Robust FISH DNA 3D utilizando sondas Diretamente rotuladas

Summary

Nós descrevemos um protocolo robusto e versátil para a análise de arquitetura nuclear por FISH DNA 3D usando sondas fluorescentes diretamente marcadas.

Abstract

PEIXES 3D DNA tornou-se uma ferramenta importante para a análise de organização tridimensional do núcleo, e várias variações da técnica têm sido publicados. Neste artigo descrevemos um protocolo que foi otimizado para robustez, reprodutibilidade e facilidade de uso. Brilhantemente fluorescentes directamente as sondas marcadas são gerados por nick-translation com amino-allyldUTP seguido por acoplamento químico do corante. 3D ADN FISH é realizada utilizando um passo de congelamento-descongelamento para permeabilização celular e um passo de aquecimento para a desnaturação simultânea de sonda e o DNA nuclear. O protocolo é aplicável a uma variedade de tipos de células e uma variedade de sondas (BACs, plasmídeos, fosmids ou tintas cromossoma inteiro) e permite a imagiologia automatizado de alto débito. Com este método rotineiramente investigar a localização nuclear de até três regiões cromossómicas.

Introduction

DNA de hibridização in situ de fluorescência (FISH ADN) permite a visualização tridimensional de loci de genes individuais, domínios subcromossómico e cromossomas inteiros, mesmo durante todas as fases do ciclo celular. PEIXES 2D é utilizado para estudos FISH metafase enquanto 3D tem sido extensivamente utilizado para sondar a relação espacial entre a organização do genoma e a sua função durante a interfase ^(1,2 e referências citadas). Historicamente, os estudos de co-associação foram realizadas por investigar dezenas a centenas de loci individuais por FISH. Mais recentemente poderoso de alto rendimento com base em técnicas tais como 3C 4C e Hi-C foram desenvolvidos ^três, permitindo que a investigação das molecular conversa cruzada entre os muitos milhares de diferentes loci. Embora as técnicas baseadas em 3C e FISH DNA podem ser métodos complementares, que não necessariamente responder as mesmas perguntas. Métodos baseados em 3C proporcionar uma leitura de conjunto de populações de células misturadas, resultando numa probabildade de co-associações. Por outro lado, enquanto a baixa no rendimento, técnicas de base de peixe oferecem a possibilidade de analisar arranjos espaciais de loci ou cromossomos nas células individuais de acordo com as suas fases do ciclo de desenvolvimento ou celular. Assim, FISH continuará a ser uma importante ferramenta para sondar relações estrutura-função nucleares.

Há duas considerações importantes na realização de experiências bem-sucedidas Fish 3D. Estes são: 1. obtenção de sondas marcadas optimamente e 2. escolha de tratamentos celulares, incluindo fixação, pré-e pós-passos de hibridação, para preservar a morfologia nuclear, tanto quanto possível, ao mesmo tempo que o DNA suficientemente acessível para hibridação da sonda. Eficiente rotulagem sonda é criticamente importante para os peixes. Tradicionalmente, a nick-translation foi usado para introduzir ou hapteno ou nucleótidos fluoróforos ^4. Da mesma forma, kits nick-tradução comerciais estão disponíveis para hapten direta ou incorporação fluorophore, but também para duas etapas de marcação utilizando nucleótidos aminoallyl e corantes reactivos com amina. Este último torna corante incorporação mais eficiente, dando uma molécula de ADN-polimerase menos volumoso para trabalhar. Mais recentemente, a kits para a rotulagem não enzimática do DNA têm sido desenvolvidos, que exploram ligação coordenativa de platina para os ácidos nucleicos. Sondas de peixe pode até ser comprado já com o ^5. Enquanto kits e sondas fabricadas comercialmente sem dúvida dar a facilidade de uso, eles são consideravelmente mais caro do que comprar os componentes individuais e produzir sondas em casa. Nós otimizamos um nick protocolo tradução de baixo custo, a fim de marcar diretamente diversos sondas BAC em várias cores. Nós descobrimos que a obtenção de ADN BAC de elevada pureza é importante e resulta num requisito de que apenas 10-20 ng de sonda por lâmina FISH, ante de 10 - 20 vezes mais quando o ADN molde impuro é usado, resultando num maior custo e tempo- poupança. A utilização de amino-allyldUTP permite rotulagem flexívelsondas com amina disponíveis corantes reactivos (por exemplo, Alexa Fluor ou CY-corantes) ou haptenos (por exemplo, biotina, digoxigenina). Sondas de hapteno-marcadas são detectadas por anticorpos fluoróforos ou estreptavidina para amplificar o sinal e visualizar. Sondas marcadas directamente brilhantes mostram geralmente menos a coloração de fundo e evitar o excesso de amplificação de sinais, daí resultando uma representação mais precisa da localização nuclear e morfologia lócus.

