Summary
Bu kağıt bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak microindentation ile canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için bir protokol göstermektedir.
Abstract
Hücre ve hücre dışı matriks (ECM) mekanik özellikleri kök hücre farklılaşması, tümör oluşumu ve yara iyileşmesi gibi birçok biyolojik süreçlerde önemli rol oynar. Hücreler ve ECM sertliği değişiklikler genellikle hücre fizyolojisi veya doku hastalıklarında değişim işaretleri vardır. Bu nedenle, hücre sertlik hücre kültürlerinin durumunu değerlendirmek için bir endekstir. Hücre ve dokuların sertlik ölçmek için uygulanan yöntemler çok sayıda arasında, bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kullanarak mikro girinti güvenilir canlı hücrelerin sertliği ölçmek için bir yol sağlar. Bu yöntem, yaygın olarak metal yüzeyler yumuşak biyolojik dokular ve hücreler arasında değişen çeşitli malzemeler için mikro ölçekli sertliği karakterize etmek için uygulanmıştır. Bu yöntemin temel prensibi seçilen bir geometri AFM ucu olan bir hücre girinti ve AFM dirsekli bükme ile uygulanan kuvvet ölçmektir. Hertz moduna kuvvet girinti eğrisi takılmasıilgili uç geometrisi l malzeme sertliği kantitatif ölçümler verebilir. Bu kağıt AFM kullanarak canlı hücrelerin sertliği karakterize etmek için prosedürü göstermektedir. Bir MATLAB rutin kullanarak AFM kalibrasyon süreci, kuvvet eğrisi satın alma ve veri analizi de dahil olmak üzere önemli adımlar gösterilmektedir. Bu yöntemin sınırlamaları da tartışılmıştır.
Introduction
Tek tek hücrelerin kendi çevre hücre dışı matris mekanik özellikleri, özellikle sertlik, (ECM), hücre büyümesi, motilite, bölünmesi, farklılaşma ve doku homeostazında de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçleri için kritiktir. 1 Bu hücre mekanik sertliği esas olarak kararlı olduğu kanıtlanmıştır Aktin ve arafilamentlerin in vitro şebekelerinde üzerinde mekanik testlerden iskeleti, aktin ve ara filamentler ve onlarla ilişkili diğer proteinlerden, özellikle ağ. 2 Sonuç hücre mekanik iskelet yapısı ve ön-stres büyük ölçüde bağlı olduğunu düşündürmektedir hücre iskeleti. canlı hücrelerin 3-5 Sertlik sonra iskelet yapısı 6, miyozin aktivite 7 ve diğer birçok hücresel süreçleri değerlendirmek için bir dizin olarak kabul edilir. Daha da önemlisi, hücre mekanik özelliklerinde değişiklikler de genellikle yakından ilişkili olduğu bulunmuşturtümör oluşumu ve metastaz gibi çeşitli hastalık koşulları ile ated 8-10 İzleme canlı hücrelerin mekanik sertliği dolayısıyla hücre fizyolojisi izlemek için yeni bir yol sağlayabilir,. tespit etmek ve hastalıkları 8 teşhis etmek,. ve ilaç tedavilerinin etkinliğini değerlendirmek için 11 , 12
Parçacık izleme microrheology, 13-16 manyetik büküm sitometri, 17 mikropipet aspirasyon 18,19 ve microindentation 20-22 dahil olmak üzere birden çok yöntem hücrelerin esnekliğini ölçmek için geliştirilmiştir. Parçacık izleme microrheology hücre iskeleti içindeki hücreler ya da indirgeme işaretleri enjekte mikrondan küçük floresan parçacıkların birinin termal vibrasyonlar izler. Hücreler 23 elastik ve yapışkan özelliklerini salınım-kayıp teoremi kullanılarak ölçülen partikül değiştirmeler hesaplanır. 14,23 Bu yöntem sağlar: yerel eş zamanlı ölçümleriniBir hücrede farklı yerlerde yüksek uzaysal çözünürlüğü ile mekanik özellikleri. Bununla birlikte, parçacıkların hücre içine floresan enjekte hücresel işlevde değişikliği, hücre iskeletinin yapısı, ve bu nedenle hücre mekanik yol açabilir. Mikropipet aspirasyon yöntemi pipet içine hücre zarı küçük bir parça emmek için 1 ila 5 mikron arasında değişen çaplı bir mikropipet negatif basınç uygular. Hücre sertliği uygulanan negatif basınç, hücre membranı ve deformasyonu. 18 Bu yöntem ile hesaplanır, ancak, hücre boyunca sertliğinin heterojen dağılımı tespit edemez. Manyetik büküm sitometri (MTC) hücre zarı bağlı süper paramanyetik boncuk tork üretmek için manyetik alan uygulanır. 17 Hücre sertliği uygulanan tork ve hücre zarının büküm deformasyon arasındaki ilişki bu yöntemde elde edilir. Bu MTC yöntemde manyetik boncuk yerini kontrol etmek zordur, ve aynı zamanda bir challengiyüksek çözünürlüklü büküm deformasyon karakterize etmek ng. Microindentation hücre içine yumruk iyi tanımlanmış geometri ile bir delici geçerlidir. Girinti kuvvet ve hücrelerde ortaya çıkan girinti genellikle Hertz modelinin tahmin izleyin. Hücre Young modülü Hertz modeli onları takarak kuvvet girinti eğrileri hesaplanabilir. Bu yöntem yaygın olarak temas noktası belirleme, Hertz modelin uygulanabilirliği ve fiziksel olarak hücrelere zarar potansiyeline belirsizlik olarak sınırlamalar rağmen doku ve hücrelerin mekanik özelliklerini test etmek için uygulanmıştır. Microindentaion 20 için birçok cihaz arasında, bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM), ticari olarak mevcuttur ve yaygın olarak canlı hücreler ve dokuların 21,24-27 mekanik özelliklerini karakterize etmek için uygulanmıştır.
