हम सीधे लेबल फ्लोरोसेंट जांच का प्रयोग करके 3D डीएनए मछली द्वारा परमाणु वास्तुकला का विश्लेषण करने के लिए एक मजबूत और बहुमुखी प्रोटोकॉल का वर्णन है.
3 डी डीएनए मछली नाभिक के तीन आयामी संगठन का विश्लेषण करने के लिए एक प्रमुख साधन बन गया है, और तकनीक के कई रूपों प्रकाशित किया गया है. इस लेख में हम मजबूती, reproducibility, और उपयोग में आसानी के लिए अनुकूलित किया गया है जो एक प्रोटोकॉल का वर्णन है. चमकते फ्लोरोसेंट सीधे लेबल जांच डाई के रासायनिक युग्मन द्वारा पीछा एमिनो allyldUTP साथ निक अनुवाद द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. 3 डी डीएनए मछली सेल permeabilization के लिए एक फ्रीज पिघलना कदम और जांच और परमाणु डीएनए के एक साथ विकृतीकरण के लिए एक हीटिंग कदम का उपयोग किया जाता है. प्रोटोकॉल सेल प्रकार की एक सीमा है और जांच की एक किस्म (BACS, प्लास्मिड, fosmids, या पूरे क्रोमोजोम पेंट्स) पर लागू होता है और उच्च throughput स्वचालित इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. इस विधि के साथ हम नियमित तौर पर तीन गुणसूत्र क्षेत्रों तक का परमाणु स्थानीयकरण की जांच.
स्वस्थानी संकरण में डीएनए प्रतिदीप्ति (डीएनए मछली) सेल चक्र के सभी चरणों के दौरान व्यक्तिगत जीन लोकी, subchromosomal डोमेन और यहां तक कि पूरे गुणसूत्रों के तीन आयामी दृश्य की अनुमति देता है. 3 डी मछली को बड़े पैमाने पर अंतरावस्था दौरान जीनोम और अपने कार्य के स्थानिक संगठन (उसमें 1,2 और संदर्भ) के बीच संबंध की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, जबकि 2 डी मछली मेटाफ़ेज़ अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है. ऐतिहासिक, सह संघ अध्ययन मछली द्वारा व्यक्तिगत loci के सैकड़ों के दसियों की जांच से प्रदर्शन किया गया. ऐसे 4C और हाय सी के रूप में अभी हाल ही में शक्तिशाली उच्च throughput -3 सी तकनीक आधारित विभिन्न स्थलों के कई हजारों के बीच आणविक पार से बात की जांच की अनुमति, 3 विकसित किया गया है. 3C आधारित तकनीक और डीएनए मछली पूरक तरीकों से किया जा सकता है, वे आवश्यक रूप से एक ही सवाल का जवाब नहीं है. 3C आधारित विधियों एक probabil में जिसके परिणामस्वरूप, मिश्रित सेल आबादी का एक जोड़ा readout प्रदानसह संघों के लिए अल्पसंख्यक. इसके विपरीत, throughput में कम है, जबकि मछली आधारित तकनीक उनके विकासात्मक या सेल चक्र के चरणों के अनुसार व्यक्ति की कोशिकाओं में लोकी या गुणसूत्रों की स्थानिक व्यवस्था का विश्लेषण करने की संभावना प्रदान करते हैं. इसलिए, मछली परमाणु संरचना समारोह रिश्तों की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण होना जारी रहेगा.