Existem várias técnicas diferentes peixes que usam diferentes fixadores, pré-tratamentos e lavagens pós-hibridação, mas estes geralmente se enquadram nas seguintes categorias: fixação de glutaraldeído com NaOH desnaturação, fixação em formol com HCl desnaturação e fixação em formol com desnaturação ^6-9 . Cada um destes tem vantagens e desvantagens. Glutaraldeído resultados de fixação em bom estado de conservação estrutural nuclear, mas necessita de tratamento com agentes redutores para minimizara autofluorescência resultante, tratamento com NaOH e deve ser cuidadosamente controlado para equilibrar a desnaturação do ADN suficiente e dano potencial a estrutura nuclear ^6. Fixação em formol é menos forte, dando uma maior probabilidade de perturbações da arquitetura nuclear, mas também geralmente com sinais mais fortes e mais confiáveis ​​e menores autofluorescência ^9. HCl tratamento depurinates DNA e tiras fora proteínas, proporcionando um bom acesso ao DNA para as sondas, mas também pode apresentar quebras de DNA. Aquecimento separa fisicamente as duas fitas de DNA, resultando em boa hibridização alvo e sinais fortes, mas pode causar alguma perturbação da estrutura nuclear ^8. O grau em que cada uma destas técnicas afecta epitopos da proteína varia amplamente ^6,9, resultando na necessidade de determinar experimentalmente para cada proteína o protocolo ideal para usar em experiências de imuno-peixe.

Embora não haja um 'perfeito' DNA FISH tehaver descrição prévia, todos eles podem ser úteis se forem bem controlados. O nosso objectivo foi o de optimizar um protocolo para robusto e reprodutível PEIXES DNA para investigar o posicionamento espacial dos múltiplos loci em uma variedade de tipos de células ^10, incidindo sobre o método de aquecimento para a maioria dos sinais fiáveis. Com esta e a utilização de um sistema de imagem automatizado que visa aumentar a taxa de transferência para a análise de arranjos nucleares de célula única.

Protocol

1. Gerando Sondas de DNA diretamente identificadas por Nick Translation

Nota: sondas Diretamente rotulados feitas a partir de BACs (100-250 kb) consistentemente produzem sinais luminosos. Se forem necessárias sondas mais pequenas, usar fosmids (40-50 kb) ou mesmo os plasmídeos contendo inserções de 5-10 kb. Identificar BAC ou fosmid clones correspondentes a genes específicos usando Ensemble ou navegadores genoma UCSC. Prepare DNA BAC alta qualidade por precipitação repetido ou usar kits disponíveis no mercado. A menos que a preparação está contaminado com DNA genómico bacteriano, a sonda menos é necessário, por lâmina. Realize rotulagem em duas etapas: tradução nick introdução aminoallyl-dUTP e acoplamento químico de um corante reativo a amina.

1.1. Nick Translation

Durante a tradução nick, DNase I é usado para criar quebras de-fita simples. DNA polimerase I alonga 'extremidades destes' a 3 nicks ', substituindo nucleotídeos existentes por novos, t aqui 'traduzir' o nick e proporcionando, assim, a oportunidade de incorporar nucleotídeos marcados. Aminoallyl-dUTP é escolhido por causa da incorporação eficiente pela polimerase I do DNA e do seu potencial para o acoplamento químico posterior para corantes reactivos com amina ou haptenos. É fundamental para alcançar o equilíbrio certo entre DNase I nicking e DNA polimerase I de tradução; muito DNase I resultará na digestão excessiva DNA dando baixa produtividade e tamanhos de fragmentos curtos, muito pouco não produzirá nicks suficientes para a polimerase para iniciar a tradução, dando grande tamanho do fragmento e má incorporação de aminoallyl-dUTP. O protocolo seguinte funciona bem, mas pode ser necessário para titular a ADNase I a partir de diferentes fabricantes ou de diferentes lotes.