Bu kağıt hücre mekaniği karakterize bir Sığınma MFP3D-Bio AFM kullanarak prosedürü göstermektedir. AFM değil üzerindely hücrelerin yüksek çözünürlüklü topografya sağlar ama aynı zamanda yaygın doku hücrelerinin mekanik özelliklerini karakterize etmek için uygulanmıştır. AFM girinti çalışma prensibi Şekil 1 'de gösterilmiştir. AFM konsol üzerinde birkaç mikrometre hücre yaklaşımlar, hücre ile temas, girintiler hücre konsol sapma önceden seçilmiş bir ayar noktasına ulaşacak şekilde ve uzak hücreden çeker. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, bu süreç sırasında dirsekli bükülme konumu bir fonksiyonu olarak kaydedilmektedir. Hücre ile temas etmeden önce, konsol belirgin bir sapma olmadan ortamda hareket eder. Hücre, konsol virajlı ve sapma sinyali artar girinti zaman. Çıkma kendi saptırma hücreye tatbik edilen kuvvet ile orantılıdır, böylece elastik kirişler olarak modellenmiştir. En fazla konsol sapma ayarlayarak, örnek uygulanan kuvvetin maksimum büyüklüğü d önlemek için sınırlıdırhücrelere ermeden. Hücre içine ucu girintiler, hücre sertliği ayıklamak için hertz modele uygundur Şekil 1, c noktadan noktaya b kuvvet eğrisinin kısmı.
Şekil 1. AFM microindentation ve kuvvet eğrisinin yorumlanması İllüstrasyon. Üst paneli piezo tarayıcı tarafından tahrik AFM konsol hareketini gösterir. Konsol, z ve konsol sapma sinyalini d dikey konumu işlemi sırasında kaydedilir. Konsol noktası, hücrenin üstündeki birkaç mikrometre başlar. Hücre yaklaşırken iken uç hücre ile temas alanına, b ulaşıncaya kadar, örnek girinti δ sıfır olarak kalır. Arsa nokta b koordinatları kritik değerlerdirveri analizi için, (z 0, d 0>) ile gösterilir. B c, hücre içine konsol girintiler konsol sapma hedeflenen maksimum girinti gücü ve sürekli konsol bahar arasındaki oran olarak ayarlanmış bir ayar noktası, ulaşana kadar. Sapma sinyali önceden ayarlanmış maksimum değeri ulaştığında, konsol sonra, hücreden genellikle uç-örnek yapışma nedeniyle aşağıya çekilebilir noktası d, çekilmiş hücre ve döner e onun ilk konuma ayırır edilir. Sağ panel girinti ve kaydedilen z ve d sinyal arasındaki ilişkiyi göstermektedir. Sol alt panelde bulunan yay sabiti m / 0.07N olarak ölçüldüğü bir temsilcisi kuvveti eğrisi, bir konsol en fazla girinti, bir çizimidir fazla girinti kuvvet uygulanır ve böylece 17 nm olarak ayarlanmıştır Örnek 1.2 nN olduğunu. Girinti sırasında önemli yerlerde işaretlenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konsol ve Bahar Sabit kalibre
- Üreticinin talimatlarına göre AFM konsol içine yerleştirin. Bu, herhangi bir deney önce etanol ile konsol tutucu temizlenmesi gereklidir. Bu AFM ölçümleri sırasında kültüre bakteriyel kontaminasyon sınırı yardımcı olacaktır.
- InvOLS (Ters Optik Kol Hassasiyet) kalibre edin. Bu parametre konsol sapma nanometre başına fotodiyot yanıt (Volt) miktarını açıklar.
- Örnek sahneye temiz bir cam slayt yükleyin ve sonra üreticinin talimatlarına göre AFM baş yüklemek ve lazer ışını ve hizalama ayarlayın. Cam slayt AFM ucu meşgul.
- Piezo geri ile, -2 bir fotodiyot okuma ayna yeniden düzenlemek V. +2 tetik nokta (maksimum fotodiyot tepki) ile bir kuvvet spektroskopi ölçüm yapın V.
- Piezo geri ile, -2 bir fotodiyot okuma ayna yeniden düzenlemek V. fo gerçekleştirin+2 V. Not bir tetik nokta (maksimum fotodiyot tepki) ile rce spektroskopisi ölçümü: Burada gerilim değerleri Sığınma AFM özgüdür. Bu değer üretici tarafından sağlanan teknik özelliklere göre ayarlanmalıdır.
Veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, kuvvet eğrisinin firma temas bölgesi yakınlaştırmak. V / nm olacak eğim, bulmak için bu bölgeye doğrusal bir uyum gerçekleştirin. Bu değerin karşılıklı konsol-fotodiyot topluluk optik hassasiyeti açıklar. - 0 ücretsiz bir sapma için ayna uyum sıfırlayın V.
- Konsol yay sabiti kalibre edin. Bir ısı ayar yöntemi konsol 28 yay sabitesi olduğu da tespit etmek için kullanılır.
- InvOLS ayarladıktan sonra ucu ve örnek arasında etkileşim olduğunu bu örnek aşamasından tarayıcı uzak yükseltmek.
- Termal veri yakalama başlayın. Bu işlem sırasında, bir kirişin termal titreşim recorde olduğud. AFM yazılım böyle bir termal titreşim ve bir veri pencerede araziler bunun bir güç spektrumu analiz eder.
- Veri toplama bir kaç saniye sonra, yay sabiti belirlemek için düşük frekanslı (temel rezonans) zirvesinde merkezli veri kesimi için bir uyum gerçekleştirin.
2. Örnek yükleme
- AFM sahnede Bulaşık Isıtıcı aksesuar yükleyin, zaten varsa değil.
- 37 ° C'ye kadar sıcaklık ayarlama ve istikrarlı bir termal dengeye ulaşmak için sistem 20 dakika boyunca bekleyin.
- AFM sahnede kültür çanak yerleştirin ve çanak ısıtıcı ile sağlanan kelepçe kullanarak sabitleyin. Bu inkübatör çanak çıkarılması ve hücreler, travma önlemek için, sahne üzerine yerleştirerek arasındaki zamanı en aza indirmek için önemlidir. 30 dakika daha uzun bir ölçüm yapmak için, CO2 bağımsız ortamı, normal kültür ortamı değiştirmek için kullanılmalıdır.
- T ucuna 37 ° C kültür ortamı küçük bir damla uygulayıno AFM konsol ve ucu sadece sıvı batık kadar AFM baş indirin.
- Üst-view CCD kamera kullanarak, konsol (sıvı içinde uyum nedeniyle ortamın kırılma endeksi değişim, havada daha farklı olacaktır) üzerine lazer ışını yeniden hizalayın.
- Kültür çanak temiz bir alan üzerinde AFM ucu meşgul.
- Sıvı bir ortamda konsol hassasiyet için, yukarıda tarif edildiği gibi InvOLS kalibrasyonu yapın.
Not: hücreler hidrojeller üzerinde kültive edildiğinde, a) Eğer InvOLS arasında kalibrasyon hücre kültürü ortamı ile doldurulmuş bir kültür kabı alt yüzeyine karşı önceden yapılmalıdır. Hücre örnekleri geçiş yaparken, özel dikkat konsol ile lazer ışını hizalama değişmez ödenecek vardır. b) InvOLS lazer hizalama bir değişiklik olduğu takdirde tekrar kalibre edilmesi gerekir. c) Ayrıca çeşitli kalibrasyon eğrileri, s değerinin ortalaması olarak InvOLS almak tavsiye edilirher kalibrasyon farklı bir InvOLS oluşturur ince. InvOLS farklılaĢma ortalama değeri ile karşılaştırarak, ancak, küçüktür. Örneğin, 100 kat 0.06 Yok sıvı / m sabit yaylı bir Bruker DNP-10 konsol kalibre sadece 0.5 nm / standart sapma ile, 66.3 nm / V ortalama InvOLS değer üreten V.
3. Hücre Girinti Kuvvet Eğrileri Toplama
- Girinti için bir hücre seçin. Optik mikroskop yardımı ile, ucu, peri-çekirdek bölgesinde yer alır, böylece hücrenin üstündeki konsol konumlandırmak için sahne hareket eder. Konsol konumunun hassas ayarı X ve Y tarayıcılar için uzaklıklar uygulayarak gerçekleştirilebilir.
Not: AFM konsol bir hedef hücre seçmek için örnek sahne hareket ederken numune yüzeyinden geri gerekir. Örnek yüzeyi düz olmayabilir çünkü bu, örnek içine vurma gelen konsol korur. - Spektroskopisi modu Kuvvet geçin. Girinti ayarlayınhidrodinamik etkileri önlemek için yeterince düşük 1-10 mm / sn aralığında hızı.
- Hücrelere zarar vermemek için azami girinti kuvvetini sınırlandırır sapma tetik nokta, ayarlayın. Sapma sinyali herhangi bir sürüklenme için düzeltecektir Bağıl tetikleme seçeneği seçin. 2 nN en fazla gücü en örnekleri için iyi bir başlangıç noktasıdır. Bu değer, ancak, Örnek sertlik göre ayarlanmalıdır. Yumuşak örnekleri için daha düşük bir değere örnek aşırı girinti önlemek için kullanılmalıdır. Sert örnekleri için yüksek bir değer ölçülebilir girinti oluşturmak için kullanılmalıdır.
