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Biology

형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경

Published: September 1, 2013 doi: 10.3791/50558

Summary

의 intravital 현미경은 살아있는 동물의 다양한 생물학적 과정을 영상화 할 수있는 강력한 도구입니다. 이 문서에서는, 우리는 살아있는 생쥐의 침샘에서 이러한 분비 과립으로 세포 내 구조의 역학 이미징을위한 자세한 방법을 제시한다.

Abstract

여기에서 우리는 공 초점의 intravital 현미경의 사용을 기반으로 라이브 설치류에 이미지 세포 내 구조에 절차를 설명합니다. 그들은 몇 가지 장점을 제공하기 때문에 모델 기관으로, 우리는 살아있는 생쥐의 침샘을 사용합니다. 첫째, 그들은 쉽게 광학계에 액세스 할 수 있도록 노출, 및 심장 박동과 호흡에 의한 모션 아티팩트의 감소를 용이하게 안정화 될 수있다. 이것은 크게 이미징 및 작은 세포 내 구조를 추적을 용이하게한다. 둘째, 침샘의 세포 인구의 대부분은 장기의 표면에서 액세스 할 수 있습니다. 이는 두 개의 광자 현미경과 같은 생체 내 이미징을 위해 사용 된 다른 기술,보다 높은 공간 해상도를 공 초점 현미경의 사용을 허용한다. 마지막으로, 침샘 쉽게 따라서 분자 수준에서 생물학적 과정을 조사 할 수있는 강력한 시스템을 제공, 약리학 적 및 유전 조작 할 수 있습니다.

이 연구에서 우리는 선방 세포에서 분비 과립의 세포 외 유출 및 분비 과립 베타 - 아드레날린 수용체의 자극에 융합 혀끝의 세포막의 역학의 역학을 수행하도록 설계된 프로토콜에 초점을 맞 춥니 다. 특히, 우리는 세포질의 GFP 및 형광 단백질 탠덤 토마토와 융합 막 대상 펩타이드를 공동으로 표현 형질 전환 마우스를 사용. 그러나, 우리는 침샘을 안정시켜 화상에 사용되는 절차는 다른 마우스 모델로 확장하고 엔도 좀, 리소좀, 미토콘드리아 등 다양한 세포 내 구조의 시각화를 가능하게 생체 내 세포 성분에 라벨을하기위한 다른 방법으로 결합 될 수 있고, 액틴 세포 골격.

Introduction

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지난 20 년에 살고있는 현미경의 출현과 형광 단백질의 사용은 따라서 세포 생물학 1에 대한 우리의 이해를 발전, 상상할 수있는 모든 세포 과정에 대한 주요 분야를 이끌고있다. 이 필드는 실험 조작에 관해서 특히 매우 강력한 모델 시스템이다 포유 동물 세포 배양의 사용에서 엄청난 혜택을 받았다. 그러나, 그들은 종종 복잡한 다세포 생물 2의 생물학의 진정한 표현을 제공하지 않습니다. 이 문제는 신경 생물학, 면역학 및 종양 생물학 3 등의 분야에서 중요한 생물 학적 질문 조사에 문을 열었습니다 그의 intravital 현미경 (IVM)의 개발에 의해 해결되기 시작했다. 지금까지, IVM에 기초 연구의 대부분은 세포 내 구획의 동역학에 관한 정보를 제공하지 않고, 조직 및 개개의 세포 수준에서 수행되었다. 최근에, 우리의 실험실 및 기타의 라이브 설치류 4-7, 13-15생체 내에서 약물 및 유전자 조작을 허용 이미징 세포 내 구조 할 수 IVM 기술을 개발했습니다. 이 방법은 생체 내에서 막 인신 매매를 연구하기 위해 우리가 사용하고,보다 구체적으로 이입과 세포 외 유출 6,7를 규제하고있다.

