Vi beskriver en robust og alsidig protokol for analyse nukleare arkitektur ved 3D DNA FISH hjælp direkte mærkede fluorescerende prober.
3D DNA FISH er blevet et vigtigt værktøj til at analysere tredimensionelle organisering af kernen, og flere variationer af teknikken er blevet offentliggjort. I denne artikel beskriver vi en protokol, der er blevet optimeret til robusthed, reproducerbarhed, og brugervenlighed. Brightly fluorescerende direkte mærkede prober er genereret af nick-translation med amino-allyldUTP efterfulgt af kemisk kobling af farvestoffet. 3D DNA FISH udføres under anvendelse af en fryse-tø trin for celle permeabilisering og et opvarmningstrin til samtidig denaturering af probe og nuklear DNA. Protokollen er gældende for en række celletyper og en række prober (BAC, plasmider, fosmids eller helt kromosom Paints) og giver mulighed for high-throughput automatiseret billeddannelse. Med denne metode vi rutinemæssigt undersøge kernelokalisering af op til tre kromosomale regioner.
DNA fluorescens in situ hybridisering (FISH DNA) giver den tre-dimensionelle visualisering af individuelle gen loci, subchromosomal domæner og endda hele kromosomer i alle faser af cellecyklus. 2D FISH anvendes til metafase undersøgelser mens 3D FISH er blevet grundigt anvendt til at probe forholdet mellem rumlige organisering af genomet og dets funktion i løbet af interfase (1,2 og referencer deri). Historisk set blev co-forening undersøgelser udført ved at undersøge snesevis til hundredvis af enkelte loci ved FISH. For nylig kraftfulde højt gennemløb 3C-baserede teknikker såsom 4C og Hi-C er blevet udviklet 3, tillader undersøgelse af molekylære cross-talk mellem mange tusinde forskellige loci. Mens 3C-baserede teknikker og DNA fisk kan komplementære metoder, de ikke nødvendigvis svare på de samme spørgsmål. 3C baserede metoder giver et ensemble udlæsning af blandede cellepopulationer, hvilket resulterer i en sandsyntet for co-foreninger. I modsætning hertil, mens lav i gennemløb FISK baserede teknikker giver mulighed for at analysere rumlige arrangementer af loci eller kromosomer i individuelle celler i henhold til deres udviklingsmæssige eller cellecyklus faser. Derfor vil FISH fortsat være et vigtigt redskab til sondering nukleare struktur-funktion relationer.
Der er to store overvejelser i at udføre vellykkede 3D FISH eksperimenter. Disse er; 1. opnåelse optimalt mærkede prober og 2. Valget af cellulære behandlinger, herunder fiksering, præ-og post-hybridiseringsbetingelser trin, for at bevare nukleare morfologi så meget som muligt, samtidig med at DNA tilstrækkelig tilgængelig for probehybridisering. Effektiv sonde mærkning er afgørende vigtigt for FISH. Traditionelt har nick-translation blevet anvendt til at indføre enten hapten eller fluorofor-konjugerede nukleotider 4.. Tilsvarende kommercielle nick-oversættelse kits er tilgængelige for direkte hapten eller fluorophor inkorporering, BUt også for to-trins mærkning hjælp aminoallyl nukleotider og amin-reaktive farvestoffer. Sidstnævnte gør farvestof inkorporering mere effektiv ved at give DNA-polymerase en mindre pladskrævende molekyle at arbejde med. For nylig har kits til ikke-enzymatisk mærkning af DNA blevet udviklet, som udnytter koordinerende binding af platin til nukleinsyrer. FISH prober kan endda købes allerede er mærket 5. Mens kits og kommercielt fremstillede sonder uden tvivl giver brugervenlighed, de er væsentligt dyrere end at købe de enkelte komponenter og producere sonder internt. Vi optimeret en lav pris nick translation protokol med henblik på direkte mærke mange forskellige AKB prober i flere farver. Vi opdagede, at opnå særdeles rent BAC DNA er kritisk og resulterer i et krav om kun 10-20 ng probe pr FISH dias, sammenlignet med 10 – 20-fold mere, når uren skabelon DNA anvendes, hvilket resulterer i større omkostnings-og tid- besparelser. Anvendelsen af amino-allyldUTP muliggør fleksibel mærkning afsonder med ledige amin-reaktive farvestoffer (f.eks Alexa Fluor eller Cy-farvestoffer) eller haptener (fx biotin, digoxigenin). Hapten-mærkede prober detekteres ved fluorofor-konjugerede antistoffer eller streptavidin at forstærke og visualisere signalet. Bright direkte mærkede prober viser generelt mindre baggrundsfarvning og undgå overdreven forstærkning af signaler, og dermed resulterer i en mere nøjagtig gengivelse af kernelokalisering og locus morfologi.