सफल 3 डी मछली प्रयोगों प्रदर्शन में दो प्रमुख वजहें भी होती हैं. ये हैं, 1. बेहतर लेबल जांच और 2 प्राप्त करने के. निर्धारण, पूर्व और बाद के संकरण कदम, जांच संकरण के लिए पर्याप्त रूप से सुलभ डीएनए बनाने के दौरान जितना संभव परमाणु आकारिकी की रक्षा करने सहित सेलुलर उपचार के विकल्प. कुशल जांच लेबलिंग मछली के लिए महत्वपूर्ण है. परंपरागत रूप से, निक अनुवाद hapten या फ्लोरोफोरे संयुग्मित न्यूक्लियोटाइड 4 या तो लागू करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इसी प्रकार, वाणिज्यिक निक अनुवाद किट प्रत्यक्ष hapten या फ्लोरोफोरे समावेश, बू के लिए उपलब्ध हैंटी भी दो कदम लेबलिंग के लिए aminoallyl nucleotides और अमाइन प्रतिक्रियाशील रंजक का उपयोग कर. बाद के डीएनए पोलीमरेज़ के साथ काम करने के लिए एक कम भारी अणु देकर अधिक कुशल डाई समावेश renders. अभी हाल ही में डीएनए की गैर enzymatic लेबलिंग के लिए किट न्यूक्लिक एसिड को प्लैटिनम की coordinative बंधन जो शोषण विकसित किया गया है. मछली जांच भी पहले से ही 5 लेबल खरीदा जा सकता है. किट और वाणिज्यिक निर्मित जांच में कोई संदेह नहीं उपयोग में आसानी देते हैं, वे काफी घर में जांच के व्यक्तिगत घटकों खरीद और उत्पादन की तुलना में अधिक महंगे हैं. हम सीधे कई रंगों में कई अलग अलग बीएसी जांच लेबल करने के क्रम में एक कम लागत निक अनुवाद प्रोटोकॉल अनुकूलित. हम अत्यधिक शुद्ध बीएसी डीएनए प्राप्त करने के 10 की तुलना में, मछली स्लाइड प्रति जांच के केवल 10-20 एनजी के लिए एक आवश्यकता में महत्वपूर्ण और परिणाम है कि पता चला – 20 गुना अधिक अशुद्ध टेम्पलेट डीएनए इस्तेमाल किया जाता है, जब प्रमुख में जिसके परिणामस्वरूप लागत और समय बचत. एमिनो allyldUTP के उपयोग का लचीला लेबलिंग की अनुमति देता हैउपलब्ध अमाइन प्रतिक्रियाशील रंजक (जैसे एलेक्सा Fluor या Cy-रंजक) या haptens (जैसे बायोटिन, digoxigenin) के साथ जांच. Hapten लेबल जांच संकेत बढ़ाना और कल्पना करने की fluorophore संयुग्मित एंटीबॉडी या streptavidin के द्वारा पता चला रहे हैं. ब्राइट सीधे लेबल जांच आम तौर पर कम पृष्ठभूमि धुंधला दिखाने के लिए और इसलिए परमाणु स्थानीयकरण और ठिकाना आकारिकी की एक अधिक सही प्रतिनिधित्व है, जिसके परिणामस्वरूप संकेतों के अत्यधिक प्रवर्धन से बचें.