우리의 실험 모델 시스템은 노출 안정화 및 마취 설치류의 턱밑 침샘 (SG를를) 이미징을 기반으로합니다. IVM을위한 모델 기관으로서 SGS의의 선택은 땀샘 부 수술을 수행하여 쉽게 접근 할 수 있다는 사실로 인해, 그들의 생리 기능을 손상시키지 않고 구체화 한 심장 박동과 호흡에 의한 움직임 아티팩트를 감소시키는 안정화 될 수있다. 또한, SGS는 선택적으로 타액 덕트 8,9를 통해 바이러스 성 또는 비 바이러스 성 중 하나를 기반으로 벡터를 주입하여 유전자를 조작 할 수 있습니다. 마지막으로, SGS는 편광 epith 구성 외분비 샘이다꽈리 및 덕트, 근 상피 세포 및 간질 세포의 복잡한 집단을 형성 elial 세포. 이러한 이유로, 그들은 우리의 최근의 연구 (10)에 강조로, 세포 외 유출, 엔도 시토 시스, 유전자 전달, 그리고 말라의 골격을 연구하고 세포 극성, 세포 분열, 세포와 같은 세포 생물학의 측면을 공부할 수있는 기회를 제공 할 수있는 좋은 모델입니다 접합 셀 이온 채널.

본 논문에서 우리는 세부 사항에서 라이브 마우스의 SG를의 상피 세포 이하의 해상도를 달성하기위한 영상 프로토콜을 설명합니다. 특히, 우리는 방법을 규제 세포 외 유출 동안 SG를의 선방 세포에서 이미지 분비 과립에 보여줍니다. 이전에 도시 된 바와 같이, 베타 - 아드레날린 수용체 작용제와 자극에, 분비 과립은 혀끝의 세포막과 융합 점차 축소, 선포 눈물 소관 (6)에 자신의 콘텐츠를 공개. 우리의 목표는 M으로 조사하기위한 기본 도구를 제공하는 것입니다수술 절차 및 동물 취급 inimal 경험, 성공적 세포 이하의 해상도로 IVM을 수행 할 수 있도록. IVM에서 가장 어려운 부분은 동물의 준비를하기 때문에, 우리가 자신의 기능을 손상시키지 않고 SG를 노출하고 무력화하기 위해 사용하는 기본적인 수술 절차의 설명에 초점을 맞 춥니 다. 이러한 조직의 형광 프로브의 전달, 형질 전환 동물의 사용, 또는이 둘의 조합으로 세포 내 구조, 몇 가지 전략을, 레이블하는 절차로, 다른 7,11 설명 하였다.

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Protocol

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제 1 부 : 현미경 및 이미징 설치 준비

  1. 어떤 반전 공 초점 현미경은 IVM에 적합해야한다. 본 연구에서는 Fluoview-1000 레이저 스캐닝 공 초점 유닛을 탑재 올림푸스 IX81 도립 현미경을 사용 하였다. 최상의 해상도를 달성하기 위해, 예를 들면 물에 침수 UPLSAPO 60x/1.20 NA, 기름 침수 계획 - 아포 60x/1.42 NA 높은 NA 목적의 사용을 권장합니다. 오일 침지 목적은 높은 수집 효율을 가지고 그들이 조직과 대물 간의 커버 슬립의 사용을 필요로하더라도 표면으로부터 15 ~ 20 ㎛의 내 이미지 영역에서 사용하는 경우, 그들은 더 나은 영상 품질을 제공한다. 또한, 오일의 사용은 더 긴 이미징 세션 중에 수분 증발에 대한 우려를 제거한다. 온도 및 습도를 유지하기 위해, 현미경은 완전히 밀폐되어야하고, 따뜻한 습윤 공기가 공급. 대안 적으로, 동물, 현미경 스테이지 및목적은 다른 수단에 의해 따뜻하게해야합니다. 예를 들어, 화학 열 패드 동물과 스테이지를 위해 사용될 수 있고, 특별히 설계된 대물 히터 대물 (도 1a)에 사용될 수있다. 대물 히터 절차를 시작하기 전에 30 분에 전환해야한다. 참고 : 열 패드 거즈 패드와 피부 사이에 배치하는 따뜻한 동물을 유지하기 위해 사용하는 경우. 피부가 화상을 모니터링 할 수 있습니다.
  2. 상업적으로 이용 가능한 공 초점 현미경의 대부분의 표준 단계 슬라이드, 페트리 접시, 서로 다른 크기의 접시에 맞게 사용되는 다양한 홀더를 삽입하는 데 사용되는 구멍이있다. 35mm 배양 접시에 IVM, 표준 단계 삽입을 수행하기 위해 다음 높은 진공 실리콘 그리스 나 마스킹 테이프 (그림 1A)에 의해 보호되는 40mm 유리 슬라이드로 덮여 거꾸로 반전된다. 지정 인서트는 3mm 두께의 알루미늄 플레이트로부터 제조 될 수있다. 유리 표면은 Cl 인70 % 에탄올로 eaned과 킴 와이프로 슬쩍.
  3. SGS의 고정화 (안정제)의 사용자 정의 홀더 제조. 홀더의 목적은 장소에 SGS와 스테이지 및 커버 슬립에 견고하게 커플을 안정화하는 것이다. 홀더는 60mm 플라스틱 페트리 접시에서 할 수있다. 첫째, 접시의 바닥이 떨어져 벽에서 깨진 약 15 × 10 ㎜의 직사각형으로 절단한다. 그런 다음 가장자리가 미세 사포를 사용하여 반올림 연마된다. 네 개의 스페이서 (1.5 mm)는 1 ML의 주사기 플런저의 고무 팁을 제거하여 내장되어 있습니다. 미세 사포, 스페이서의 표면 및 플라스틱 조각의 네 모서리를 사용하여 연마된다. 스페이서는 다음 젤라틴 순간 접착제를 사용하여 접착하고, 나중에 평평한 표면에 미세한 사포를 사용하여 매끄럽게 다듬어집니다. 이전 동물, 홀더의 크기 및 스페이서 약간 큰 선들을 수용하기 위해 증가 될 필요가 있다는 것을 유의.
  4. 광 결합 겔의 제조. 0.3 % 카보 머-940 (표 2) 겔을 초순수 100 ㎖를 워밍업 및 D-솔비톨 5.47 g을 용해시켜 제조된다. 그런 다음, 카보 머-940의 0.3 g을 추가됩니다. 비커 덮여 교반 핫 플레이트 (최저 온도 설정)에 배치 몇 시간 또는 모든 카보 머 덩어리가 완전히 용해 될 때까지해야한다. 약 7.4의 pH에​​ 도달 할 때까지 마지막으로, Trietanolamine는 드롭 현명한 부드럽게 교반하면서 추가됩니다. 젤은 4 ° C (13)에 저장된다.