- Ucu tam kuvvet ölçümleri arasındaki hücre ayrılmış olacak sağlamak için yeterince büyük kuvvet mesafeyi ayarlayın. Genellikle, kuvvet mesafe 5 mikron olarak belirlenmiştir.
- Tek bir güç eğrisi almak için AFM komut.
- Her hücrenin peri-çekirdek bölgesinde farklı yerlerde en az üç kuvvet eğrileri toplayın. Birden fazla çekmek için yararlı olmakla birlikteçok fazla güç eğrileri alarak güvenilir istatistiki veriler için her hücre üzerinde eğriler, AFM prob alacaklar strese hücre sertlik değişikliklere yol açabilir.
- Veri toplama tamamlandığında, ucu geri ve belirli bir örnek koşul altında hücre sertliği üzerinde iyi istatistiki veriler için gerektiği kadar tekrar kadar hücreler için 3.1-3.6 adımları. Genellikle, 30 hücreleri her bir durum için ölçülür.
Tek bir hücre içinde sertlik dağılımını karakterize için, zorla harita modu uygulanır. Kuvvet-Harita modunda, ilgi bölgeye dahil etmek için bir tarama boyutunu ayarlamak; uygun bir çözünürlük ayarlamak; tek bir güç eğrileri için seçilen gibi girinti parametrelerini ayarlamak, AFM sonra tanımlanan örnek alan üzerinde raster ve tek bir güç eğrileri almak Örnek bölgedeki her bir pikselde.
4. Veri Analizi
Kaydedilen kuvvet eğrileri hücre sertliği hesaplamak için özel bir MATLAB prosedürü kullanılarak analiz edilmektedir. Aşağıdaki MATLAB prosedürün kısa bir açıklaması:
- . MATLAB programı temas noktası Lin ve arkadaşları tarafından yayınlanan bir yöntemi kabul bir algoritma 29 kullanılarak (bkz. Şekil 1) z0 ve d0 koordine tanımlar:
- Kadar ayarlamak için, kuvvet eğrisi her veri noktası için, ilgi noktasının solunda verilerin doğrusal bir uyum gerçekleştirmek ve Hertz modeli doğru (temas başlangıç noktası olarak seçilen noktasını kullanarak) için uygun maksimum girinti (200-300 nm önerilir).
- Her nokta için, her iki uyan göreli RMS hata hesaplamak ve bu değerleri toplamı.
- Minimum toplam montaj hatası elde ediyor Nokta ilk noktası olarak seçilir.
Not: Hesaplama zaman yerine doğrusal tüm güç eğrisi tarama daha altın bölüm arama uygulayarak azaltılabilir. - Örnek deformasyon δ ve kuvvet F girinti olarak hesaplanır:
- En küçük kareler uydurma vs F uyacak şekilde uygulanır sonrası temas bölgesinde δ veri, z ≥ z 0, en Young modülü, hücrenin E ayıklamak için Hertz modeli için:
, V Poisson oranıdır.
Not: δ numune kalınlığının (hücre yükseklik)% 10'dan fazla olduğunda, ölçülen hücre sertliği tabaka sertliği ile etkilenir. Peri-nükleer bölgenin kalınlığı genellikle birkaç mikrometre civarındadır. Bu nedenle, F-δ eğrisinin sadece ilk 200-300 nm Hertz modeline uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2a sırasıyla plastik yüzey, Young modülü 3000 Pa ve 17.000 Pa poliakrilamid jel, kültüre 3T3 fibroblast alınan üç temsilcisi güç eğrilerini gösterir. Dikkatlice eğrileri temas noktaları tespit edilmesinden sonra, hücre deformasyon fonksiyonu olarak girinti kuvvet Şekil 2b'de çizilir. 0.3 nN, 3 kPa poliakrilamid jel üzerinde kültüre bir hücreye bir piramit şekli ucu girintiler 3 mikrometre daha küçük büyüklükte bir kuvvet altında. Buna karşılık, bir güç fazla 1.6 nN aynı ucunu kullanarak düz kültür çanak yetişen hücreye 500 nanometre girinti için gereklidir. Yumuşak poliakrilamid jel üzerinde kültüre hücre sert kültür çanak kültüre hücre daha yumuşak olduğunu bu grafikten açıktır. Hertz modeline kuvvet-δ eğrilerinin ilk parça (δ <30 nm) takılması sırasıyla, 10 kPa, 1.2 kPa ve 1.10 kPa bu üç hücre Young modülü verir. Kültür HücrelerE çanak poliakrilamid jeller kültüre hücreler 100 kat daha sert olan. Solon ve ark. 'E benzer sonuç 25 bildirilmiştir. Onlar fibroblastlar aktif olarak bağlı yüzeylerin sertliği maç kendi cytoskeletons pekiştirmek bulundu. Sert yüzeyler 30, kültüre edildiği zaman pek çok diğer hücre tipleri aynı zamanda sert olmak için rapor edilmiştir.