NaOH के विकृतीकरण, एचसीएल विकृतीकरण साथ formaldehyde के निर्धारण के साथ glutaraldehyde निर्धारण, और गर्मी विकृतीकरण साथ formaldehyde के निर्धारण 6-9: अलग fixatives, पूर्व उपचार, और बाद संकरण धोने का उपयोग करें, लेकिन इन आम तौर पर निम्नलिखित श्रेणियों में आते हैं कि कई अलग मछली तकनीकों हैं . इनमें से प्रत्येक के फायदे और नुकसान है. Glutaraldehyde निर्धारण अच्छा परमाणु संरचनात्मक संरक्षण में परिणाम है, लेकिन कम से कम करने के लिए एजेंटों को कम करने के साथ उपचार की आवश्यकतापरिणामस्वरूप autofluorescence, और NaOH के इलाज ध्यान से पर्याप्त डीएनए विकृतीकरण और परमाणु संरचना 6 से संभावित नुकसान को संतुलित करने के लिए नियंत्रित किया जाना चाहिए. Formaldehyde निर्धारण परमाणु वास्तुकला के perturbations की एक वृद्धि की संभावना दे रही है, कम मजबूत है, लेकिन यह भी आम तौर पर मजबूत और अधिक विश्वसनीय संकेत और 9 autofluorescence कम दे रही है. एचसीएल उपचार जांच के लिए डीएनए के लिए अच्छी पहुँच उपलब्ध कराने, प्रोटीन बाहर डीएनए और स्ट्रिप्स depurinates, लेकिन यह भी डीएनए टूट शुरू हो सकता है. ताप शारीरिक रूप से अच्छा लक्ष्य संकरण और मजबूत संकेतों में जिसके परिणामस्वरूप दो किस्में डीएनए को अलग करती है लेकिन परमाणु संरचना 8 की कुछ गड़बड़ी पैदा कर सकता है. जो इन तकनीकों में से प्रत्येक प्रोटीन एपिटोप्स को प्रभावित करने के लिए डिग्री प्रयोगात्मक प्रत्येक प्रोटीन इम्युनो मछली प्रयोगों में उपयोग करने के लिए इष्टतम प्रोटोकॉल के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता है, जिसके परिणामस्वरूप व्यापक रूप 6,9 बदलता रहता है.
कोई 'सही' डीएनए मछली ते जबकि वहाँअच्छी तरह से नियंत्रित अगर chnique, वे सभी उपयोगी हो सकता है. हमारा लक्ष्य सबसे अधिक विश्वसनीय संकेत के लिए हीटिंग विधि पर ध्यान केंद्रित, सेल प्रकार 10 की एक किस्म में कई स्थलों के स्थानिक स्थिति की जांच के लिए मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डीएनए मछली के लिए एक प्रोटोकॉल का अनुकूलन के लिए था. यह और एक स्वचालित इमेजिंग प्रणाली के उपयोग के साथ हम परमाणु व्यवस्था की एकल कोशिका विश्लेषण के लिए throughput बढ़ाने के उद्देश्य से.
3 डी डीएनए मछली नाभिक में स्थानिक व्यवस्था का विश्लेषण करने के लिए एक व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त उपकरण बन गया है. मछली के रूप में हर तकनीक के साथ, दृश्य और प्रत्यक्ष परिणाम प्रदान करता है, एक अपनी सीमाओं के बारे में पता करने की जरूरत है. डीएनए मछली अपेक्षाकृत कठोर उपचार अंत में विश्लेषण किया जा रहा है कि परमाणु संरचना बहुत बात बाधित जो मछली जांच के लिए chromatin सुलभ बनाने के लिए आवश्यक हैं कि जन्मजात समस्या झेलनी पड़ती है. कई रणनीतियों पहुंच और संरचना संरक्षण हथकंडा करने के लिए अपनाई गई है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल में, गुणसूत्र डीएनए जांच के संकरण से पहले कोशिकाओं और गर्मी विकृतीकरण के फ्रीज पिघलना permeabilization के द्वारा सुलभ बना दिया है. Solovei, एट अल., (2002) इसी तरह के उपचार के बाद संरचनात्मक परिवर्तनों का विश्लेषण किया और chromatin डोमेन की औसत विस्थापन जीनोम 8 में लगभग 1 एमबी क्षेत्रों के लिए संरचनात्मक विश्लेषण का संकल्प सीमा है, जो 300 एनएम था. इस उच्च संकल्प नहीं है, यहपरमाणु स्थिति का विश्लेषण करने के लिए एक उचित पैमाने पर है.
