren InvOLS (Inverse Optical Lever Gevoeligheid). Deze parameter beschrijft de hoeveelheid fotodiode response (Volt) per nanometer cantilever doorbuiging.
  3. Laad een schoon glasplaatje op het monster podium, installeer dan de AFM hoofd en pas de laserstraal en uitlijning volgens de instructies van de fabrikant. Betrek de AFM tip over het glasplaatje.
  4. Met de piëzo ingetrokken, opnieuw uitlijnen de spiegel om een ​​fotodiode lezen van -2 V. Voer een kracht spectroscopie meting met een triggerpoint (maximaal fotodiode response) van 2 V.
  5. Met de piëzo ingetrokken, opnieuw uitlijnen de spiegel om een ​​fotodiode lezen van -2 V. Voer een foRCE spectroscopie meting met een triggerpoint (maximaal fotodiode response) van 2 V. Opmerking: De spanning waarden hier zijn specifiek voor het asiel AFM. Deze waarde moet worden ingesteld volgens de specificaties die door de fabrikant.
    Na data-acquisitie is voltooid, in te zoomen op de firma-contactgebied van de kracht curve. Voer een lineaire fit aan deze regio aan de helling, die zal worden in V / nm vinden. Het omgekeerde van deze waarde wordt de optische gevoeligheid van de cantilever-fotodiode ensemble.
  6. Reset de spiegel aanpassing aan een vrije doorbuiging van 0 V.
  7. Kalibreren van de cantilever veerconstante. Een thermische-tune methode wordt gebruikt om de veerconstante van de cantilever 28 bepalen.
  8. Na het kalibreren van de InvOLS, verhogen de scanner uit het monster stadium zodanig dat er geen interacties tussen de tip en sample.
  9. Beginnen met het vastleggen thermische data. Tijdens dit proces, de thermische trilling van de vrijdragende ligger is Recorded. De AFM software analyseert een vermogensspectrum van een dergelijke thermische trillingen en plots in een venster data.
  10. Na een paar seconden van data-acquisitie, het uitvoeren van een fit aan het segment data gecentreerd op de laagste frequentie (fundamentele resonantie) piek aan de veerconstante te bepalen.

2. Het laden van de Steekproef

  1. Plaats de schotel Heater accessoire op de AFM podium, zo niet al voorzien.
  2. Stel de temperatuur tot 37 ° C, en wacht 20 minuten voor het systeem om een ​​stabiele thermisch evenwicht bereiken.
  3. Plaats de cultuur schotel op de AFM podium en zet deze vast met behulp van de klem voorzien van de schotel verwarmer. Het is belangrijk om de tijd tussen verwijdering van de schaal uit de incubator en het op het podium, om trauma te vermijden om de cellen te minimaliseren. Voor metingen langer dan 30 min, dient CO 2 onafhankelijke drager worden gebruikt om de normale kweekmedium vervangen.
  4. Breng een kleine daling van 37 ° C kweekmedium aan het uiteinde van de tHij AFM cantilever, en laat de AFM hoofd totdat de punt net is ondergedompeld in een vloeistof.
  5. Met de top-view CCD camera, lijnt de laserstraal op de cantilever (de uitlijning in vloeistof anders dan in lucht, omdat de verandering in brekingsindex van het medium).
  6. Betrek de AFM tip over een schone ruimte van de cultuur schotel.
  7. Voer kalibratie van de InvOLS zoals hierboven beschreven, de cantilever gevoeligheid in de vloeibare omgeving.

Opmerking: a) Indien cellen worden gekweekt op hydrogels, de kalibratie van InvOLS worden vooraf uitgevoerd tegen het bodemoppervlak van een kweekschaal gevuld met celkweekmedium. Bij het overschakelen naar cel monsters, speciale aandacht worden besteed aan de laserstraal uitlijning niet veranderen met de cantilever. b) InvOLS moet worden gekalibreerd wanneer er een verandering in de laser uitlijning. c) Het wordt ook aanbevolen om InvOLS nemen als het gemiddelde van de waarde van verscheidene ijkcurves, sinds elke kalibratie genereert een andere InvOLS. De variatie in InvOLS is evenwel klein vergeleken met de gemiddelde waarde. Bijvoorbeeld, het kalibreren van een Bruker DNP-10 cantilever met veerconstante 0,06 N / m in vloeistof door 100 maal produceren een gemiddelde InvOLS waarde van 66,3 nm / V, met een standaarddeviatie van slechts 0,5 nm / V.