2 부 : 동물 및 마취

  1. 동물과 어떤 실험을 실시하기 전에, 프로토콜은 해당 지역의 동물 관리 및 윤리위원회의 승인을 받아야한다. 중요한 것은, 연구자가 제대로 수술 절차를 수행하고 절차를 진행하기 전에 해당 지역 동물 보호위원회 또는 기관의 수의사와상의해야합니다 훈련을해야한다.
  2. 본 연구에서는 마우스 모델 (GFP / mTomato 마우스) 가용성 GFP (GFP 마우스) 위스콘신을 표현 FVB 마우스를 횡단하여 산출형광 단백질 탠덤 토마토 (mTomato 마우스) 6 융합 막 타겟팅 펩타이드를 발현 번째 C57B6 생쥐를 사용 하였다. 참고 : 일반적으로 완전히 마취 및 이미징 장치를 마련 될 동물에 대한 20 ~ 30 분 소요
  3. 마우스는 동물 시설의 환경에서 보관되고 이전에 실험 한 주 동안 적응 할 수 있습니다. 이 단계는 향상된 분비 활동 12의 모든 고통의 결과 이후 SG를 이미징 필요합니다. 물과 음식은 임의로 제공됩니다. 2 -5 개월에서 남성은 영상 실험 (20-30그램)에 사용됩니다.
  4. 이전 마취, 마취의 적절한 복용량을 결정하기 위해 동물의 무게.
  5. 주 사용 마취제의 투여에 의해 유발되는 스트레스는 SGS의의 분비 활동을 손상시킬 수 있기 때문에, 마취제를 주입 한 다음, 이소 플루 란 흡입 미리 마취를 유도한다. 이 목표로, 매우 부드럽게 기화기 챔버에 마우스를두고,산소의 흐름 (800 ~ 900 mmHg로)를 켭니다. 전 마취 유도를 시작하는 3 %로 이소 플루 란 레벨을 설정합니다.
  6. 동물이 의식이되면, 복강 (25 G 바늘)에 100 ㎎ / ㎏의 케타민 (ketamine)의 혼합물을 20 ㎎ / ㎏ 자일 라진을 주입. 마취제 갓 식염수의 20 ㎎ / ㎖ 100 ㎎ / ㎖의 자일 라진을 희석하고 케타민과 혼합하여 제조된다. 이 혼합물을 추가로 생리 식염수로 1:1 희석하고, 적당량은 동물의 중량에 기초하여 주입된다. 이 희석 실수로 과다 복용을 방지하는 데 도움이됩니다. 혼합물이 20 분 후 그 효과를 상실합니다.
  7. 각성의 징후 동물을 관찰하고 그들이 (그 후 매 시간마다 첫 번째 주사 후 45 분 이내의 초기 투여 량의 약 75 %가, 50 %) 마취 나오는 경우 더 많은 마취제 혼합물을 주입. 발을 곤란하게하고 반응을 관찰하여 매 15 분 마취의 깊이를 확인합니다. 참고 : 항상 방지하기 위해 안과 연고를 관리눈의 건조.
  8. 마취제는 실험의 재현성 및 동물의 건강에 영향을 미칠 수있는 저체온증을 유도한다. 따라서, 마우스는 가열 램프 하에서 나 실험 전체 기간에 대한 가열 된 패드에서 유지되어야한다. 주 : 가열 램프는 연소를 방지하기 위해 동물로부터 적어도 12~18인치되어야
  9. 동물의 체온은 직장 온도 프로브를 구비 한 온도계를 모니터링 할 수있다.