Der er flere forskellige fisk teknikker, der bruger forskellige fikseringsmidler, pre-behandlinger, og post-hybridisering vasker men disse generelt falder i følgende kategorier: glutaraldehyd fiksering med NaOH denaturering, formaldehyd fiksering med HCI denaturering, og formaldehyd fiksering med varme denaturering 6-9 . Hver af disse har fordele og ulemper. Glutaraldehyd fiksering resulterer i god nukleare strukturel konservering, men kræver behandling med reduktionsmidler for at minimereden resulterende autofluorescence og NaOH behandling skal nøje kontrolleres for at balancere tilstrækkeligt DNA denaturering og potentielle skade på nukleare struktur 6.. Formaldehyd fiksering er mindre stærk, hvilket giver en øget risiko for forstyrrelser af nuklear arkitektur, men også typisk give stærkere og mere pålidelige signaler og lavere autofluorescens 9.. HCI behandling depurinates DNA og strips ud proteiner, der giver god adgang til DNA for sonderne, men kan også indføre DNA pauser. Varme fysisk adskiller de to DNA-strenge resulterer i godt mål hybridisering og stærke signaler, men kan forårsage en vis forstyrrelse af nukleare struktur 8.. I hvor høj grad hvert af disse teknikker påvirker proteinepitoper varierer meget 6,9, hvilket resulterer i kravet om eksperimentelt bestemme for hvert protein den optimale protokol til brug i immuno-FISH eksperimenter.
Mens der ikke er 'perfekt' DNA FISH technique kan de alle være nyttigt, hvis velkontrolleret. Vores mål var at optimere en protokol for robust og reproducerbar DNA FISH at undersøge rumlige placering af multiple loci i en række celletyper 10, fokus på opvarmning metode for de fleste pålidelige signaler. Med dette og anvendelse af et automatiseret billedbehandlingssystem vi formål at øge throughput til enkelt-celle analyse af nukleare arrangementer.
3D DNA FISH er blevet en bredt anerkendt værktøj til at analysere rumlige arrangementer i kernen. Mens FISH giver visuelle og direkte resultater, som med hver teknik, er man nødt til at være opmærksom på sine begrænsninger. DNA FISK står den iboende problem, at relativt barske behandlinger er nødvendige for at gøre kromatin tilgængelige for fisk prober, som i sidste ende forstyrrer nukleare struktur-den meget ting, der skal analyseres. Adskillige strategier er blevet forfulgt at jonglere tilgængelighed og struktur konservering. I protokollen beskrevet her, er kromosomalt DNA gjort tilgængelig ved fryse-tø-permeabilisering af celler og varmedenaturering før probehybridisering. Solovei, et al. (2002) analyserede strukturelle ændringer efter lignende behandling og fandt, at den gennemsnitlige forskydning af kromatin domæner var 300 nm, hvilket begrænser løsningen af strukturelle analyse til ca 1 Mb regioner i genomet 8.. Selvom dette ikke er høj opløsning, deter en rimelig skala til analyse nukleare position.
En mere praktisk overvejelse for FISH analyse er, at billedet køb og målinger af nukleare afstande er tidskrævende processer, som begrænser antallet af kerner, der kan analyseres. For at studere sjældne begivenheder, vi havde til formål at gøre high throughput automatiseret billeddannelse. Så med passende kontroller på plads, kan tilstrækkeligt antal sammenlignes for at muliggøre robust statistisk analyse af rumlige relationer. Vi rutinemæssigt analyserer 600 kerner per datapunkt, som vi bestemme 3D koordinater af alle fisk signaler inden den nukleare volumen. Disse data kræver meget lidt lagerplads og giver mulighed for analyse af inter-og intra-allel afstande eller radiale positioner på ethvert senere tidspunkt. Desuden kan automatiseret behandling gøres på en forsker blind måde som i høj grad reducerer sandsynligheden for ubevidste bias.