3. Verzamelen Force Curves van Cell Inspringen

  1. Selecteer een cel voor inspringen. Met behulp van de optische microscoop, verplaatst u de etappe naar de cantilever boven de cel te plaatsen, zodat de punt bevindt zich in de peri-kernen regio. Nauwkeurige aanpassing van de cantilever positie kan worden door toepassing van offsets voor de X-en Y scanners.
    Opmerking: De AFM cantilever heeft van het monster oppervlak te worden ingetrokken tijdens het verplaatsen van het monster podium om een doelcel te selecteren. Dit beschermt de cantilever van kloppen in de steekproef, omdat het monster oppervlak mag niet plat.
  2. Schakel over naar de modus Spectroscopie Force. Stel de Inspringenpercentage binnen het bereik van 1-10 um / sec, laag genoeg om hydrodynamische effecten te vermijden.
  3. Stel de doorbuiging triggerpoint, waarvan de maximale inspringen kracht beperkt tot schade aan cellen voorkomen. Selecteer de Relative triggering optie, die zal corrigeren voor een eventuele verschuiving in de afbuigsignaal. Een maximale kracht van 2 nN is een goed uitgangspunt voor de meeste monsters. Deze waarde moet echter worden aangepast aan de stijfheid monster. Voor zachte monsters een lagere waarde moet worden gebruikt om overmatige indrukking aan het monster te voorkomen. Voor stijve monsters een hoge waarde moet worden gebruikt meetbare inkeping genereren.
  4. Stel de kracht afstand groot genoeg om te waarborgen dat de punt volledig wordt losgemaakt van de cel tussen krachtmetingen. Meestal wordt de kracht afstand vastgesteld op 5 micrometer.
  5. Bevel van de AFM om een ​​enkele kracht bocht te nemen.
  6. Vang minimaal drie krachtcurven op verschillende locaties in de peri-kernen gebied van elke cel. Hoewel het voordelig om meerdere nemenbochten op elke cel voor betrouwbare statistische gegevens, het innemen van te veel kracht bochten kan leiden tot veranderingen in cel stijfheid als gevolg van stress van de AFM sonde.
  7. Bij het verzamelen van gegevens is voltooid, en trek de tip, en herhaalt u de stappen 3,1-3,6 voor zoveel cellen als nodig is voor een goede statistische gegevens op mobiele stijfheid onder een bepaalde sample aandoening. Meestal worden 30 cellen gemeten voor elke aandoening.

Om de verdeling van de stijfheid binnen een enkele cel karakteriseren, wordt kracht-kaart-modus toegepast. In de Force-kaart-modus, stelt u een scanformaat tot de regio van belang zijn; stellen een passende oplossing; stel de insprong parameters als die welke zijn gekozen voor enkele kracht bochten; de AFM zal vervolgens raster over de gedefinieerde monster gebied en neem enkele kracht curves bij elke pixel in het monster regio.

4. Data Analysis

De opgenomen kracht curven worden geanalyseerd met behulp van een aangepaste MATLAB procedure om de cel stijfheid te berekenen. Het volgende is een korte beschrijving van MATLAB procedure:

  1. De MATLAB-programma identificeert het aanspreekpunt coördineert z0 en d0 (zie figuur 1) met behulp van een algoritme door Lin et al geadopteerd uit een gepubliceerde methode 29.:
  2. Voor elk gegevenspunt in de krachtcurve, voert een lineaire aanpassing van de gegevens aan de linkerzijde van de bijzondere plaats en een Hertz model passen naar rechts (de geselecteerde punt als eerste contactpunt) tot de ingestelde maximale inspringen (200-300 nm aanbevolen).
  3. Voor elk punt, berekent de relatieve RMS fout van zowel horten en vatten deze waarden.
  4. Het punt waarop de minimale totale pasfout bereikt is geselecteerd als de eerste contactpunt.
    Opmerking: Computation tijd kan worden verminderd door het implementeren van een gouden-gedeelte zoeken in plaats van lineair scannen van de volledige kracht curve.
  5. Monster vervorming δ en inspringen kracht F wordt als volgt berekend:
    Vergelijking 1
  6. Een kleinste kwadraten aanpassing wordt toegepast op de F vs passen δ gegevens in de post-contactgebied, z z ≥ 0, de Hertz model om de Young's modulus E van het cel extract:
    Vergelijking 2
    , Waarin v verhouding van de Poisson.
    Opmerking: Als δ meer dan 10% van de monsterdikte (celhoogte), wordt de gemeten stijfheid cel die door het substraat stijfheid. De dikte van peri-kernregio gewoonlijk in de orde van enkele micrometers. Daarom is alleen de eerste 200-300 nm van F-δ curve is geschikt om de Hertz model.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 2a toont drie representatieve krachtcurven uit 3T3 fibroblasten gekweekt op plastic oppervlak, polyacrylamide gel elasticiteitsmoduli 3000 Pa en 17.000 Pa, respectievelijk. Na zorgvuldig identificeren van de contactpunten in de bochten, wordt het inspringen kracht als functie van de cel vervorming uitgezet in Figuur 2b. Onder een kracht van grootte kleiner dan 0,3 nN, een piramidevorm tip streepjes 3 micrometer in een cel gekweekt op een 3 kPa polyacrylamidegel. In tegenstelling, is een kracht die meer dan 1,6 nN nodig om streepje 500 nanometer in de cel gekweekt op gewoon cultuur schotel met dezelfde tip. Uit deze grafiek dat de cellen gekweekt op zachte polyacrylamide gel is zachter dan de cellen gekweekt op de stijve schaal kweken. Montage van het eerste segment (δ <30 nm) van de kracht-δ curves naar de Hertz model geeft elasticiteitsmoduli van deze drie cellen als 10 kPa, 1,2 kPa, en 1,10 kPa, respectievelijk. Cellen op de culture schotel 100 keer stijver dan cellen gekweekt op polyacrylamide gels. Solon et al.. Hebben soortgelijke resultaten gerapporteerd 25. Zij vonden dat de fibroblasten actief verstijven hun cytoskeletons om de stijfheid van de substraten zij zich aan te passen. Vele andere celtypes ook gerapporteerd stijver wanneer gekweekt op 30 stijver substraten.

Het is belangrijk op te merken dat de inspringing plastische vervorming kan veroorzaken in cellen, waardoor knikken zoals geïllustreerd in de paarse curve. Normaal gesproken moeten dergelijke curves van de data-analyse worden uitgesloten. Echter, kan de curve nog steeds worden gebruikt om mobiele stijfheid berekenen of de knik buiten het bereik van aanpasgegevens. Bijvoorbeeld, de knik in de paarse curve plaatsvindt bij ongeveer 400 nm. Deze curve kan nog steeds worden geanalyseerd door het aanbrengen van de gegevens slechts tot δ = 30 nm de Hertz model een stijfheid van 1,2 kPa verkregen. Het is ook belangrijk om de "triggerpunt" aanpassen aan ee monster stijfheid. Zo wordt de blauwe curve uit een zachte cel gekweekt op een 3 kPa polyacrylamidegel. De relatieve doorbuiging triggerpoint instellen op 5 nm, de AFM tip streepjes 3 micrometer in de cel. Zo'n grote indrukking moet voorkomen in de cel stijfheid metingen, omdat het zou kunnen leiden dat het celmembraan en de cel te doden. Vele andere factoren, waaronder de tip snelheid en data-acquisitie snelheid tijdens de kracht curve overname kan invloed hebben op de kwaliteit van de verworven kracht bochten en dus de resulterende stijfheid van cellen 31. Om betrouwbare metingen te maken is het noodzakelijk de al deze parameters 'schone' krachtcurven de rode curve figuur 2a, waarbij een vlakke pre-contactdeel gevolgd door een lineaire verhoging na contactdeel heeft verwerven.

Figuur 3a toont een fluorescentie beeld van een 3T3 fibroblast op een celkweek schotel. De cel wordt getransfecteerd met GFP vimentine,een soort intermediaire filamenten. AFM Force-mapping is uitgevoerd in deze 80 micrometer per 80 micrometer gebied, met een resolutie van 32 x 32 pixels. De resulterende stijfheid kaart wordt getoond in figuur 3b. De stijfheid varieert over de cel. En, het lamellipodium regio is stijver en heterogener dan de peri-nucleair gebied, dat de stijve kern omringt.