1. Defina-se etiquetagem de reacção em gelo e incubado durante 2 horas a 16 ° C. Isso deve produzir 0,5-1 mg DNA nick-traduzido e pode ser escalado para cima. Diluir 1:30 em ADNase I ADNase I tampão (isto é, 0,3 U / ul).

1 "> Componente Concentração de estoque Volume ou quantidade DNA BAC 5-10 mg Tampão NTB 10x 5 ul TDT 0,1 M 5 ul dNTP mix 10x 5 ul Aminoallyl-dUTP 0,5 mM 6 mL Polimerase I de ADN 10 U / ul 1 ul ADNase I 10 U / ul 1 ul (de uma diluição de 1:30) _H2O a 50 ul

2. Correr 1 uL num gel de agarose a 2% para verificar o tamanho dos fragmentos etiquetados. Enquanto você corre o gel, manter a reação no gelo. Sucesso nick translatiem resultará em um esfregaço com a maior parte dos fragmentos que funcionam entre 150 pb e 700 pb, com alguns fragmentos maiores em ~ 1 kb (passo crítico: veja resultados representativos). Se necessário, são adicionados mais 1 ul de uma diluição fresco 01:30 ADNase I e incubar a 16 ° C durante 15-30 min. O tempo de incubação pode variar de acordo com a quantidade e qualidade do DNA BAC.
3. Inativar ADNase I por aquecimento a 75 ° C durante 10 min.
4. ADN modificado com amina de limpeza utilizando um kit de purificação de PCR. Eluir em 100 ul _de H2O
5. Etanol precipitado de ADN por adição de 10 ul de NaOAc 3 M (pH 5,2) e 275 ul de etanol. Adicione-se a -20 ° C durante pelo menos 1 hora ou durante a noite. Rotação à velocidade máxima durante 30 min a 4 ° C. Lavar sedimento com 500 ul de etanol a 70% e deixar secar ao ar. Este passo remove os vestígios aminas que irão interferir com a reacção de marcação. Ressuspender o sedimento em 6 mL H ₂ O por 1x reação inicial.
6. Use 1 ul para determinar a concentração do DNA amina modificadopor espectroscopia de UV microvolume.

1.2. O acoplamento do corante fluorescente

A microscopia por fluorescência da sonda é conseguido através de acoplamento químico do corante. Alexa Fluor succinimidilo éster corantes reagir com as aminas de ADN modificado allyldUTP-amino para formar uma ligação covalente, produzindo, assim, as sondas marcadas directamente. Alexa Fluor 488, 555, 647 e os corantes tenham sido bem sucedida para este processo.

1. Ajustar 4 ug de ADN modificado amino-alil até um volume de 5 ul, de calor a 95 ° C durante 5 min, encaixe fresco em gelo e adicionar 3 ml de 0,2 M _NaHCO3.
2. Dissolve-se uma parte alíquota do corante reactivo de amina em 2 mL de DMSO anidro, à temperatura ambiente. Adicionar 8 mL de ADN modificado com _NaHCO3, vortex, rotação do pulso e incubar à temperatura ambiente no escuro durante 1 hora.

Nota: Os corantes reactivos de amina pode ser utilizada para rotular mais do que uma sonda com base no seguinte esquema. Uma vez que oomente 10-20 ng de sonda é usada por rotulagem slide, 1 mg dá sonda suficiente para 50-100 slides. Também é possível armazenar o DNA amina modificado para futuras reacções de etiquetagem, a -20 ° C.