For at aktivere denne form for high throughput analyser vores mål var at etablere en hurtig og effektiv måde at udføre DNA FISH. Vi fandt protokollen beskrevet her for at være yderst robust, konsekvent producerer lyse signaler med lav baggrund. Det virkede for alle celletyper vi forsøgt forudsat vi tilpasset det trin fastgørelse af cellerne til diaset. Desuden med en enkelt undtagelse, kunne alle BAC'erne brugte vi blive forvandlet til lyse sonder. Vi har også med succes opdaget en række nukleare proteiner ved antistoffarvning efter DNA FISH. Mens for nogle proteiner Dette fungerer godt, anbefaler vi, sammenlignet med traditionel immunofluorescens (IF) for at sikre sammenhængen i antistoffarvning mønstret mellem IF og DNA immuno FISK (sammenligne 11).
Generelt fandt vi, at prober mærket i forskellige farver producerede de samme resultater. Imidlertid bør følgende aspekter tages i betragtning, når du vælger mærkning farvestof. Først, farven af fluoroforen skal være godt påviseligt ved mikroskop used. For det andet bør bølgelængden af lys, der udsendes af de fluoroforer være tilstrækkeligt forskellige til at undgå bløder igennem ind i den anden kanal. Dette vil afhænge af filtrene i mikroskopet. Og tredje, i det mindste i vores hænder, producere nogle farver lyse signaler mere konsekvent end andre. Vi har altid brugt DAPI (blå) som en kontrastfarve, som gør Alexa Fluor 555 (rød), 488 (grøn) og 647 (langt rød) gode valg til mærkning sonder. Med vores billedbehandlingssystem, fandt vi Alexa Fluor 555 (rød) for at fremstille de lyseste signaler, efterfulgt af Alexa Fluor 488 (grøn). Alexa Fluor 647 (langt rød) har den ulempe, at det ikke kan detekteres af det menneskelige øje, og derfor ingen signaler kan ses, når man ser ned mikroskopet. Så hvis laver tofarvede FISH, anbefaler vi en kombination af røde og grønne farver.
To principielle problemer kan opstå: celler afvaskning dias og svage signaler. Hvor godt celler holde sig til slide er enormt variabel meleen celletyper, og den bedste protokol at afvikle / frø cellerne skal fastsættes. Vi har med succes anvendt enten positivt ladet eller poly-L-lysin-overtrukne objektglas (købt klar til brug), men fandt celler generelt klæbet bedre til poly-L-lysin-overtrukne objektglas. Vi fandt også, at når cellerne var for tætte hele områder ville skalle som et ark, mens automatiserede billeddannelse blev hæmmet, hvis celler var for sparsomme. Således, hvis prøven ikke er alt for kostbar, bør forskellige celle numre seedes til at bestemme den ideelle massefylde. Hvis cellerne er særligt tilbøjelige til at vaske, kan en hydrofob barriere pennen kun anvendes, og FISH trin kan udføres ved omhyggeligt at pipettere løsninger direkte på objektglasset. Pipetting også drastisk reducerer mængden af nødvendige reagenser, men tager betydeligt længere tid, når du laver flere dias.
Svage signaler er normalt på grund af dårlige sonder, og det er værd at investere tid i at gøre gode. Ren BAC DNA bør anvended som udgangsmateriale, kan opnås ved gentagen udfældning eller kommercielt tilgængelige kits. Forurening med bakteriel genomisk DNA negativt påvirker sonde kvalitet og omhyggelig håndtering under cellelyse og filtrering af cellelysatet er forpligtet til at holde det på et minimum. Det er imidlertid ikke nødvendigt at anvende en exonuklease trin at fordøje lineært DNA, da dette reducerer udbyttet. Effektiv mærkning af sonden er afgørende. Den vigtigste kvalitetskontrol for dette trin er at kontrollere fragment størrelse, efter nick translation (se Repræsentative resultater). En 'god' smøre vil næsten altid resultere i en farvestrålende probe. Imidlertid har vi fundet, at der lejlighedsvis en vis BAC ikke kan forarbejdes til en god sonde, og en anden BAC skal vælges. Et andet vigtigt skridt er varmedenatureringen. Hvis temperaturen er for lav, vil DNA'et kun delvist denatureret og probehybridisering vil blive forringet. Hvis temperaturen er for høj, nuklear struktur will være foruroliget mere end nødvendigt. I vores hænder, er 78 ° C på en inverteret hot blok den ideelle kompromis, men kan variere afhængigt af den respektive varme anvendte blok.