Figuur 2
Figuur 2. Kracht curve gegevens en de geanalyseerde kracht-inspringen curve. A) Een set van drie representatieve kracht curve verkregen gegevens voor 3T3 fibroblasten gekweekt op glas (rood), 17 kPa polyacrylamidegel (paars), en 3 kPa polyacrylamidegel (blauw). De curven zijn zodanig verschoven dat de contactpunt (z 0, 0 d) bevindt zich in de oorsprong (0,0) van het coördinatenstelselsysteem. b) Het inspringen-force curves berekend uit een) en de montage van de inkeping gegevens naar de Hertz model met alleen de eerste 300 nm van inspringen. Inzet in b) toont de goedheid van fit aan de Hertz model voor de eerste 300 nm van inspringen; cirkels zijn experimentele gegevens, lijnen stellen de pasvorm data. De veerconstante van cantilever 0.062 N / m in dit geval.

Figuur 3
Figuur 3. a) Fluorescentie beeld van een 3T3 fibroblasten getransfecteerd met GFP vimentine. Slechts een deel van de cel is weergegeven in de afbeelding. Schaal balk vertegenwoordigt 20 micrometer. B) Een 32 x 32 pixel stijfheid kaart van hetzelfde gebied. Elke pixel vertegenwoordigt 2,5 urn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De AFM inspringen methode heeft voordelen om mechanische eigenschappen van levende cellen te karakteriseren. Zij het ​​minder gevoelig is dan de magnetische draaiende cytometrie en optische pincetten, welke krachten kunnen meten op het piconewton level 32, kan de AFM weerstandskracht detecteren van monsters, variërend van enkele tientallen pico-Newton tot honderden nano-Newton, vergelijkbaar met variëren van kracht die kunnen worden toegepast op cellen met behulp van een micropipet 19. Deze reeks van perspassingen de behoeften meetbare vervormingen creëren alle soorten cellen 19. De hoge ruimtelijke resolutie maakt het mogelijk om kenmerken op submicron niveau heterogeniteiten in weefsels en in enkele cellen 33. Het staat ook real-time live cell metingen. Verschillende AFM modellen ontworpen voor biologische monsters kan in een vloeibare omgeving en zijn uitgerust met verwarmde monster fasen, die nauwkeurige temperatuurbeheersing, waardoor een fysiologisch milieu handhavenving voor levende cellen tijdens de metingen. AFM inkeping is met succes toegepast voor het meten van mechanische eigenschappen van een reeks celtypes, 25,34-36 en wordt veelvuldig gebruikt om veranderingen in de mechanische eigenschappen van cellen geassocieerd met cellulaire differentiatie en in verschillende contexten zieke. 30,37

Een belangrijke stap om de stijfheid van kracht-curve te berekenen is het identificeren van het punt waar de punt maakt eerst contact opnemen met de cel. De onzekerheid in contactpunt kan invloed hebben op de elastische modulus 31. Voor stijve materialen, de afbuigsignaal verhoogt abrupt na de tip-sample contact, en het contactpunt wordt gemakkelijk geïdentificeerd als keerpunt in de bochten. Zo'n scherpe keerpunt echter vaak niet in de kracht-curves uit cellen, vanwege de lage cel stijfheid (zie figuur 2). Een MATLAB-code is ontwikkeld om nauwkeurig vinden de contactpunten van kracht bochtenvan zacht monsters met behulp van de door Lin et al. voorgesteld algoritme. 29 De code kan omgaan met de kracht rondingen van zacht monsters, die ons in staat stelt om het proces van data-analyse te automatiseren door automatisch te zoeken naar het contactpunt en de montage van de inkeping gegevens naar Hertz model. De MATLAB code wordt toegepast op de contactpunten 60 krachtcurven genomen op dezelfde plaats als een polyacrylamide gel, waarvan de stijfheid was maatregel 7,2 kPa door bulk reologie metingen bepalen. De gedetecteerde contactpunten in deze curves. Het bereik van de variatie in contactpunt locatie is kleiner dan 15 nm. Op basis van deze contactpunten, de berekende gemiddelde stijfheid is 6.9 kPa, de standaarddeviatie is 0,2 kPa, en het maximale bereik van de variatie 0.6 kPa. De resultaten van dit experiment geven een maatregel om de onzekerheid van de gemeten stijfheid te evalueren. De 15 nm onzekerheid contactpunt resulteert in een onzekerheid in stijfheid, die minder dan 10% van de gemiddelde waardevollee. Zachtere gelen met een zeer lage vervorming signaal kan de onzekerheid contactpunt oplopen tot 30 nm, hetgeen leidt tot een onzekerheid in stijfheid zo hoog als 30%. De code is beschikbaar als een aanvulling op dit artikel.