Bu girinti hücrelerinde plastik deformasyon neden olabilir dikkat etmek önemlidir, hangi mor eğri gösterildiği gibi karışıklığı sonuçlanır. Normal olarak, bu tür eğrileri veri analizine dahil edilmelidir. Bununla birlikte, hala eğri uydurma tutulma veri aralığının dışında ise, hücre sertliğini hesaplamak için kullanılabilir. Örneğin, mor eğrisindeki bükülme yaklaşık 400 nm dalga boyunda gerçekleşir. Bu eğri hala 1.2 kPa sertlik değeri elde etmek için Hertz modele sadece kadar δ için = 30 nm veri uydurma ile analiz edilebilir. Inci göre "tetikleme noktası" ayarlamak için de önemlidire örnek sertlik. Örneğin, mavi eğri 3 kPa'dan poliakrilamid jeli üzerinde kültüre yumuşak bir hücreden alınır. Hücre içine 5 nm, AFM ucu girintiler 3 mikrometre göreceli sapma tetik nokta ayarlama. Bu kopma hücre zarı olabilir ve hücre öldürmek beri böyle büyük bir girinti, hücre sertlik ölçümleri sırasında önlenmelidir. Kuvvet eğrisi satın alma sırasında ucu hız ve veri toplama hızı da dahil olmak üzere birçok faktör elde kuvvet eğrileri ve dolayısıyla hücrelerin 31 ortaya çıkan sertlik kalitesini etkileyebilir. Güvenilir ölçümler yapmak için bir doğrusal olmayan artan sonrası temas parçası ardından düz ön temas parçası olan Şekil 2a, gösterilen kırmızı eğri olarak "temiz" güç eğrileri elde etmek için tüm bu parametreleri ayarlamak için gereklidir.
Şekil 3a bir hücre kültürü çanak bir 3T3 fibroblast bir floresan görüntü gösterir. Hücre, GFP ile transfekte edilmektedir vimentinara filamentler bir tür. AFM Kuvvet-haritalama 32 x 32 piksel çözünürlüğe sahip, 80 mikron alan bu 80 mikron olarak gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sertlik haritası Şekil 3b'de gösterilmiştir. Sertlik hücre arasında değişir. Ve, lamellipodium bölge sert çekirdeği çevreleyen peri-nükleer bölge daha sert ve daha heterojen.
Şekil 2. Kuvvet eğrisi verileri ve analiz kuvvet girinti eğrisi. A) camına kültüre 3T3 fibroblast için alınan üç temsilcisi güç eğrisi veri kümesi (kırmızı), 17 kPa poliakrilamid jel (mor) ve 3 kPa poliakrilamid jel (mavi). Eğrileri temas noktası (z 0, d 0) koordinat kökeni (0,0) yer almaktadır böylece kaydırılırsistemi. b) girinti-kuvvet eğrileri girinti sadece ilk 300 nm kullanarak Hertz modeline girinti veri) ve montaj hesaplanır. ) B ilave girinti ilk 300 nm için Hertz modeline uyum iyiliğini gösterir; daireler deneysel veriler, çizgiler uygun verileri temsil eder. Konsol sürekli bahar 0.062 Yok bu durumda / m'dir.
Şekil 3,. a) 3T3 fibroblast Floresans görüntüsü vimentin GFP ile transfekte. hücrenin sadece bir bölümü görüntü gösterilir. Ölçek çubuğu 20 mikron aynı alan. B) 32 x 32 piksel sertlik haritası temsil eder. Her piksel 2.5 mikron temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AFM girinti yöntemi canlı hücrelerin mekanik özelliklerini karakterize etmek için avantajları vardır. Piconewton düzeyinde 32 kuvvetleri ölçebilirsiniz manyetik büküm sitometri ve optik cımbız, daha az hassas olsa, AFM kuvvet aralığı ile karşılaştırılabilir pico-Newton onlarca nano-Newton yüzlerce kadar örnekleri, gelen direnç kuvveti algılayabilir Mikropipet 19 kullanarak hücrelere uygulanabilir. Kuvvet Bu dizi hücre 19 her türlü ölçülebilir deformasyonlar oluşturmak için ihtiyaçlarına uygun. Yüksek uzaysal çözünürlüğü mümkün mikron altı düzeyde 33 dokularda ve tek hücre içinde heterojenite karakterize etmek için yapar. Ayrıca gerçek zamanlı canlı hücre ölçümleri sağlar. Biyolojik örnekler için tasarlanmış çeşitli AFM modelleri bir sıvı ortamda çalışabilir ve hassas sıcaklık kontrolü sağlayan ısıtmalı örnek aşamaları, ile donatılmıştır, bu mümkün bir fizyolojik ortamını korumak için yapımÖlçümler sırasında canlı hücreler için ca ortam. AFM girinti başarılı bir şekilde hücre tipleri, 25,34-36, bir dizi mekanik özelliklerinin ölçülmesi için tatbik edilmiştir ve hücresel farklılaşma ile ilişkili hücrelerin mekanik özellikleri ve çeşitli hastalıklı bağlamlarda değerlendirilmesi değişiklikler için yaygın olarak kullanılmaktadır. 30,37
