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Environment

非侵襲的方法 doi: 10.3791/50498 Published: February 7, 2014

Summary

アメリカンロブスター漁業として利用甲殻類漁業への漁業による変化、潜在的に交尾の成功が低下する、生殖ダイナミクスに影響を与える可能性があります。この研究の目標は、生理学的または機能的に成熟したことが女性のロブスターの交尾の成功を確認するための非侵襲的方法を開発することでした。

Abstract

北西大西洋で最も生産漁業の1であるにもかかわらず、多くのアメリカのロブスターの自然な生殖ダイナミクスについて不明である。悪用甲殻類の個体数(カニやエビ)での最近の研究は、成熟したメスによる精子の制限により、完全な生殖能力を達成することができない事情があることを示唆している。アメリカンロブスター漁業の異なる領域にこの可能性を検討するために、信頼性があり、非侵襲的方法は、海上で女性のロブスターを大量にサンプリングするために開発されました。この方法は、精子プラグの有無を判定し、精子の存在について調べることができる試料を撤回する雌の精液容器に鈍い先端が針を挿入することを含む。制御一連の研究は、この技術の信頼性をテストするために、ドックで、実験室で行った。こうした努力は、294の女性ロブスターを確認するために、サンプリングを伴うことプレゼンスOFA精子プラグは、信頼性の高い容器の中の精子の指標、したがって、交配した。本論文では、方法論とサンプリングされた合計の女性のサブセットから得られた結果の詳細を示します。ジョージの銀行とCape Annのマサチューセッツ(甲長サイズ範囲= 71〜145ミリメートル)からサンプリングされた230の女性ロブスターのうち、90.3%が精子陽性であった。一部の女性では精子の不在のための潜在的な説明は次のとおりです。未熟さ(生理学的成熟がないこと)、卵のクラッチを受精するために使用された後の精子のプラグの故障、と相手活性の欠如を。調査は女性のロブスターの交尾の成功を調べるため、この手法は、自然集団における生殖活動を文書化する分野で使用可能な信頼性の高いプロキシであることを示している。

Introduction

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アメリカンロブスター( ロブスターのamericanus)は、北大西洋(〜3.9億ドルかけて評価され、2011年に56,000 MT、)1の中で最も生産的な漁業の一つです。しかし、野生の個体群におけるこの種の生殖ダイナミクスに関する理解の一般的な不足があります。積極的に再生に参加する人々の数とサイズを含む生殖出力のより正確な推定値を、生成することは、資源評価プロセスを改善することがあります。イセエビ2、ワタリガニ3、キングカニ4、石のカニ5、およびズワイガニたとえばによる精子の制限のため、完全な生殖能力を達成することを防止することができる女性はを含むいくつかの商業的搾取の海洋甲殻類の懸念として同定されている6。全体的な目標は、精子の制限が同様にアメリカのロブスター漁業のある領域に要因になるかどうかを判断することです。

NT ">(目に見えて無傷で、最近になって押し出さ卵)抱卵雌のロブスターと関係のないタグ付けの研究を行いながらロブスターの潜在的な精子の制限の問題の最初の兆候が観察された。〜これらの動物の15%が低下したことを示した漁師からレポートを奪還彼らの卵のクラッチわずか1〜2ヶ月後。作業仮説は、いくつかのロブスターは、結果として、7 '落ちた'、受精とされていなかった。その後の研究の予備的データはロブスターがあるという事実を確認した卵を運んでいたということでした彼らが成功して交配しておらず、これらの未受精卵にのみ〜1ヶ月8用に運ばれていても、卵を押し出しているため、自然集団における未受精卵を運ぶ人の女性の観察を考えると、我々は精子の制限はに貢献するかもしれない程度を決定しようとした性的に成熟したロブスターによる再生の最大下のレベル。この目標を達成するために、技術がspermatoを検出するために開発されました交配中に男性が堆積phore。

本論文では、ビデオは、女性のロブスターの交尾の成功を確認するために開発された非侵襲的な、簡単な方法を説明します。技術は海で、いずれかの研究や商業漁船に乗って迅速かつ確実に利用することができる。このサンプリング方法の詳細だけでなく、いくつかの代表的な知見は、技術の適用を例示するために提示される。

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Protocol

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パートA:フィールドサンプリングテクニック

1。女性の測定

  1. 各女性のロブスターは、甲長(CL)およびキャリパーのペアを使用して、最も近い1.0ミリメートルの第二の腹部のセグメントの幅を測定。
    注:(雌は卵を運ぶ)腹部の幅は性成熟の指標であるので、第2腹節が測定される。また、(ステップ1.2参照)に保存生殖成長段階で、これらのデータと一致するように脱皮段階を確認するために有利であり得る。
  2. 腹部の腹肢(ロブスター内の標準方法論のプロトコル)の1から小さな遠位部をクリップし、後に解剖顕微鏡9で観察するためのクリーンな海水で腹肢を保存する。
    注:このステップはまた、女性が自分の卵10を押し出すために準備をしている指標である腹肢、上のセメント腺の存在を明らかに可能性があります。

2。針INSErtion

  1. (、18 G、表1を参照)注射針を挿入〜45°( 図1)〜尾に向かって角度のついた精液のレセプタクルに1cmの。
    注:それは前に精液レセプタクル( 図1)の下部にある精子の最高濃度に到達する精子のプラグを介してプッシュされるように完全な精子プラグが付いているロブスターでは、針は、挿入の間に多少の抵抗を満たすことがあります。
    注:プラグの存在は、それ自体では、ロブスターが交尾している信頼性の高い指標である。いくつかの動物ではない精包が存在しない可能性があるため、ほとんど抵抗があってもよい、精包は、それがまだプラグに硬化していないか、またはそれが既に卵の一つ以上のクラッチを受精するのに使用されている可能性が小さい。

図1 図1。針の挿入やロブスター精液レセプタクルの眺め。精子サンプルを抽出するロブスターの精液レセプタクルに鈍先端が針を挿入。針の角度と深さは、両方の一貫性のあるサンプルを得るために重要である。右:解剖し、縦方向に分割されている精液のレセプタクルの眺め。精子が容器の下部(最深部)に位置している間、精子のプラグは、コンセントの上部または最も外側の部分を占めている。それは、この深さ以下のサンプリングはレセプタクルを穿刺し、血液で汚染されたサンプルをもたらすかもしれないことに注意することが重要である。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください

3。精子プラグを貫通

  1. 最初の挿入後に、(体軸に垂直な)ほぼ垂直に、針の角度を急勾配にし、非常にゆっくりと作業を開始下向きレセプタクルに。
  2. 先端が尾の方に少し指摘されるような角度で傾いた針を保管してください。それが最終的にマトリックスに浸透するまで、この場合、針の先端は、プラグの上部を圧縮している。
  3. 抵抗をもう一度感じられるまで徐々に下方向に針をプッシュし続ける - これは、容器の底部にあり、どこでサンプルが採取されている。

4。精子の取り外し

  1. レセプタクルの底からのサンプル(しばしば固体プラグ材料、液状精子と他の流体)を外し、ラベルされた2.0ミリリットルのプラスチックチューブにサンプルを堆積させる。
  2. 冷たい海水〜0.1〜0.5ミリリットルとレセプタクルをフラッシュします。
  3. 同じチューブ内の流体と場所の約0.3ミリリットルを削除します。
  4. 氷上ストア精子サンプル彼らは実験室で検査することができるようになるまで。
    パートB:ラボでの精子サンプルの検討
    注:個々のLの精液コンセントから取り外しサンプル obstersは精子細胞が存在するか存在しないかどうかを決定するために検討すべきである。
  5. 各プラスチック製のチューブ、カバーガラスでガラススライド上の場所、および複合顕微鏡で100倍の視野から〜流体の50μLを削除します。
  6. としてサンプルスコア:希少数多く、または存在しない精子(本研究では、実際の精子数図2を定量化しなかった)。

図2
図2。ロブスター精子サンプル画像。40X倍率の複合顕微鏡で見たときに、女性の精液コンセントから取ったロブスター精子サンプルの画像。左の画像は、他の(右)スパースサンプル(スケールバー= 10μm)を示しているが、多数の精子が含まれていたサンプルを示しています。。JPG「標的= "_blank">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

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Representative Results

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ここに報告されたデータは沿岸と沖合の場所の両方から発信され、女性ロブスターのサブセットでした。沿岸グループはCape Annの、マサチューセッツ州に近い沿岸海域で捕獲され、検査のための実験室にクーラーに輸送された44ロブスターで構成されていた。 186 offshoreロブスターの合計は、ジョージ銀行でキャプチャされ、ニューハンプシャー州における商業holding施設でサンプリングした。

精子サンプルは、すべての動物から得て、すぐ上に記載した方法に従って、精子の有無を調べた。このサブセット内のすべての人の女性の90.3%の合計は、その独創的なコンセントで精子を持っていた。驚くべきことに、精子を欠いていたものは、サイズ範囲の小さい方の端( 図3)である必要はありませんでした。

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図3。ロブスター中の精子の存在のためのサンプリング結果 、相手の指標としての精液の容器に精子を持っていた5ミリメートルのCLサイズクラスのビン(パーセント正)女性ロブスターのパーセント 。メスは海からCape Annの、マサチューセッツ州(71〜83ミリメートルCL)に近く、ジョージ銀行(89〜154ミリメートルCL)からキャプチャされた。バー内部の数字は、そのビンの合計サンプルサイズを表しています。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください

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Discussion

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この動画と紙輪郭と雌ロブスターが正常交配しているかどうかを決定するための方法を実証する。このアプローチは、ユーザーの様々な海でのロブスターの大規模なサンプリングのために使用できることが十分に単純である。この方法は、交配の際にオスからメスのロブスターに渡される精液の容器に精包の存在を検出することに基づいています。これら精包は、部分的に、それらが容器内に堆積された直後の精子プラグに硬化するため、精子のプラグの存在はまた、交配の成功の指標である。この研究、ならびにその後の大規模な研究では、精子プラグのほとんどが精子それら11に関連付けられていたことを決定した。プラグの存在が交尾活動の信頼できる指標でありながら、しかし、その不在ではありません。

このサンプリング方法は、産卵のた​​め女性のロブスターの能力にマイナスの影響を被る場合、我々は完全に確信することはできませんが首尾よく彼らの卵のクラッチを受精さdは、損傷が精包またはレセプタクルのいずれかに最小限であることを示唆している、この精子の採取プロトコルへの側面があります。まだそこに卵の受精クラッチを押し出すいくつかのロブスターを示している(進行中の実験室研究からの)データを、後の精子のサンプリングであり、(n = 3)を、同じ精包を用いて卵の複数のクラッチを受精することができる。これらの卵は開発し、サンプルされていないロブスターと同様に孵化。また、このサンプリング技術は、総精子の小部分をサンプリングするように働く。これは、定量的に、容器の全内容をサンプリングすることを意図するものではない。によるレセプタクル12,13の複雑な物理的アーキテクチャ、異なる手法( 例えば、切開)の結果をそれらの種類を得るために必要とされるであろう。

精包は比較的Nだった可能性があるため精子は、精子のプラグを欠いていたサンプリングされた動物の数に発見されたEW、まだプラグに硬化していなかったか、精包は、以前の卵の1以上のクラッチを受精するために使用されていたと悪化した。したがって、相手の成功の最も正確な指標を得るためにはそれが精子精子プラグ及び試料の両方にチェックすることが重要である。

サンプリング手順の間、針の正確な向きは、いくつかの理由で重要である。まず、針が横車体面に平行であることを保証することは精液容器の薄い側に侵入することを防止する。技術が正しく実行されたときに針が実際に体腔を貫通することがないように、それは、死亡を引き起こさない。第二に、針のスティープ化、続いて45°の挿入角度は、針が精子は精包の壁を貫通し、隣接するボディ洞を入力せずに濃縮された容器( 図1)の底部に到達することを保証するのに役立つ。

13の結果として、非常に簡単に彼らの先体反応を受ける。精子が反応したら、彼らは、試料中に分解し、識別することは困難になることを始める。この理由のために、サンプルバイアルの攪拌を最小限に維持すべきである。また、冷却サンプルを保つことは、精子の完全性を維持するのを助けるように思われる。最後に、ときに試料処理滅菌海水を使用することが提案されている。これは細菌や精子を損傷する可能性のある他の微生物(36〜48時間以上)の成長を最小化するために作用することができる。

サンプリングされたメスのロブスターの(90.3%)大半は、精液の容器内の精子の存在に基づいて、成功して交配した。これらいずれかが性的に未熟であったため動物の残りの部分は、彼らの精子のプラグは時間の経過とともに劣化したりすることがあったいたが、精子正なかったかもしれないエン完全に卵の1以上のクラッチを受精するために使用する、または彼らは彼らの脱皮サイクル11における適切なタイミングで適切なオスに遭遇したことがない可能性があるため、交配したことがなかった。女性はわずか50%が100ミリメートル14で成熟すると、ジョージの銀行地域の女性のロブスターは、比較的大きなサイズで満期を持っている。 Cape Annの女性は、女性の50%が、CL 15 90ミリメートルで成熟すると、沖合ロブスターを行うよりもわずかに小さいサイズで成熟する。そのため、最小の女性が71ミリメートルCLだったことを考えると、それは精子のプラグを欠いている、女性の一部は、おそらく未熟ので、交配なかったであろうことを示唆したのは不合理ではない。このようなオフショアサブセットでサンプリングされたものなど、多くの大規模な女性のロブスターは、脱皮および16を再交尾することなく、連続した年で産卵する。

同じ精包を使用して複数の受精は、最終的にはプラグ材料の内訳を生じ得るし、レセプタクルに含まれる精子を使用することができますAcleの、陰性の結果を得た。しかし、時間をかけて精子プラグの機械的な故障は、我々の知る限り、記載されていない。最終的に、それは彼らのレセプタクルにおける精子のないもの、女性は仲間を見つけることができなかった可能性があります。歪んだ女性性比は、ジョージの銀行ロブスターの株式17に記載されており、これは、精子の制限につながるという可能性は、ロブスターの個体群の生殖出力のための潜在的な影響への更なる注目に値する。

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Disclosures

著者らは、利害の衝突を宣言していません。

Acknowledgments

彼らの協力ははるかに高く評価されている - 著者は、そのボート我々はからサンプルを許可されたすべてのニューイングランドの商業lobstermanの複数形に感謝したいと思います。加えて、我々はリトルベイロブスターカンパニー(ニューイントン、ニューハンプシャー州)、私たちは彼らの施設でサンプリングを行うことが許さチャンプリンのシーフード(ポイントジュディス、RI)を感謝します。次のUNHの学生がこの研究を通して非常に貴重な支援を提供:ヘイリーホワイト、フランソワーズ·モリソン、サラHavener、オードラシャプー法、5月グロースを。このプロジェクトは、WHW(プロジェクト#のR/CFR-11)と共同研究会へのUNHマリンプログラム付与するには、NHのSeaGrantからの補助金によって支えられている。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calipers Mitutoyo Digimatic 500-196-20 http://www.globalindustrial.com
3 ml Luer-Lok syringe Beckton-Dickinson 309585 www.bd.com
Monoject aluminum hub blunt needles, 18 G x 1 Webster Veterinary 8881202348 www.mywebstervet.com
2.0 ml Plastic storage tubes Eppendorf wu-06333-72 http://www.coleparmer.com
Styrofoam cooler with ice
Compound light microscope Olympus BH System http://www.olympusamerica.com
Glass sides with cover slip 75 mm x 25 mm, ~1 mm thickness
Pipettor with disposable tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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非侵襲的方法<em&gt;その場で</em&gt;女性アメリカンロブスターにおける交配の成功(の決定<em&gt;ロブスターのamericanus</em&gt;)
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Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).More

Goldstein, J. S., Pugh, T. L., Dubofsky, E. A., Lavalli, K. L., Clancy, M., Watson III, W. H. A Noninvasive Method For In situ Determination of Mating Success in Female American Lobsters (Homarus americanus). J. Vis. Exp. (84), e50498, doi:10.3791/50498 (2014).

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