AFM betrouwbaar meten stijfheid tussen minder dan 100 Pa tot 10 Pa 6, meetgebied van stijfheid voor de meeste weefsels en cellen. Voor betrouwbare metingen is het belangrijk om de AFM uitkragingen selecteren met veerconstante goed afgestemd op het monster stijfheid. Wanneer de cantilever te stijf is, de doorbuiging te klein te detecteren en kan de cel beschadigen, als de cantilever te zacht is, zal de cel niet voldoende streepje betrouwbare materiaaleigenschappen te verkrijgen en de thermische trillingen kunnen de krachtcurve domineren. Uitkragingen van 0,06 N / m met een piramide tip zijn van toepassing voor de meeste soorten cellen gekweekt op stijve cultuur gerechten. Deze cantilevers, zijn echter niet van toepassing op cellen gekweekt op te metenzachte substraten. Zoals getoond in figuur 2, de cellen gekweekt op 3000 Pa polyacrylamide gel is zo zacht dat een 3 um indrukking wordt vereist om een 5 nm doorbuiging van de cantilever genereren. De kracht curve zo vlak is er weinig verschil tussen de pre-en post-contact contactgebied. Dit leidt tot grote onzekerheid in het contactpunt en dus de resulterende stijfheid waarden. Met een zachtere cantilever slechts licht verbeterd contrast tussen de pre-en post-contact contactgebieden. Om meting zoals zachte materialen, uitkragingen met grote bolvormige tip worden aanbevolen. Een 0,06 N / m cantilever met een bolvormig uiteinde van 10 micrometer kunnen worden toegepast op monsters meten stijfheid lager dan 100 Pa uitkragingen met sferische tip zijn commercieel verkrijgbaar bij vele leveranciers. Ze kunnen ook op maat gemaakt door lijmen microbolletjes te tipless uitkragingen. De bolvormige uiteinden leveren grotere afbuigsignaal en beschadiging van het celmembraan voorkomen. However, ze zijn niet van toepassing voor hoge-resolutie stijfheid mapping vanwege hun grote contactoppervlak met de cellen. Tabel 1 geeft een overzicht van de AFM probes aanbevolen voor cel stijfheid metingen.

Model Veerconstante (N / m) Tip Type Tip radius (nm)
Bruker DNP10-D 0.06 Piramide 20
Bruker MLCT-B/C/E 0.01/0.02/0.03 Piramide 20
Novascan PT.GS 0.01/0.03/0.06 Glazen bol 2000/5000/10000
Novascan PT.PS 0.01/0.03/0.06 Polystyreen Sphere 1000/4500/10000

Tabel 1. A selectie van AFM-probes met toepassing veerconstante en tip geometrie voor mobiele inspringen.

De beperkingen van de onderhavige methode ook worden gemerkt. De Hertz model dat is toegepast op de insprong gegevens aanpassen is een simplistische model. Het voorspelt de kracht-inspringen relatie voor oneindig inkepingen van puur elastische materialen door axisymmetric indringlichamen. Enkele van de veronderstellingen van de Hertz-model niet van toepassing op de cel inspringen.