Kuvvet eğrisinden sertliği hesaplamak için önemli bir adım ucu ilk hücre ile temas ettiği noktaya tespitidir. Temas noktası belirsizlik elastik modülü 31 etkileyebilir. Sert malzemeler için, sapma sinyali aniden ucu-örnek temastan sonra artar ve temas noktası kolayca eğrileri dönüm noktası olarak tanımlanır. Böyle keskin bir dönüm noktası, ancak, genellikle düşük hücre sertlik (bkz. Şekil 2) nedeniyle hücrelerden kuvvet eğrileri, görünmez. Bir MATLAB kodu doğru yürürlükte virajlarda temas noktaları bulmak için geliştirilmiştirLin ve arkadaşları tarafından önerilen algoritma kullanarak yumuşak örneklerinden. 29 kod bize otomatik olarak temas noktası arıyor ve Hertz modeline girinti veri uydurma, veri analizi sürecini otomatikleştirmek sağlayan yumuşak örnekleri, gelen kuvvet eğrileri işleyebilir. MATLAB kodu sertlik toplu reoloji ölçümleri ile 7.2 kPa olmak ölçü olan bir poliakrilamid jel aynı yerde, alınan 60 yürürlükte virajlarda temas noktaları belirlemek için uygulanır. Kod bu eğrileri puan irtibata tespit. Temas noktası yerde varyasyon aralığı 15 nm daha küçüktür. Bu temas noktaları dayanarak, hesaplanan ortalama sertlik 6.9 kPa olan, standart sapma 0.2 kPa, ve değişim 0,6 kPa maksimum aralığıdır. Bu deneyde elde edilen sonuçlar, ölçülen sertlik belirsizliğini değerlendirmek için bir ölçü sağlar. Ortalama valu az% 10 olan sertliği bir belirsizlik, içinde temas noktası sonuçlarında 15 nm belirsizlike. Sapma sinyalinin çok düşük seviyede yumuşak jeller için, temas noktası belirsizlik 30 nm,% 30 gibi yüksek sertlik bir belirsizliğe neden kadar yüksek olabilir. Kod Bu makalenin ek olarak kullanılabilir.
AFM güvenilir en doku ve hücreler için sertlik aralığını kapsayan az 100 Pa 10 6 Pa arasında değişen sertlik, ölçebilirsiniz. Güvenilir ölçümler için, iyi örnek sertlik uyumlu yay sabitleri ile AFM konsol seçmek önemlidir. Konsol çok sert olduğu zaman, onun sapma tespit etmek çok küçük ve hücre zarar verebilir, konsol çok yumuşak ise, güvenilir malzeme özellikleri elde etmek için yeterli hücre girinti olmaz ve termal titreşim kuvvet eğrisi hakim. Bir piramit ucu ile 0,06 N / m konsol sert kültür kaplarına kültüre çoğu hücre türleri için geçerlidir. Bu konsol Bununla birlikte, üzerinde kültüre edilmiş hücreler ölçmek için geçerli değildiryumuşak yüzeylerde. Şekil 2'de gösterildiği gibi, bir 3000 Pa poliakrilamid jeli üzerinde kültüre hücre, bir 3 um girinti konsol bir saptırma 5 nm üretmek için gerekli olduğu kadar yumuşaktır. Güç eğrisi öncesi temas ve sonrası temas bölgesi arasında çok az fark olduğunu çok düz. Bu da temas noktası, büyük belirsizlik ve bu nedenle elde edilen sertlik değerlerine yol açar. Daha yumuşak bir konsol kullanarak sadece biraz öncesi temas ve sonrası temas bölgeleri arasında kontrastı artırır. Ölçüm için, yumuşak malzemeler, büyük küresel ucu ile konsol tavsiye edilir. Çapı 10 mikrometre arasında bir küresel ucu olan bir 0.06 N / m dirsekli mafsal ucu ile 100 Pa Sundurmalar daha düşük sertliği birçok satıcılardan ticari olarak temin edilebilir olan örneklerde ölçülmesi için tatbik edilebilir. Onlar aynı zamanda özel yapımı tipless konsol için yapıştırma mikroküreler tarafından. Küresel uçlarına daha büyük bir sapma sinyalini vermek ve hücre zarına zarar görmesini önler. However, bu hücreler ile geniş bir temas alanı nedeniyle yüksek çözünürlüklü sertlik haritalama için geçerli değildir. Tablo 1 hücre sertlik ölçümleri için tavsiye AFM prob bir listesini sağlar.
| Model | Yay sabiti (N / m) | İpucu Tipi | İpucu yarıçapı (nm) |
| Bruker DNP10-D | 0.06 | Piramit | 20 |
| Bruker MLCT-B/C/E | 0.01/0.02/0.03 | Piramit | 20 |
| Novascan PT.GS | 0.01/0.03/0.06 | Cam küre | 2.000 / 5.000 / 10.000 |
| Novascan PT.PS | 0.01/0.03/0.06 | Polistiren Küre | 1000/4500 / 10,000 |
Tablo 1. Bir sehücre girinti için geçerli yay sabiti ve bahşiş geometri ile AFM prob biriktirme.