제 3 부 :의 intravital 현미경에 대한 동물 수술 및 위치

  1. 깨끗하고 살균해야 모든 수술 도구 (표 1)과 함께 작업 영역을 준비합니다.
  2. 전기 바리캉으로 쥐의 목 부분을 면도. 70 % 에탄올에 적신 거즈 스폰지로 마취 된 쥐의 목 부분의 복부 측면을 닦습니다. 킴 와이프와 과잉 건조.
  3. 둔한 곡선 핀셋 중간 선 (approxi에 피부의 작은 조각을 리프트mately 붙어있는 근육은의 하단부), 및 작은 절개 (도 1b)를 만든다.
  4. 구멍에 가위를 넣고 가위 블레이드를 열어 멀리 하부 조직으로부터 피부를 구분합니다. 피부의 아래쪽을 향해 가위를 지정하여 기본 선의 조직의 손상을 방지. 피부 깊은 조직 (그림 1B)에서 분리 될 때까지이 단계를 여러 번 반복합니다.
  5. 가위를 사용하여, 약 3 mm 폭 느슨하게 피부와 긴 10mm의 스트립을 잘라. 개구는 신경, 덕트 및 혈관이 신체의 나머지에 선을 연결 SGS의의베이스 근처에 시작되도록 피부는 절단되어야한다. 상처 부분을 청소 한 후, 그 결과 개방 모양 타원형과 약 8 × 12mm를 측정 할 것이다. 두 SGS는 오프닝 (그림 1B) 후 볼 수 있습니다.
  6. 주사기와 컷의 중간에 광 커플 링 젤을 적용하고 향해 닦아멸균 거즈와 외부. 각 조직에 노출 된 모발이나 혈액의 도입을 방지하기위한 와이프 ​​거즈 청소 매 사용되어야한다. 모든 혈액과 느슨한 머리가 제거 될 때까지이 단계를 반복합니다.
  7. # 7 핀셋을 사용하여, 멀리 우측 악하선의 결합 조직 (또는이 프로토콜은 왼쪽 SG를 사용할 수 있습니다) 선 (腺)의베이스에있는 모든 방법을 구분합니다. 첫째, SG의 끝을 찾아 몇 mm 글 랜드의 끝 위의 결합 조직을 잡아. 실질 조직을 손상하지 않고 동맥 주위의 결합 조직을 눈물. (그림 1B). 선이 노출되면, 조심스럽게 선에서 결합 조직을 분리합니다. 출혈이 발생하는 경우, 식염수로 혈액을 씻어. 모든 결합 조직을 분리하고 선이 완전히 노출되어 있는지 확인합니다. 정기적으로 광 커플 링 젤을 적용하여 촉촉한 선을 유지합니다.
  8. 이전 현미경에 동물을 가져 오기에, 거즈의 두꺼운 조각과 혜를 배치t는 38 ± 2 ℃의 온도를 유지하기 위해 현미경 무대에 팩 화학 열 팩의 온도는 대기로 내측 주머니를 노출 컷의 크기에 의해 조정될 수있다. 가제 금속 단계에서 열 팩의 일부 절연을 제공합니다. 뿐만 아니라 거즈의 얇은 조각으로 열 팩의 상단을 커버.
  9. 측면 (오른쪽 선에 대한 오른쪽)과 거즈에 동물을 배치합니다. 커버 슬립 (그림 1C)의 중간에 배치 턱밑 침샘에 동물을 배치합니다.
  10. 동물은 선을 고정하기 전에 보안이 위치에서 안정화되어야한다. 마우스의 전면 오른쪽 발의 복부 측면에 마스킹 테이프의 조각을 놓습니다. 실크 봉합사 (그림 1C, 삽입)에 의해 마우스의 앞니를 연결. 비단실과 발 사이에 약간의 긴장을 만들고 마스킹 테이프로 무대에 장치를 연결하십시오. SG는 중간에 자연 휴식해야한다커버 슬립. 머리와 흉부는 별도로 스테이지에 연결될 수있다 플라스틱 웨지에 의해 안정화되어야한다.
  11. (그림 1C)를 통해 조직을 청소 렌즈의 작은 조각을 놓습니다. 약간 선을 확장하고 선을 통해 사용자 정의 홀더를 배치합니다. 마스킹 테이프로 무대에 단단히 커플 안정. 커플 링 단계 (도 1c)에 접속 된 금속 클램프에 의해 개선 될 수있다. 그들은 혈류량을 손상시킬 같이 탄력과 예각은 피해야한다. 안정화는 (그것이 핑크 착색을 유지한다) 외형 선을 조사함으로써 또는 표면 형광 의해 어느 혈류량 검사 직후. 혈관 및 혈액 세포의 여러 가지가 모두 m-토마토로 표지 때문에 GFP / m-토마토 마우스에서 혈액 흐름의 총 변화가 쉽게 평가 될 수있다.
  12. 거즈 가열 패드로 동물을 커버. w 탑재 온도계를 사용하여 노출 된 동맥의 온도를 측정i 번째 노출 된 선 (腺)의 한면과 접촉에 배치 된 작은 유연한 열전쌍 프로브.