Het model gaat Hertz homogeen lineair elastisch materiaal, terwijl een cel heterogeen (zie figuur 3) en lineair elastisch. In de lamellipodium regio is vrij inhomogeen door de heterogene structuur van het actine cytoskelet. De mechanische stijfheid van een cel wordt gerapporteerd als het gemiddelde stijfheid gewonnen uit drie of meer krachtcurven verkregen van de relatief homogene perinucleaire regio. 25,36 Gereconstitueerde netwerks van actine en intermediaire filament zijn stam-verstijving materialen, dat wil zeggen ze zijn stijver bij grotere vervormingen. 38,39 Zulk een niet-lineaire elasticiteit is waargenomen voor levende cellen, maar niet verwerkt in de Hertz-model. Om het effect van niet-lineaire elasticiteit de gerapporteerde cel stijfheid te beperken, wordt alleen de eerste 300 nm van de inkeping gegevens aanpassen aan de Hertz model.

Voorts wordt aangenomen in de Hertz model dat de materialen zuiver elastisch. Echter, cellen en hun cytoskelet zijn visco-elastische materialen stijfheid afhankelijk van de tijdschaal van de metingen. Op kortere tijdschaal, de cantilever doorbuiging komt voornamelijk uit de elastische respons van cellen. Op lange tijdschaal echter het monster kruipt en geeft een zachtere respons. De tijdschaal van de AFM inspringen wordt gecontroleerd door tip snelheid. Vandaar dat het waargenomen verschil in cel stijfheid is alleen zinvol wanneer de kracht curven worden verkregen met dezelfde inspringen velostad. Kwantitatief te extraheren de frequentie afhankelijke visco-elasticiteit van cellen, heeft de AFM "force modulatie"-methode is ontwikkeld door het toepassen van hoogfrequente kleine amplitude oscillaties op een grotere inkeping 21,27.

De aanname van oneindige monster dikte in de Hertz model niet van toepassing is voor de cellen. Cellen worden gewoonlijk enkele micrometers dik in de perinucleaire regio en een paar honderd nanometers dik in de regio lamel. Correcties zijn aangebracht om rekening te houden met de eindige steekproef dikte. 31,40 Gegevens verkregen van kracht-mapping bevat zowel inspringen gegevens en celhoogte gegevens. Lokale monsterdikte kan worden berekend uit de hoogtegegevens. Toekomstige werkzaamheden moet de monsterdikte correcties uitvoeren in analysis for force-kaartgegevens.

Samengevat, dit document presenteert een protocol aan de mechanische stijfheid van levende cellen met behulp van een asiel MFP3D-Bio atomic force micr karakteriserenoscope. De werkingsprincipes AFM en de MATLAB data analyse procedure zijn van toepassing op alle andere AFM modellen. De laatste jaren zijn optische microscopie technieken, waaronder helder veld, confocale microscopie en totale interne reflectie fluorescentiemicroscopie (TIRF) gecombineerd met de AFM real-time beeldvorming van cellen op mechanische stimuli. 41,42 Deze opstellingen kunnen ook gelijktijdige metingen van cel mechanica en beeldvorming van het cytoskelet componenten. Correleren van de lokale stijfheid gegevens aan de distributie van lokale cytoskelet componenten zullen inzichtelijke informatie over het cytoskelet componenten bijdragen tot cel mechanica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