Yöntemin sınırlamalar da işaretlenmiş olmalıdır. Girinti veri sığacak şekilde uygulanmıştır Hertz modeli basit bir modeldir. Bu eksenel simetrik indenters tarafından tamamen elastik malzeme sonsuz girintiler için kuvvet-girinti ilişki tahmin. Hertz modelin varsayımları bazı hücre girinti için geçerli değildir.
Heterojen bir hücre (bkz. Şekil 3) ve doğrusal olmayan elastik ise Hertz modeli, homojen ve doğrusal elastik bir malzeme varsayar. Lamellipodium bölgede, bu nedeniyle aktin hücre iskeletinin heterojen yapısı oldukça homojen olmayan bir. Bir hücrenin mekanik sertliği nispeten homojen perinükleer bölgede elde edilen üç ya da daha fazla güç eğrileri elde edilen ortalama sertlik olarak rapor edilir. 25,36 networ yeniden yapılandırılmışaktin ve ara filament ks gerginlik-sertleşme malzemeler, yani daha büyük deformasyonlar de sert bulunmaktadır. 38,39 Böyle bir doğrusal olmayan esneklik canlı hücreler için gözlenen, ancak Hertz modelinde sorumluydu değil edilmiştir. Bildirilen hücre sertliği üzerinde doğrusal olmayan esneklik etkisini sınırlamak için, girinti verilerin sadece ilk 300 nm Hertz modeline uygundur.
Ayrıca, malzeme tamamen elastik olduğu Hertz modelinde varsayılır. Ancak, hücre ve hücre iskeleti viskoelastik malzeme ölçüm zaman ölçeği bağlıdır sertliği vardır. Daha kısa bir zaman ölçeğinde, konsol saptırma özellikle hücrelerin elastik karşılık gelir. Uzun bir zaman ölçeğinde, ancak, Örnek sürünür ve daha yumuşak bir tepki verir. AFM girinti zaman ölçeğinde ucu hızı ile kontrol edilir. Kuvvet eğrileri aynı girinti velo ile elde edilen zaman Bu nedenle, hücre sertlik gözlenen fark sadece anlamlıdırşehir. Kantitatif hücrelerinin sıklığı bağımlı viskoelastisitesinin ayıklamak için, AFM "güç modülasyon" yöntemi daha büyük bir girinti 21,27 üzerine yüksek frekanslı küçük genlikli titreşimler uygulanarak geliştirilmiştir.
Hertz modelinde sonsuz örnek kalınlığı varsayımı hücreler için geçerli değildir. Hücreler tipik olarak bir perinükleer bölgede birkaç mikrometre kalınlığında ve lamel bölge için kalın bir kaç yüz nanometre. Düzeltmeler sonlu örnek kalınlığı için hesap yapılmıştır. Kuvvet haritalama elde edilen 31,40 Veri girinti veri ve hücre yükseklik verileri de içerir. Yerel numune kalınlığının yüksekliği verilerinden hesaplanabilir. Gelecek iş gücü-haritalama veri analizinde örnek kalınlığı düzeltmeleri uygulamak için gereklidir.
Özetle, bu kağıt bir Sığınma MFP3D-Bio atomik kuvvet MICR kullanarak canlı hücreler mekanik sertliği karakterize etmek için bir protokol sunarOscope. AFM çalışma prensipleri ve MATLAB veri analizi prosedürü diğer tüm AFM model için de geçerlidir. Son yıllarda, parlak bir alan, konfokal mikroskopi ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRF) dahil olmak üzere optik mikroskopi teknikleri mekanik uyaranlara hücrelerin gerçek zamanlı görüntüleme için AFM ile kombine edilmiştir. 41,42 Bu kurulumları da eş zamanlı ölçümleri izin hücre mekaniği ve hücre iskelet yapısı görüntüleme. Yerel hücre iskelet yapısı dağılımı için yerel sertlik verileri ilişkilendirerek hücre iskelet yapısı hücre mekaniği katkıda hakkında anlayışlı bilgi verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar bu çalışmada kullanılan hücre hatları sağlamak için Pennsylvania Üniversitesi'nden Dr Paul Janmey teşekkür ederim. QW da AFM teknikleri üzerine anlayışlı tartışmalar için JF Byfield ve Evan Anderson kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atomic Force Microscope | Asylum Research | MFP3D-BIO |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Wagner, O. I., et al. Softness, strength and self-repair in intermediate filament networks. Exp. Cell Res. 313, 2228-2235 (2007).
- Wang, N., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 7765-7770 (2001).
- Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282, 606-616 (2002).
- Kasza, K. E., et al. Filamin A is essential for active cell stiffening but not passive stiffening under external force. Biophysical Journal. 96, 4326-4335 (2009).
- Elson, E. L. Cellular mechanics as an indicator of cytoskeletal structure and function. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 397-430 (1988).
- Schafer, A., Radmacher, M. Influence of myosin II activity on stiffness of fibroblast cells. Acta Biomaterialia. 1, 273-280 (2005).
- Guck, J., et al. Optical deformability as an inherent cell marker for testing malignant transformation and metastatic competence. Biophysical Journal. 88, 3689-3698 (2005).
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients. Nature Nanotechnology. 2, 780-783 (2007).