제 4 부 : 이미지 매개 변수

  1. GFP 또는 RFP 필터 세트를 사용하여 다음과 같은 방식으로 선 (腺)의 표면에 표면 형광 조명 포커스를 사용. SG의 표면을 발견하고, 모세 혈관의 혈류 및 조직의 전반적인 형태를 평가. 조직 손상의 징후 막에 blebbing 또는 큰 액포의 모양이 (가) 있습니다.
  2. 어느 표면 형광 통해 또는 선택된 영역을 미리 주사하여 조직의 안정성을 평가한다. 모션 아티팩트의 대부분이 후 처리 데이터 분석에서 제거 또는 수정 될 수 없기 때문에 안정한 제제는 필수적이다. 준비가 안정되지 않으면 조정이 필요합니다.
  3. 적절한 초점 평면 이미지보기 미리 스캔 모드 (1X 줌)의 분비를 발견하고, 점차적으로 선포 구조, 분비 과립과 p까지 커버 슬립으로 목표를 이동하려면lasma 막 (그림 2) 명확하게 표시됩니다.
  4. 시간 경과에 대한 촬상 파라미터는 개별 실험에 의존한다. 이미지의 분비 과립의 역학은 0.5 초 / 프레임의 스캔 속도를 사용하고 0.2 μm의 / 픽셀 공간 규모 (약 50 ㎛ × 50 ㎛, 시야) 256 X 256 픽셀. 최적 과립과 세포막을 시각화하기 위해서, 광학 두께는 0.9-1.2 μm의 사이에서 설정되어야한다. GFP와 탠덤 토마토를 여기 시키는데, 하나는 각각 488 ㎚, 561 ㎚의 파장을 사용할 수있다. 최고 출력은 488 ㎚, 561 nm의 1 mW의 주위에 0.5 ㎿가 설정됩니다. 이것은 최소한의 광표백을 보장합니다.
  5. 검출기의 설정은 동적 범위 내에 신호를 유지하고, 시험편의 밝기에 따라 조정해야한다.
  6. 모든 매개 변수가 설정되면, 영상은 시작할 수 있습니다. 우선, 기준점으로 사용되는 시야의 스냅 샷을 취할. 동안시간 경과 이미징, XY 및 Z에서 조직의 표류가 발생할 수 있습니다. 이 수동 스캔 영역 및 Z 위치를 조정함으로써 보상 될 수있다. 조정은 점진적으로 작은 단위로 유물을 피하기 위해해야​​한다. 또한, 참조 화상은 광표백 발생 여부를 결정하는데 사용될 수있다. 상당한 광표백은 (형광에서 더 15-20 % 감소)을 검출하는 경우, 0.1 mW의 레이저에 의해 전력을 감소시킨다.
  7. 식염수에 이소의 새로 제조 솔루션의 피하 주사 0.1 ㎎ / ㎏, 세포 외 유출을 자극하는. 세포 외 유출은 주사 후 약 1 분 트리거됩니다. 세포막과 융합 분비 과립은 과립 주위 GFP 형광의 증가와 그 제한 세포막에 탠덤 토마토 펩티드의 확산 (도 3)에 의해 검출 될 것이다. 우리는 같은 지역에 3 ~ 4 시간 경과 시퀀스, 10 분 각각 획득하는 것이 좋습니다.
  8. 촬상 세션 후에 ANE를 안락사안락사 챔버의 CO 2 흡입 (10 분 10 ~ 12 mmHg로)에 의해 동물을 sthetized.