Quantidade de DNA	Volume de DNA	0,2 M NaHCO3	Volume de corante	Total	Suficiente para
4 x 1 ug	1,25 mL cada	0,75 mL cada	0,5 mL cada	2,5 ul (1/4)	50-100 lâminas cada
3 x 1,35 ug	1,67 mL cada	1 ul de cada	0,67 mL cada	3,34 ul (1/3)	65-130 slides cada
2 x 2 ug	2,5 mL cada	1,5 mL cada	1 ul de cada	5 ul (1/2)	100-200desliza cada
1 x 4 ug	5 ul	3 ul	2 ul	10 ul (total)	200-400 lâminas

3. Adicionar 90 ul de _H2O e purificar a sonda marcada usando um kit de purificação de PCR. Eluir em 100 ul 10 mMTris-Cl (pH 8,5).
4. Determinar a concentração de sonda e eficiência de marcação por espectroscopia de espectro completo microvolume (ver Figura 2), utilizando equações de Beer-Lambert (As instruções são dadas na folha de dados que acompanha as Alexa Fluor corantes reativos ou podem ser encontrados online). Sondas que contenham corantes 3-6 por 100 bp funcionar bem. Sondas com menores graus de incorporação pode dar sinais de FISH fracos. Alternativamente, executado 5 uL num gel de agarose a 2%, sem mancha do ADN e verificar a incorporação do corante fluorescente usando uma Phosphoimager. Adicione-mancha do gel com brometo de etídio ou DNA alternativas de coloração e comparar ADN marcado para o ADN total.

Através dos passos seguintes, as células de interesse são fixadas a lâminas e permeabilizadas. O ADN celular e as sondas são marcadas directamente, em seguida desnaturadas em conjunto sobre uma placa quente e hibridado durante a noite numa câmara humidificada à prova de luz.

2.1. Dia 1

1. Probe Precipitation
   Nota: sondas precipitado a algum momento durante o dia 1. Isto pode facilmente ser executada em paralelo com o tratamento das células e não tem de ser feita no início do dia.
   1. Misturar 10-20 ng de sonda marcada directamente, 6 ul ₀ C t-1 DNA (6 mg), 1 ul de DNA de cadeia simples a partir de testículos de salmão (9,7 ug) e ajustar o volume para 100 ul com água.
   2. Adicionar 10 ml 3 M NaOAc e 275 mL EtOH, e misturar em vortex. Precipitar durante pelo menos 1 hora a -20 ° C.
   3. Girar em microcentrífuga a velocidade máxima durante 30 min a 4 ° C. Lave pellet com etanol 70% e girar novamente. Dry pellete ressuspender em 5 mL de formamida desionizada. Ressuspender em 30 min a 37 ° C enquanto se agita a 1.000 rpm (protegido da luz lugar folha sobre o Thermomixer).
   4. Adicionam-se 5 pi de mistura de sulfato de dextrano e agitar por mais 10 min a 37 ° C novamente protegidas da luz. Pipeta cima e para baixo antes de pipetagem para lamela.
      Nota: Para pintura cromossômica combinado com sondas BAC, inteiros cromossomo sondas de pintura que são fornecidos em pronto para uso mix de hibridização são uma opção conveniente. Ressuspender o precipitado BAC sonda (com C ₀ t1 DNA e DNA de cadeia simples de testículos de salmão) em 10 mL mix pintura cromossomo pipetando cima e para baixo. Incubar a 37 ° C enquanto agitando a 300-500 rpm durante 10 min. Use 10 ml de tinta cromossomo / BAC sonda mistura por ponto.
2. Colocar células para Slides
   Nota: As células propensão para aderir a lâminas varia grandemente com o tipo de célula. Para cada tipo de célula, determinar oóptima o tempo de estabilização e a densidade celular empiricamente. Para obter resultados consistentes, as células devem estar numa única suspensão de células.
   Para facilitar o uso do círculo da área das células será manchado com uma caneta hidrófobo, embora, para as células em suspensão em PBS, isto não é estritamente necessário. Uma barreira hidrofóbica evita que a suspensão de espalhar sobre a lâmina, mantém-se a três amostras por lâmina bem separadas e permite a utilização de volumes muito pequenos de solução de anticorpo em imuno-FISH. Além disso, a área de mancha pode ser mantido a um mínimo, se o número de células são reduzidas.
3. Células de fígado fetal de rato
   1. Colete cada E13.5 rato fígado fetal em cerca de 1,5 ml de PBS e ressuspender pipetando cima e para baixo. Girar em microcentrífuga a 3.000 rpm por 2 min. Repita lava três vezes. Nos últimos lavagem, as células de tensão através de um peneiro 70. Ressuspender as células a partir de um fígado em 160 ul de PBS e utilizar 50 μ por mancha. Deixe as células que se contentar com 2 min à temperatura ambiente.
4. Mouse ES Células
   1. Células-tronco embrionárias de rato não vai ficar fácil para o slide. Em um slide, círculo a área das células será manchado com uma caneta hidrofóbica. Prepara-se uma suspensão de 20.000-50.000 células por 80-100 uL em meio de cultura normal, pipeta em círculo e deixar a aderir durante cerca de 3 horas numa incubadora humidificada Nota:. Alternativamente, as células ES podem ser cultivadas em lâminas, mas em seguida, formarão colônias que podem dificultar a imagem automatizada.
5. As células fixas
   1. Algumas experiências requerem a utilização de células fixas, que não se ligam às corrediças por si mesmos. Fiação suave a 300 rpm durante 3 min utilizando um citocentrífuga preserva a estrutura tridimensional das células e assegura que as células não cair.