- Plodinec, M., et al. The nanomechanical signature of breast cancer. Nature Nanotechnology. 7, 757-765 (2012).
- Rotsch, C., Radmacher, M. Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts: an atomic force microscopy study. Biophysical Journal. 78 (00), 520-535 (2000).
- Cross, S. E., Jin, Y. S., Lu, Q. Y., Rao, J., Gimzewski, J. K. Green tea extract selectively targets nanomechanics of live metastatic cancer cells. Nanotechnology. 22, 215101 (2011).
- Hoffman, B. D., Crocker, J. C. Cell mechanics: dissecting the physical responses of cells to force. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 259-288 (2009).
- Hoffman, B. D., Massiera, G., Van Citters, K. M., Crocker, J. C. The consensus mechanics of cultured mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10259-10264 (2006).
- Lau, A. W., Hoffman, B. D., Davies, A., Crocker, J. C., Lubensky, T. C. Microrheology, stress fluctuations, and active behavior of living cells. Physical Review Letters. 91, 198101 (1981).
- Liu, J., et al. Microrheology probes length scale dependent rheology. Physical Review Letters. 96, 118104 (2006).
- Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5, 636-640 (2006).
- Oh, M. J., Kuhr, F., Byfield, F., Levitan, I. Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness. J. Vis. Exp. (67), e3886 (2012).
- Hochmuth, R. M.
- Levental, I., et al. A simple indentation device for measuring micrometer-scale tissue stiffness. J. Phys-Condens. Mat. 22, (2010).
- Mahaffy, R. E., Park, S., Gerde, E., Kas, J., Shih, C. K. Quantitative analysis of the viscoelastic properties of thin regions of fibroblasts using atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86, 1777-1793 (2004).
- Radmacher, M. Measuring the elastic properties of biological samples with the AFM. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine: The Quarterly Magazine of the Engineering in Medicine & Biology Society. 16, 47-57 (1997).
- Crocker, J. C., Hoffman, B. D. Multiple-particle tracking and two-point microrheology in cells. Methods in Cell Biology. 83, 141-178 (2007).
- Liu, F., Tschumperlin, D. J. Micro-mechanical characterization of lung tissue using atomic force microscopy. J. Vis. Exp. (54), e2911 (2011).
- Solon, J., Levental, I., Sengupta, K., Georges, P. C., Janmey, P. A. Fibroblast adaptation and stiffness matching to soft elastic substrates. Biophysical Journal. 93, 4453-4461 (2007).
- Wu, H. W., Kuhn, T., Moy, V. T. Mechanical properties of l929 cells measured by atomic force microscopy: Effects of anticytoskeletal drugs and membrane crosslinking. Scanning. 20, 389-397 (1998).
- Radmacher, M., Fritz, M., Kacher, C. M., Cleveland, J. P., Hansma, P. K. Measuring the viscoelastic properties of human platelets with the atomic force microscope. Biophysical Journal. 70, 556-567 (1996).
- Levy, R., Maaloum, M. Measuring the spring constant of atomic force microscope cantilevers: thermal fluctuations and other methods. Nanotechnology. 13, 33-37 (2002).
- Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129, 430-440 (2007).
- Davis, J. T., Wen, Q., Janmey, P. A., Otteson, D. C., Foster, W. J. Muller cell expression of genes implicated in proliferative vitreoretinopathy is influenced by substrate elastic modulus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3014-3019 (2012).
- Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. Microtissue elasticity: Measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation. Method Cell Biol. 83, 521-545 (2007).
- Lele, T. P., et al. Tools to study cell mechanics and mechanotransduction. Methods in Cell Biology. 83 (07), 443-472 (2007).
- A-Hassan, E., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74, 1564-1578 (1998).
- Costa, K. D., Sim, A. J., Yin, F. C. Non-Hertzian approach to analyzing mechanical properties of endothelial cells probed by atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 128, 176-184 (2006).
- Xiong, Y., Lee, A. C., Suter, D. M., Lee, G. U. Topography and nanomechanics of live neuronal growth cones analyzed by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 96, 5060-5072 (2009).
- Byfield, F. J., et al. Absence of filamin A prevents cells from responding to stiffness gradients on gels coated with collagen but not fibronectin. Biophysical Journal. 96, 5095-5102 (2009).
- Cross, S. E., et al. AFM-based analysis of human metastatic cancer cells. Nanotechnology. 19, 384003 (2008).
- Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A.
- Wen, Q., Janmey, P. A.
- Dimitriadis, E. K., Horkay, F., Maresca, J., Kachar, B., Chadwick, R. S. Determination of elastic moduli of thin layers of soft material using the atomic force microscope. Biophysical Journal. 82 (02), 2798-2810 (2002).
- Trache, A., Lim, S. M. Live cell response to mechanical stimulation studied by integrated optical and atomic force microscopy. J. Vis. Exp. (44), e2072 (2010).
- Lim, S. M., Kreipe, B. A., Trzeciakowski, J., Dangott, L., Trache, A. Extracellular matrix effect on RhoA signaling modulation in vascular smooth muscle cells. Exp. Cell Res. 316, 2833-2848 (2010).