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Representative Results

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GFP / mTomato 마우스에서 선포 세포는 세포 내 GFP 및 막 대상 직렬 - 토마토 펩타이드 (그림 2, 점선을) 표현으로 명확하게 구별되는 구조를 나타납니다. 개별 선포 세포에서 선포 세포는 탠덤 - 토마토 펩타이드로 구분된다. GFP는 명확하게 (그림 2, 화살표) 선포 세포 내부에 볼 수 있습니다 핵에서 발견됩니다. 세포질 GFP는 직경 약 1.5 ㎛, 어두운 원형 소포 (그림 2, 삽입, 화살촉)를 표시 분비 과립에서 제외됩니다. exocytic 이벤트를 시각화하기 위해, 우리는 (3, 별표 그림) 분비 과립에 충실 세포막의 한 영역에 초점을 맞 춥니 다. 0.1 ㎎ / kg의 이소 피하 주사 후에, 우리는 원형질막 (도 3, 초록색 화살표)에 가까운 위치에 분비 과립의 일부 주변의 GFP 형광 수준의 증가를 관찰한다. P로reviously 도시 이들 과립은 세포막과 융합되고 세포질 GFP (6)을 유지 두꺼운 액틴 섬유주 모집. 또, 세포막과 융합 후, 탠덤 토마토 펩티드는 분비 과립 (도 3, 빨간 화살표)의 제한적인 막으로 확산한다. 30 ~ 40 초 후 분비 과립은 점진적으로 축소하고 그 제한 막을 혀끝의 세포막에 통합되어 있습니다.

그림 1
그림 1. 현미경, 수술, 동물의 위치를 설정합니다. A. 35mm 배양 접시를 개최하기 위해 설계 단계의 삽입은 40mm의 coverslip에 덮여있다. 삽입은 가열 패드 (오렌지 타원)과 가열 램프로 미리 예열 한 현미경 스테이지에 배치됩니다. 대물 사전이다 . 침샘을 노출 B. 수술 절차 : 목표 히터 (38 ° C 온도 설정)를 가열. 깨끗한 가위를 사용하여 절개는 목 부분 위의 피부에서 이루어집니다. 가위는 기본 조직으로부터 피부를 분리하는 개구부에 삽입된다. 피부이어서 제거되고, 결합 조직을 조심스럽게 핀셋을 이용하여 동맥 중 하나로부터 박리된다. C. 동물은 예열 단계에서의 측면에 배치되고, 선이 부드럽게 당겨 커버 슬립의 중간에 배치된다 . 앞니는 실크 실 (삽입)와 함께 무대에 매여있다. 렌즈 청소 조직의 작은 조각은 동맥 및 기관 홀더 사이에 개재된다. 기관 홀더는 다음 마스킹 테이프 (녹색)으로 무대에 고정 클램프로 안정화된다.

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그림 2. 라이브 GFP / mTomato 마우스의 침샘의 이미징 영역의 대표 이미지. 꽈리 멋지게 GFP 채널 (녹색 점선)에 강조 표시되어 있습니다. 하나의 세포는 세포막 (빨간 점선)에서 지역화 된 TD-토마토 펩타이드로 구분된다. GFP는 세포질과 핵 (화살표)로 번역하지만, 분비 과립 (삽입, 화살촉)에서 제외됩니다. 바, 10 μm의.