मछली के विश्लेषण के लिए एक और अधिक व्यावहारिक विचार है कि छवि के अधिग्रहण और परमाणु दूरी की माप का विश्लेषण किया जा सकता है कि नाभिक की संख्या सीमित है, जो समय लेने वाली प्रक्रिया है है. हम उच्च throughput स्वचालित इमेजिंग करने के लिए उद्देश्य से निराला घटनाओं का अध्ययन करने के लिए आदेश में. फिर, जगह में उपयुक्त नियंत्रण के साथ, पर्याप्त संख्या स्थानिक संबंधों की मजबूत सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए तुलना की जा सकती. हम नियमित रूप से हम परमाणु मात्रा के भीतर सभी मछली संकेतों के 3 डी निर्देशांक निर्धारित जिसके लिए डेटा बिंदु प्रति 600 नाभिक का विश्लेषण. ये आंकड़े बहुत कम भंडारण स्थान की आवश्यकता होती है और अंतर और इंट्रा allelic दूरी, या किसी भी बिंदु पर बाद में रेडियल पदों के विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं. इसके अलावा, स्वचालित प्रसंस्करण बहुत बेहोश पूर्वाग्रह की संभावना को कम कर देता है जो एक शोधकर्ता अंधा तरीके से किया जा सकता है.
उच्च throughput analys के इस तरह सक्षम करने के लिए, हमारे लक्ष्य डीएनए मछली प्रदर्शन की एक तेज और कुशल तरीके से स्थापित करने के लिए किया गया है. हम प्रोटोकॉल लगातार कम पृष्ठभूमि के साथ उज्ज्वल संकेतों के उत्पादन, बेहद मजबूत होने के लिए यहाँ वर्णित पाया. यह हम स्लाइड करने के लिए कोशिकाओं को संलग्न करने के कदम अनुकूलित प्रदान की कोशिश की सभी प्रकार की कोशिकाओं के लिए काम किया. इसके अलावा, एक अपवाद के साथ, हम सभी इस्तेमाल BACS उज्ज्वल जांच में तब्दील किया जा सकता है. हम भी सफलतापूर्वक डीएनए मछली के बाद एंटीबॉडी धुंधला द्वारा परमाणु प्रोटीन का एक नंबर का पता चला है. यह अच्छी तरह से काम करता है कुछ प्रोटीन के लिए करते हैं, हम अगर और डीएनए इम्युनो मछली (11) की तुलना के बीच एंटीबॉडी धुंधला पैटर्न की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए परंपरागत immunofluorescence (यदि) के साथ तुलना की सलाह देते हैं.
आम तौर पर, हम अलग अलग रंग में लेबल जांच ही परिणाम है कि उत्पादन पाया. लेबलिंग डाई जब चुनने हालांकि, निम्नलिखित पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए. सबसे पहले, की fluorophore रंग माइक्रोस्कोप यू द्वारा अच्छी तरह से पता लगाने योग्य होने की जरूरतपता. दूसरा, fluorophores के द्वारा उत्सर्जित प्रकाश की तरंग दैर्ध्य अन्य चैनल में माध्यम से खून से बचने के लिए पर्याप्त रूप से अलग होना चाहिए. इस माइक्रोस्कोप में फिल्टर पर निर्भर करेगा. और तीसरा, कम से कम हमारे हाथ में कुछ रंग अधिक लगातार दूसरों की तुलना में उज्जवल संकेतों का उत्पादन. हम हमेशा जांच लेबलिंग के लिए अच्छा विकल्प एलेक्सा Fluor 555 (लाल), 488 (हरा) बनाता है जो एक counterstain रूप DAPI (नीला) का इस्तेमाल किया, और 647 (दूर लाल) है. हमारे इमेजिंग प्रणाली के साथ, हम एलेक्सा Fluor 488 (हरा) के बाद प्रतिभाशाली संकेतों, निर्माण करने के लिए एलेक्सा Fluor 555 (लाल) पाया. एलेक्सा Fluor 647 (दूर लाल) यह मानव आँख से नहीं पाया जा सकता है और माइक्रोस्कोप के नीचे देख जब इसलिए कोई संकेत देखा जा सकता है कि नुकसान है. दो रंग मछली कर इस प्रकार, यदि हम लाल और हरे रंगों के संयोजन की सलाह देते हैं.
