तुलनात्मक प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए चयापचय लेबल और झिल्ली Fractionation<em> Arabidopsis thaliana</em> सस्पेंशन सेल संस्कृतियों
Summary
यहाँ हम पूरी तरह से 15 एन लेबल Arabidopsis thaliana सेल संस्कृतियों unlabeled के मिश्रण पर आधारित डिटर्जेंट प्रतिरोधी और डिटर्जेंट घुलनशील झिल्ली में संयंत्र प्लाज्मा झिल्ली के विभाजन के लिए और इन विवो में एक मजबूत विधि का वर्णन है. प्रक्रिया संकेत प्रक्रियाओं को समझने के लिए तुलनात्मक प्रोटिओमिक अध्ययन के लिए लागू किया जाता है.
Abstract
प्लाज्मा झिल्ली microdomains लिपिड और स्टेरोल पर्यावरण के भौतिक गुणों पर आधारित विशेषताएं हैं और प्रक्रियाओं को संकेत में विशेष भूमिका है. प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए संयंत्र कोशिकाओं से स्टेरोल समृद्ध झिल्ली microdomains निकालने एकाधिक तैयारी कदम और अन्य सेलुलर डिब्बों से संदूषण के लिए स्रोतों की वजह से एक मुश्किल काम है. प्लाज्मा झिल्ली एक संयंत्र सेल में सब झिल्ली के बारे में केवल 5-20% का गठन किया है, और इसलिए अत्यधिक शुद्ध प्लाज्मा झिल्ली अंश का अलगाव चुनौती दे रहा है. एक बार इस्तेमाल विधि 95% 1 की पवित्रता के साथ प्लाज्मा झिल्ली पुटिका जो पैदावार पॉलीथीन ग्लाइकोल और dextran में जलीय दो चरण विभाजन, शामिल है. प्लाज्मा झिल्ली के भीतर Sterol युक्त झिल्ली microdomains क्षारीय पीएच पर ठंड nonionic डिटर्जेंट के साथ इलाज पर अघुलनशील हैं. इस डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली अंश के रूप में ultracentrifugation द्वारा थोक प्लाज्मा झिल्ली से अलग किया जा सकता हैucrose ढाल 2. बाद में, प्रोटीन मेथनॉल / क्लोरोफॉर्म तेज़ी से sucrose ढाल का कम घनत्व बैंड से निकाला जा सकता है. निकाले प्रोटीन तो, पच desalted और अंत में LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण trypsin किया जाएगा. स्टेरोल युक्त microdomains के लिए हमारी निकासी प्रोटोकॉल Arabidopsis thaliana सेल संस्कृतियों से साफ डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली अंशों की तैयारी के लिए अनुकूलित है.
हम ब्याज 3 के जैविक उपचार के बाद मात्रात्मक तुलनात्मक प्रोटिओमिक अध्ययन के लिए केवल नाइट्रोजन स्रोत के रूप में कश्मीर में 15 सं 3 के साथ Arabidopsis thaliana निलंबन सेल संस्कृतियों का पूरा चयापचय लेबलिंग का उपयोग करें. संयुक्त प्रोटीन निकासी के लिए लेबल और unlabeled सेल संस्कृतियों के बराबर अनुपात मिश्रण करके अंतिम मात्रात्मक परिणाम पर तैयारी चरणों का प्रभाव कम से कम रखा है. इसके अलावा निकासी के दौरान माल की हानि नियंत्रण और एक ही तरीके से इलाज के नमूने, एक दोनों को प्रभावित करेगाडी इसलिए प्रकाश और उसांस पेप्टाइड का अनुपात स्थिर रहेगा. प्रस्तावित विधि में लेबल या अन्य 4 नियंत्रण के रूप में कार्य करता है, जबकि unlabeled सेल संस्कृति, एक जैविक उपचार प्रक्रिया से गुजरता है या तो.
Introduction
1972 में, जोनाथन सिंगर और गर्थ निकोल्सन आम तौर पर जल्दी 1960 में स्वीकार किया गया था कि प्रोटीन लिपिड प्रोटीन सैंडविच मॉडल की जगह, द्रव मोज़ेक मॉडल सेलुलर झिल्ली की एक संरचना मॉडल का प्रस्ताव रखा. सिंगर और निकोल्सन जैविक झिल्ली सभी लिपिड और प्रोटीन अणु स्वतंत्र रूप से और आसानी से 5 फैलाना जहां एक दो आयामी तरल के रूप में माना जा सकता है कि माने. उस समय से, झिल्ली संरचना के प्लाज्मा झिल्ली और ज्ञान की संरचना मॉडल भी अधिक जटिल हो गया. विशेष रूप से, प्लाज्मा झिल्ली के भीतर, ऐसे प्रोटीन परिसरों और लिपिड / स्टेरोल आधारित संरचना की दृष्टि से अव्यवस्थित microdomains रूप संरचनाओं मनाया जा सकता है. कृत्रिम मॉडल झिल्ली 6,7 में, sterols और sphingolipids laterally बदल भौतिक सुविधाओं के साथ क्षेत्रों के लिए फार्म अन्य लिपिड प्रजातियों से अलग कर सकते हैं. सेलुलर झिल्ली के भीतर इस अलगाव मुख्य रूप से sterols और अत्यधिक एसए के बीच स्वयं को संबद्ध गुणों के कारण होता हैphopsho और sphingolipids 8 turated हाइड्रोकार्बन जंजीरों. विशेष रूप से, कठोर स्टेरोल छल्ले stiffer और straighter संतृप्त लिपिड प्रजातियों और इन मुलाकातों झिल्ली मोटाई और कठोरता बढ़ रही है, और अधिक बढ़ाया रचना में पड़ोसी हाइड्रोकार्बन चेन बल के साथ बातचीत का पक्ष लिया.
स्टेरोल समृद्ध झिल्ली microdomains की सामान्यतः मनाया सुविधाओं में से एक गैर ईओण डिटर्जेंट जैसे एक ट्राइटन X-100 या बृज 35 के साथ उपचार पर उनकी जटिलता था. इन अंशों झिल्ली microdomains साथ समान माना गया और उनकी जैव रासायनिक तैयारी विधि 2 पर आधारित डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली (डीआरएम) कहा जाता था. डीआरएम निकासी के दौरान nonionic डिटर्जेंट के उपयोग के जैव रासायनिक डीआरएम तैयारी सीधे जीवित कोशिका 9 के भीतर किसी भी विशिष्ट झिल्ली डिब्बे के अनुरूप नहीं हो सकता है के रूप में कुछ आलोचना का स्वागत किया. विशेष रूप से, प्रोटीन अनुपात करने के लिए डिटर्जेंट, इस तरह की तैयारी में महत्वपूर्ण लगता है एकअलग डिटर्जेंट, साथ ही विभिन्न डिटर्जेंट मात्रा में डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली अंश 10 की अलग संरचना प्राप्ति कर सकते हैं. हालांकि, विशेष प्रोटीन प्रजाति विशेष रूप से इन सेलुलर स्टेरोल युक्त झिल्ली डोमेन के साथ संबद्ध है, और इन प्रोटीनों अच्छी तरह डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली भिन्न 11 के जैव रासायनिक तैयारी में समृद्ध कर रहे हैं कि कि सबूत है. संयंत्र डीआरएम अंश में पाया गया कि, और DRMS में उपस्थिति निर्भर स्टेरोल था जिसके लिए प्रोटीन की कोर, ऐसे fasciclin तरह arabinogalactan प्रोटीन (Flas) और SKU प्रोटीन परिवार के सदस्यों के रूप में विशेष रूप से जीपीआई लंगर डाले प्रोटीन थे. इसके अलावा ऐसे रिसेप्टर की तरह kinases या phospholipases के रूप में कुछ संकेत प्रोटीन, 11 पाया गया. इन परिणामों स्तनधारी झिल्ली microdomains 12,13 पर कई प्रोटिओमिक पढ़ाई के साथ संगत कर रहे हैं. इसके अलावा पौधों में तनाव प्रतिक्रिया 14 के संदर्भ में झिल्ली microdomains की भूमिका के लिए सबूत नहीं बढ़ रही है –16.
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल प्लाज्मा झिल्ली microdomains के विभाजन के लिए एक मजबूत तरीका प्रदान करता है और विशेष रूप से हमें स्टेरोल युक्त झिल्ली डिब्बे 4,11,14 का तनाव प्रेरित परिवर्तन को चित्रित करने की अनुमति देता है कि डिटर्जेंट एकाग्रता के लिए एक प्रोटीन का उपयोग करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अखबार में प्रस्तुत प्रोटोकॉल कई चरणों में हैं और उन सभी डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली और डिटर्जेंट घुलनशील भागों में संयंत्र प्लाज्मा झिल्ली की शुद्ध और प्रतिनिधि fractionation प्राप्त करने के लिए महत्वपूर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| REAGENTS | |||
| Chemicals were ordered from Sigma-Aldrich unless noted otherwise | |||
| Ammonia (stock 25 % solution) | WAKO | 010-03166 | |
| TiO2 10 μm | GL-Science | 5020-75010 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Polyethylene glycol(PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
| Dextran T500 | Roth | 9219.2 | |
| Trypsin | Promega | V5113 | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma | P9599 | |
| K15NO3 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-765-PK | |
| EQUIPMENT | |||
| Optima L-80 XP Ultracentrifuge | Beckman | ||
| Plate reader | BioTek | ||
| EASY-nLC II nano-Liquid Chromatograph | Thermo Scientific | ||
| LTQ-Orbitrap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Speed Vac RVC 2-25 | Christ | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph |
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