Vi har haft gode resultater ved hjælp af Vectashield montering medium, men fandt, at SlowFade Gold har mindre baggrund og bevarer det fluorescerende signal i længere tid. Vi anbefaler ikke brug af hard-set montering medium, som vi fandt dette at påvirke 3D-struktur og danne luftbobler over tid.
Afslutningsvis tilbyde flotte fluorescerende direkte mærkede prober sammen med DNA-FISH protokollen beskrevet her en effektiv løsning for robust og hurtig analyse af nukleare arkitektur, som er anvendelig til en bred vifte af biologiske spørgsmål.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af BBSRC og Wellcome Trust. Vi vil gerne takke Simon Walker om hjælp til billedbehandling og Felix Krueger hjælp til bioinformatiske analyse.
Reagent/Material | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NTB buffer | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DTT | Invitrogen | D-1532 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
dNTPs | Bioline | BIO-39025 | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aminoallyl-dUTP | Ambion | AM8439 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNA Polymerase I | New England Biolabs | M02095 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I recombinant RNase free | Roche | 4716728001 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Step 1.1.4, 1.2.3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaOAc | VWR | 27653 | Step 1.1.5, Step 2.1.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Step 1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications | Invitrogen (Molecular Probes) | A32750, A32756, A32757 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMSO (anhydrous) | Sigma Aldrich | 276855 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma | D7656 | Step 2.1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deionized formamide | Sigma | F-9037 | Step 2.1.1.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dextran sulphate | Sigma Life Sciences | D8906 | Step 2.1.1.4 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
XMP painting probes | MetaSystems | 000000-0528-837 | Step 2.1.1.4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Poly-L-lysine coated slides | Sigma Aldrich | P0425 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hydrophobic pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
70 μm sieve (Mouse fetal liver cells only) | BD Falcon | 352350 | Step 2.1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PFA | Sigma Aldrich | P6148 | Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Tris-Cl | Step 2.1.3 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Saponin from Quillaja bark | Sigma Aldrich | 47036 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Sigma | T9284 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
10 x PBS | Life Technologies (GIBCO) | 70011-036 | Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glycerol | Fisher Scientific | G/0650 | Step 2.1.6 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HCl | VWR | 20252 | Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Formamide | Sigma Aldrich | 47670 | Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SSC | Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 22 | Menzel-Glaser | BB022022A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 50 | Menzel-Glaser | BB022050A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rubber cement | Marabu | 2901 (10 000) | Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DAPI | Invitrogen Molecular Probes | D3571 | Step 2.2.8 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | Step 2.2.10 (mounting medium) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Clear nail polish | Any supplier | Step 2.2.10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Typhoon FLA 7000 phosphoimager | GE Life Sciences | Step 1.2.4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coplin jars | Sigma-Aldrich | S6016 (6EA)/S5516 (6EA) | Step 2.1.3 onwards | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Liquid nitrogen dewar | Any supplier | Step 2.1.7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Base with Black Lid (light-tight chamber) | Simport | M920-2 | Step 2.1.17 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Imaging and Image processing | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafer – Imaging Automation Platform | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MetaCyte – Automated Interphase FISH analysis | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Axio Imager Z2 upright | Zeiss | epifluorescence microscope used with automated imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
IX81 confocal microscope (FV1000) | Olympus | confocal microscope | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bitplane, version 7.3 | Imaris | image analysis and 3D modeling software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Scientific volume Imaging, version 4.1 | Huygens | image analysis and deconvolution software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
FISH buffers and reaction mixes
|