दो प्रमुख समस्याएं पैदा कर सकते हैं: कक्षों स्लाइड और कमजोर संकेतों दूर धोने. अच्छी तरह से कोशिकाओं स्लाइड का पालन कैसे बेहद चर betw हैeen प्रकार की कोशिकाओं और कोशिकाओं को निर्धारित करने की आवश्यकता है / बीज व्यवस्थित करने के लिए सबसे अच्छा प्रोटोकॉल. हम सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया है या तो सकारात्मक आरोप लगाया या पाली एल lysine लेपित स्लाइड्स (इस्तेमाल के लिए तैयार खरीदा है), लेकिन कोशिकाओं को आम तौर पर पाली एल lysine लेपित स्लाइड्स के लिए बेहतर पालन पाया. हम यह भी कोशिकाओं स्वचालित इमेजिंग बाधा उत्पन्न किया गया था, जबकि बहुत घने पूरे क्षेत्रों, एक पत्र के रूप में दूर छील होगा थे जब कोशिकाओं को भी विरल थे कि पाया. नमूना भी कीमती नहीं है इस प्रकार, यदि अलग सेल नंबर आदर्श घनत्व निर्धारित करने के लिए वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए. कोशिकाओं को धोने के लिए विशेष रूप से ग्रस्त हैं, तो एक hydrophobic बाधा कलम का इस्तेमाल किया जा सकता है, और मछली कदम सावधानी से सीधे स्लाइड पर समाधान pipetting द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है. Pipetting भी काफी जरूरत अभिकर्मकों की मात्रा कम कर देता है, लेकिन एकाधिक स्लाइड कर जब काफी समय लेता है.
कमजोर संकेतों आमतौर पर गरीब जांच की वजह से कर रहे हैं, और यह अच्छे लोगों को बनाने में समय निवेश के लायक भी है. स्वच्छ बीएसी डीएनए का उपयोग किया जाना चाहिएदोहराया वर्षा या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जो सामग्री के रूप में शुरू किया. बैक्टीरियल जीनोमिक डीएनए के साथ प्रदूषण को नकारात्मक रूप से सेल के दौरान जांच की गुणवत्ता और सावधानी से निपटने को प्रभावित करता है और सेल lysate के फिल्टर एक न्यूनतम करने के लिए रखने के लिए यह आवश्यक है. यह बहुत उपज कम कर देता है के रूप में यह है, तथापि, रैखिक डीएनए को पचाने के लिए एक exonuclease कदम का उपयोग करने के लिए आवश्यक नहीं है. जांच के कुशल लेबलिंग महत्वपूर्ण है. इस कदम के लिए सबसे महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण (प्रतिनिधि परिणाम देखें) निक अनुवाद के बाद टुकड़ा आकार जाँच कर रहा है. एक 'अच्छा' धब्बा लगभग हमेशा एक चमकीले रंग जांच का परिणाम देगा. हालांकि, हम कभी कभी एक निश्चित बीएसी एक अच्छा जांच में कार्रवाई की है, और एक अलग बीएसी चुने जाने की आवश्यकता नहीं किया जा सकता है कि मिल गया है. एक और महत्वपूर्ण कदम गर्मी विकृतीकरण है. तापमान बहुत कम है, डीएनए केवल आंशिक रूप से विकृत हो जाएगा और जांच संकरण ख़राब हो जाएगा. तापमान बहुत अधिक है, तो परमाणु संरचना वाईआवश्यकता से अधिक परेशान हो जाएगा. हमारे हाथ में, एक औंधा गर्म ब्लॉक पर 78 डिग्री सेल्सियस आदर्श समझौता है, लेकिन इस का इस्तेमाल संबंधित गर्म ब्लॉक के आधार पर भिन्न हो सकते हैं.