그림 3
이소의 0.1 ㎎ / ㎏의 주입에 따라 분비 과립의 세포 외 유출을 보여주는 그림 3. 대표 시간 순서. 분비 과립이 세포막 (별표)에 가까운 몇 군데 있었다. 원형질막, 분비 과립 주위 GFP의 수준 융합 야간의 유의 (녹색 화살표)를 증가하고, TD-토마토 펩타이드는 제한 멤브레인 (빨간색 화살표)로 확산. 분비 과립이 서서히 축소하고 세포막은 혀끝의 세포막에 통합되어 있습니다. 바, 5 μm의.

표 1. 재료

표 2. 악기

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Discussion

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지금까지 세포 내 구조는 주로 체외 (즉, 세포 배양) 또는 종종 그대로 살아있는 조직 (6)의 특성을 요점을 되풀이하지 않는 생체 (즉, 장기 배양, 조직 조각, 선포 준비) 모델 시스템의 이미지가되었다. 그것은 살아있는 생쥐의 특정 막 인신 매매 단계 (즉, 규제 세포 외 유출)의 역학을 영상화 할 수 있기 때문에이 점에서, 여기에 제시된 방법은 중요한 돌파구를 나타냅니다.

이 프로토콜은 체강 10,11,13-15에서 SG를 또는 다른 장기의 생체 내 이미징을 위해 설계된 다른 절차에 대한 존중과 함께 상당한 발전을 나타냅니다. 우리의 이전 연구의 일부는 수술에 더 탄력적 큰 기관이 쥐에서 수행하고, 마우스에 비해 감소 된 심장 박동했다. 생쥐의 절차를 설정하기가 어렵습니다,하지만, 그들은 여러 ADVA을 제공질병 모델, 형질 전환 및 녹아웃 동물의 광범위한 스펙트럼을 사용하는 가능성을 포함 ntages. ) I 혈류 감소, ⅱ)의 조직 구조를 손상, 및 ⅲ) 정상 기능을 손상 : 또한,이 접근법은 성공적 노출 장기 따라서의 위험을 감소시키기에 가해지는 압력을 통해 더 나은 제어를 제공하는 모션 아티팩트를 최소화 오르간. 이것은 우리가 장기 보유자에 의해 생성 된 제약을 제거하고 10,11 안정제를 도입함으로써 해결 주요 관심사이다.

이 프로토콜에서 가장 중요한 단계 중 하나는 동물 및 장기 노출에 모두 적정 온도를 유지하는 것이다. 실제로, 마취 심한 저체온증을 유도하고 적절한 체온을 유지하는 것은 상당히 실험의 완료 전에 사망 가능성을 감소시킨다. 또한, 노출 된 장기는 급속히 수술 PROC 둘 중에 외부 환경와 열교환edures 및 영상. 온도의 지방 감소가 심한 exocytic 단계의 속도론을 느리게하기 때문에, 가열 램프, 대물 히터와 커플 링 젤 또는 따뜻한 식염수 하나와 촉촉한 그랜드를 유지하여 사용하여이를 방지하기 위해 중요하다. 환경 챔버와 현미경의 전체 케이스는 온도를 제어하기위한 좋은 솔루션입니다. 또 다른 중요한 단계는 안정화 및 혈류의 유지 간의 적절한 균형을 달성하는 것이다. 실제로, 적절히 안정화되지 않은 제제에서, 그것은 크기 미크론 범위에 분비 과립의 속도론을 수행하는 것은 매우 어렵다. 한편, 큰 액포 또는 조절 된 세포 외 유출의 상당한 억제의 형성에 혈액 공급 결과의 환원. 이 균형을 달성하기 위해 끊임없이 혈액의 흐름을 모니터링하고 장기 안정을위한 압력을가하면서 세포 손상의 징후를 확인하는 것이 중요합니다.

이 연구를 위해 우리는 동시에 이마 기 수있는 형질 전환 마우스를 선택했지만분비 과립과 혀끝 원형질막 NG, 여기에서 기술 된 과정은 몇몇 다른 세포 내 과정을 연구하기 위해 확장 될 수있다. 이것은 특정 세포 구조 레이블 및 SGS의 상 하나 또는 전신적으로 직접 투여 될 수있는 형광 태그 된 분자를 사용하여 달성 될 수있다. 대안 적으로, 형광 태그 된 분자를 발현하는 신규 유전자 변형 마우스 모델은 글루코스 수송 GLUT4, F-액틴 마커 LifeAct, 핵 마커 히스톤 2B 마우스 및 autophagy에 마커 LC3-GFP로 개발되었다. 마지막으로, 우리는 높은 해상도 SG를 고정화하고 화상에 개발 한 기본적인 전략은 잠재적으로 다른 장기 (예, 췌장, 간, 신장, 및 젖샘) 크기의 몇 가지 수정을 도입함으로써 또는 안정제의 형태를 확장 할 수있다.

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Acknowledgments

이 연구는 NIH의 교내 연구 프로그램, 치과와 두개 안면 연구소의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Isoflourane (Forane) Baxter 101936-40 Handle under chemical hood
Ketamine (ketaved) Fort Dodge Animal Health 57457-034-10 Stock solution 100 mg/ml
Xylazine (Anased) Akorn, Decatur 61311-481-10 Stock solution 100 mg/ml
Neomycin/Polymyxin B Bausch and Lomb 24208-785-55 Use to lubricate the eye of the mouse
Carbomer-940 Ashalnd, Inc. 4607-1
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876
Triethanolamine Sigma-Aldrich 90279 Add drop wise to prevent the solution to solidify
Isoproternol Sigma-Aldrich 16504 Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C
Instrument
Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) Braintree Scientific 190AF
Portable Downdraft table equipped with HEPA filter Hazard Technology PDDT
Heat lamp, Model HL1 Braintree Scientific HL-1 US
MicroTherma 2T Thermometer Braintree Scientific TW2
Operating Scissors (11.5 cm straight World Precision Instruments 5003708-12
#7 curved tip tweezers World Precision Instruments 14187
Microscissors World Precision Instruments 503365
Black Braided Silk suture #4.0 George Tiemann Co 160-1219-4
Gauze sponges 2" x 2" Tyco Healthcare 9022
Lens cleaning tissue Olympus CL-TISSUE (M97) AX6476

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References

  1. Lippincott-Schwartz, J. Emerging in vivo analyses of cell function using fluorescence imaging (*). Annu Rev Biochem. 80, 327-332 (2011).
  2. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
  3. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
  4. Dunn, K. W., et al. Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, C905-C916 (2002).
  5. Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Weigert, R. Regulated exocytosis: novel insights from intravital microscopy. Traffic. 13, 627-634 (2012).
  6. Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13552-13557 (2011).
  7. Masedunskas, A., Weigert, R. Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents. Traffic. 9, 1801-1810 (2008).
  8. Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1347-C1357 (2009).
  9. Sramkova, M., et al. Current Frontiers and Perspectives in Cell Biology. Najman, S. Intech. (2012).
  10. Masedunskas, A., et al. Everything you need to know about intravital microscopy: A practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2, (2012).
  11. Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., Weigert, R. Intravital microscopy to image membrane trafficking in live rats. Methods Mol. Biol. 931, 153-167 (2013).
  12. Babbey, C. M., Ryan, J. C., Gill, E. M., Ghabril, M. S., Burch, C. R., Paulman, A., Dunn, K. W. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. Intravital. 1, 44-53 (2012).
  13. Rothstein, E. C., Nauman, M., Chesnick, S., Balaban, R. S. Multi-photon excitation microscopy in intact animals. J. Microsc. 222, 58-64 (2006).
  14. Klinger, A., Orzekowsky-Schroeder, R., von Smolinski, D., Blessenohl, M., Schueth, A., Koop, N., Huettmann, G., Gebert, A. Complex morphology and functional dynamics of vital murine intestinal mucosa revealed by autofluorescence 2-photon microscopy. Histochem. Cell Biol. 137, 269-278 (2012).
  15. Peter, B., Van Waarde, M. A., Vissink, A., s-Gravenmade, E. J., Konings, A. W. Degranulation of rat salivary glands following treatment with receptor-selective agonists. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 22, 330-336 (1995).
형광 단백질을 표현 라이브 마우스의 이미징 세포 이하의 구조물의 intravital 현미경
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Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins. J. Vis. Exp. (79), e50558, doi:10.3791/50558 (2013).More

Masedunskas, A., Porat-Shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins. J. Vis. Exp. (79), e50558, doi:10.3791/50558 (2013).

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