De auteurs danken dr. Paul Janmey aan de Universiteit van Pennsylvania voor het verstrekken van cellijnen die in deze paper. QW ook erkennen JF Byfield en Evan Anderson voor hun inzichtelijke discussies over AFM technieken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atomic Force Microscope Asylum Research MFP3D-BIO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  2. Wagner, O. I., et al. Softness, strength and self-repair in intermediate filament networks. Exp. Cell Res. 313, 2228-2235 (2007).
  3. Wang, N., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 7765-7770 (2001).
  4. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282, 606-616 (2002).
  5. Kasza, K. E., et al. Filamin A is essential for active cell stiffening but not passive stiffening under external force. Biophysical Journal. 96, 4326-4335 (2009).
  6. Elson, E. L. Cellular mechanics as an indicator of cytoskeletal structure and function. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 397-430 (1988).
  7. Schafer, A., Radmacher, M. Influence of myosin II activity on stiffness of fibroblast cells. Acta Biomaterialia. 1, 273-280 (2005).
  8. Guck, J., et al. Optical deformability as an inherent cell marker for testing malignant transformation and metastatic competence. Biophysical Journal. 88, 3689-3698 (2005).
  9. Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2, 780-783 (2007).
  10. Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nature Nanotechnology. 7, 757-765 (2012).
  11. Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study. Biophysical Journal. 78 (00), 520-535 (2000).
  12. Cross, S. E., Jin, Y. S., Lu, Q. Y., Rao, J., Gimzewski, J. K. Green tea extract selectively targets nanomechanics of live metastatic cancer cells. Nanotechnology. 22, 215101 (2011).
  13. Hoffman, B. D., Crocker, J. C. Cell mechanics: dissecting the physical responses of cells to force. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 259-288 (2009).
  14. Hoffman, B. D., Massiera, G., Van Citters, K. M., Crocker, J. C. The consensus mechanics of cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10259-10264 (2006).
  15. Lau, A. W., Hoffman, B. D., Davies, A., Crocker, J. C., Lubensky, T. C. Microrheology, stress fluctuations, and active behavior of living cells. Physical Review Letters. 91, 198101 (1981).
  16. Liu, J., et al. Microrheology probes length scale dependent rheology. Physical Review Letters. 96, 118104 (2006).
  17. Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5, 636-640 (2006).
  18. Oh, M. J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness. J. Vis. Exp. (67), e3886 (2012).
  19. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. Journal of Biomechanics. 33, 15-22 (2000).
  20. Levental, I., et al. A simple indentation device for measuring micrometer-scale tissue stiffness. J. Phys-Condens. Mat. 22, (2010).
  21. Mahaffy, R. E., Park, S., Gerde, E., Kas, J., Shih, C. K. Quantitative analysis of the viscoelastic properties of thin regions of fibroblasts using atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86, 1777-1793 (2004).
  22. Radmacher, M. Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine: The Quarterly Magazine of the Engineering in Medicine & Biology Society. 16, 47-57 (1997).
  23. Crocker, J. C., Hoffman, B. D. Multiple-particle tracking and two-point microrheology in cells. Methods in Cell Biology. 83, 141-178 (2007).
  24. Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. J. Vis. Exp. (54), e2911 (2011).
  25. Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophysical Journal. 93, 4453-4461 (2007).
  26. Wu, H. W., Kuhn, T., Moy, V. T. Mechanical properties of l929 cells measured by atomic force microscopy: Effects of anticytoskeletal drugs and membrane crosslinking. Scanning. 20, 389-397 (1998).
  27. Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophysical Journal. 70, 556-567 (1996).
  28. Levy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13, 33-37 (2002).
  29. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129, 430-440 (2007).
  30. Davis, J. T., Wen, Q., Janmey, P. A., Otteson, D. C., Foster, W. J. Muller cell expression of genes implicated in proliferative vitreoretinopathy is influenced by substrate elastic modulus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3014-3019 (2012).
  31. Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: Measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Method Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
  32. Lele, T. P., et al. Tools to study cell mechanics and mechanotransduction. Methods in Cell Biology. 83 (07), 443-472 (2007).
  33. A-Hassan, E., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74, 1564-1578 (1998).
  34. Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. Non-Hertzian approach to analyzing mechanical properties of endothelial cells probed by atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128, 176-184 (2006).
  35. Xiong, Y., Lee, A. C., Suter, D. M., Lee, G. U. Topography and nanomechanics of live neuronal growth cones analyzed by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 96, 5060-5072 (2009).
  36. Byfield, F. J., et al. Absence of filamin A prevents cells from responding to stiffness gradients on gels coated with collagen but not fibronectin. Biophysical Journal. 96, 5095-5102 (2009).
  37. Cross, S. E., et al. AFM-based analysis of human metastatic cancer cells. Nanotechnology. 19, 384003 (2008).
  38. Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
  39. Wen, Q., Janmey, P. A. Polymer physics of the cytoskeleton. Current Opinion in Solid State & Materials Science. 15, 177-182 (2011).
  40. Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (02), 2798-2810 (2002).
  41. Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J. Vis. Exp. (44), e2072 (2010).
  42. Lim, S. M., Kreipe, B. A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells. Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).

Tags

Biofysica Biotechniek Cellular Biology Moleculaire Biologie Natuurkunde Chemische Technologie Biomechanica bio-ingenieur (algemeen) AFM cel stijfheid microindentation kracht spectroscopie atomic force microscopie microscopie
Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thomas, G., Burnham, N. A.,… More

Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), e50497, doi:10.3791/50497 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter