活体显微镜成像的亚细胞结构的活体小鼠表达荧光蛋白
Summary
活体显微镜是一个功能强大的工具，使活体动物成像的各种生物过程。在本文中，我们提出了用于成像的亚细胞结构，如分泌颗粒，在活体小鼠的唾液腺的动力学的详细方法。
Abstract
在这里，我们描述了一个程序，在现场啮齿动物图像的亚细胞结构是基于使用共聚焦活体显微镜的。作为一个模型器官，我们使用活体小鼠的唾液腺，因为它们提供多个优点。首先，他们可以很容易地接触到使访问光学和稳定，以促进由于心跳和呼吸运动伪影的减少。这显著有利于成像和追踪小亚细胞结构。第二，大多数唾液腺的细胞群是来自器官的表面接触。这允许使用共焦显微镜，其具有更高的空间分辨率比已被用于活体成像的其它技术，如双光子显微镜。最后，唾液腺可以容易地控制药物学和基因，从而提供了一种稳健的系统在分子水平上研究生物过程。
在这个研究中，我们侧重于设计遵循在腺泡细胞分泌颗粒的胞吐作用和根尖质膜，其中分泌颗粒熔化后的β-肾上腺素能受体的刺激的动态动力学的协议。具体而言，我们所用的转基因小鼠，其共表达GFP的细胞溶质和膜靶向肽融合荧光蛋白串联番茄。然而，我们用于稳定和图像唾液腺的程序可以扩展到其他小鼠模型并耦合到其他的方法来标记在体内的细胞成分，使各个亚细胞结构，如内涵体，溶酶体，线粒体的可视化，并肌动蛋白细胞骨架。
Introduction
在过去的二十年活显微镜的出现和使用的荧光蛋白，导致在每一个细胞的过程可以想象的重大突破，从而推动我们的细胞生物学1的理解。这个领域已经从使用哺乳动物细胞培养是非常强大的模型系统，特别是当它涉及到实验操作中获益良多。然而，他们不经常提供复杂的多细胞生物2生物学的真实再现。这个问题已经开始通过活体显微镜（IVM）的发展来解决已经敞开了大门调查，如神经生物学，免疫学和肿瘤生物学3场关键的生物学问题。迄今为止，大多数基于IVM的研究已经进行了在组织和个体细胞的水平，而不提供关于亚细胞区室的动力学的任何信息。最近，我们的实验室和其他s有开发能力的成像亚细胞结构在活老鼠4-7，13-15，并允许在体内的药理和遗传操作的IVM技术。这种方法已被用于我们研究膜贩运体内 ，更具体内吞作用和胞吐作用调节6,7。
我们的实验模型系统是基于公开，稳定和麻醉成像啮齿动物的颌下腺唾液腺（SGS）。 SGS集团作为模型器官体外成熟的选择是由于这一事实，即腺体是通过执行一个小手术方便，可以外不影响他们生理和稳定，以减少因心跳和呼吸运动伪影。此外，SGS可以选择性基因通过在唾液腺导管8,9注射病毒性或非病毒为基础的载体操纵。最后，SGS是偏光epith组成的外分泌腺elial细胞，从而形成腺泡和导管，肌上皮细胞和基质细胞的复合物的人口。因为这个原因，它们是研究胞吐，胞吞作用，基因递送，和肌动蛋白细胞骨架，如在我们的最近研究10高亮显示，并提供研究细胞生物学的各个方面，如细 胞极性，细胞分裂，细胞的机会的良好模型细胞连接，和离子通道。
在本文中，我们详细描述了在活老鼠的超导重力仪的上皮细胞内实现分辨率的成像协议。具体来说，我们将展示如何将图像分泌颗粒中了SGS的腺泡细胞中调节胞吐作用。如前所示，在刺激时具有β-肾上腺素能受体激动剂，分泌颗粒熔合根尖质膜和逐渐塌陷，释放出它们的内容到腺泡小管6。我们的目标是提供基本的工具来调查有m在外科手术和动物处理inimal经验，使他们能够在亚细胞分辨率成功执行IVM。由于IVM的最具挑战性的部分是动物的准备，在这里我们专注于那些用来揭露和固定了SGS不影响它们的功能基本手术过程的描述。作为标记的亚细胞结构，一些策略，比如全身递送荧光探针，使用转基因动物，或两者的组合的程序，已在别处7,11说明。
Protocol
Representative Results
Discussion
到目前为止，亚细胞结构已经拍摄主要是在体外 （ 如细胞培养）或体外 （ 即器官培养，组织切片，腺泡制剂）模型系统，往往不复述的完整的活组织6的特性。在这方面，这里提出的方法是一个重大的突破，因为它使成像的特定膜运输步骤（ 即调节的胞吐作用）的动力在活小鼠。
这个协议代表具有方面来设计用于体内成像的…
Acknowledgements
这项研究是由牙齿和颅面的研究国家研究所院内研究计划的美国国立卫生研究院的，支持的。
Materials
| Reagent | |||
| Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
| Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
| Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
| Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
| Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
| Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
| Instrument | |||
| Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
| Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
| Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
| MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
| Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
| #7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
| Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
| Black Braided Silk suture #4.0 | George & Tiemann & Co | 160-1219-4 | |
| Gauze sponges 2″ x 2″ | Tyco Healthcare | 9022 | |
| Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 |
References
- Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).
- Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy. Traffic. 13, 627-634 (2012).
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).
- Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9, 1801-1810 (2008).
- Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).
- Sramkova, M., Najman, S., et al. . Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. , (2012).
- Masedunskas, A., et al. Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, (2012).
- Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats. Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).
- Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. Intravital. 1, 44-53 (2012).
- Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. Multi-photon excitation microscopy in intact animals. J. Microsc. 222, 58-64 (2006).
- Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy. Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).
- Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).