हम Vectashield बढ़ते माध्यम का उपयोग कर अच्छे परिणाम था, लेकिन SlowFade गोल्ड कम पृष्ठभूमि है और लंबे समय तक के लिए फ्लोरोसेंट संकेत को बरकरार रखता है कि मिल गया है. हम इस 3 डी संरचना को प्रभावित करने के लिए और समय के साथ हवा बुलबुले बनाने के लिए मिल गया के रूप में हम कड़ी मेहनत से सेट बढ़ते मध्यम के इस्तेमाल की सिफारिश नहीं है.
अंत में, यहाँ वर्णित डीएनए मछली प्रोटोकॉल के साथ चमकीले फ्लोरोसेंट सीधे लेबल जांच जैविक सवालों की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू है जो परमाणु वास्तुकला की मजबूत और तेजी से विश्लेषण के लिए एक कुशल समाधान प्रदान करते हैं.
The authors have nothing to disclose.
इस काम बीबीएसआरसी और वेलकम ट्रस्ट द्वारा वित्त पोषित किया गया. हम bioinformatic विश्लेषण के साथ मदद के लिए इमेजिंग और फेलिक्स ईद्भूजर के साथ सहायता के लिए साइमन वाकर को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Reagent/Material | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NTB buffer | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DTT | Invitrogen | D-1532 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
dNTPs | Bioline | BIO-39025 | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aminoallyl-dUTP | Ambion | AM8439 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNA Polymerase I | New England Biolabs | M02095 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I recombinant RNase free | Roche | 4716728001 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Step 1.1.4, 1.2.3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaOAc | VWR | 27653 | Step 1.1.5, Step 2.1.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Step 1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications | Invitrogen (Molecular Probes) | A32750, A32756, A32757 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMSO (anhydrous) | Sigma Aldrich | 276855 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma | D7656 | Step 2.1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deionized formamide | Sigma | F-9037 | Step 2.1.1.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dextran sulphate | Sigma Life Sciences | D8906 | Step 2.1.1.4 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
XMP painting probes | MetaSystems | 000000-0528-837 | Step 2.1.1.4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Poly-L-lysine coated slides | Sigma Aldrich | P0425 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hydrophobic pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
70 μm sieve (Mouse fetal liver cells only) | BD Falcon | 352350 | Step 2.1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PFA | Sigma Aldrich | P6148 | Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Tris-Cl | Step 2.1.3 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Saponin from Quillaja bark | Sigma Aldrich | 47036 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Sigma | T9284 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
10 x PBS | Life Technologies (GIBCO) | 70011-036 | Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glycerol | Fisher Scientific | G/0650 | Step 2.1.6 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HCl | VWR | 20252 | Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Formamide | Sigma Aldrich | 47670 | Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SSC | Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 22 | Menzel-Glaser | BB022022A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 50 | Menzel-Glaser | BB022050A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rubber cement | Marabu | 2901 (10 000) | Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DAPI | Invitrogen Molecular Probes | D3571 | Step 2.2.8 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | Step 2.2.10 (mounting medium) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Clear nail polish | Any supplier | Step 2.2.10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Typhoon FLA 7000 phosphoimager | GE Life Sciences | Step 1.2.4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coplin jars | Sigma-Aldrich | S6016 (6EA)/S5516 (6EA) | Step 2.1.3 onwards | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Liquid nitrogen dewar | Any supplier | Step 2.1.7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Base with Black Lid (light-tight chamber) | Simport | M920-2 | Step 2.1.17 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Imaging and Image processing | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafer – Imaging Automation Platform | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MetaCyte – Automated Interphase FISH analysis | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Axio Imager Z2 upright | Zeiss | epifluorescence microscope used with automated imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
IX81 confocal microscope (FV1000) | Olympus | confocal microscope | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bitplane, version 7.3 | Imaris | image analysis and 3D modeling software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Scientific volume Imaging, version 4.1 | Huygens | image analysis and deconvolution software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
FISH buffers and reaction mixes
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