Tipo de célula	Suspensão em	Tempo de estabilização	Comentar
Mousefígado fetal	PBS	2 min	No banco
Rato ES	DMEM com suplementos	4 hr	37 ° C em incubadora humidificada
Linfócitos mouse	PBS	2 min	No banco
Rato P20 células germinativas	Fix em solução	Cytospin	No banco

3. Para consertar as células, deslize suavemente submergir em 4% PFA (ATENÇÃO: realizar em capela) por 10 min. Corrigir as células com o slide apartamento em uma bandeja para melhor retenção de células (por exemplo, 50 ml de 4% PFA na tampa de uma caixa de ponta) Nota:. Esta etapa não se aplica a células fixadas antes de apego aos slides.

Para todas as etapas subseqüentes, use 50 ml ou 100 ml frascos Coplin. Tome cuidado para não raspar as células fora quando se deslocam lâminas entre frascos.

4. Quench em 0,1 M de Tris-Cl, pH 7,4, durante 10 min à temperatura ambiente.
5. Permeabilizar células em 0,1% saponin/0.1% de Triton X-100 em PBS durante 10 min à temperatura ambiente.
6. Lavar duas vezes em PBS durante 5 min à TA.
7. Incubar durante pelo menos 20 min em 20% de glicerol / PBS a RT Nota:. Neste ponto, as lâminas podem ser armazenadas em glicerol a 50% / PBS a -20 ° C durante pelo menos várias semanas. Tem sido observado que o armazenamento de pelo menos um dia resulta em um aumento na força de sinal ^9. Recalibrar em temperatura ambiente de 20% de glicerol / PBS antes de prosseguir Nota:. Este é um ponto conveniente para começar a precipitar as sondas (ver 2.1.1).
8. 3x congelamento / descongelamento em azoto líquido. Mergulhe uma lâmina de cada vez em nitrogênio líquido usando um pequeno Dewar. Retirar depois de alguns segundos e um som de estalo característico, e coloque sobre toalha de papel para degelo. Aguarde glicerol congelado opaco para desaparecer em seguida, congelar novamente. Até 15 lâminas pode ser feito comodamente em rotação por três ciclos de congelamento / descongelamento.
9. Wcinza duas vezes em PBS durante 5 min à TA.
10. Incubar em HCI 0,1 M durante 30 min a RT.
11. Lavar com PBS durante 5 min à TA.
12. Permeabilizar em 0,5% de Triton X-100/PBS saponin/0.5% durante 30 min à TA.
13. Lavar duas vezes em PBS durante 5 min à TA.
14. Equilibrar em 50% formamide/2x SSC durante pelo menos 10 min à temperatura ambiente.
15. Pipeta sonda em uma lamela. Retirar a lâmina do frasco e secar o excesso de líquido ao redor do local da célula (s) com uma toalha de papel. Como a seca formamida rapidamente, tome cuidado para não secar células. Para slides com dois ou três pontos de células, aplicar 10 ml de sonda por ponto para um 22 x 50 mm lamela correspondente a manchar local no slide. Inverter lamela para deslizar sobre ponto (s). Selar com cimento de borracha e permitir que esta seque completamente. Proteger da luz em todas as fases subseqüentes.
16. Lâminas de calor a 78 ° C por 2 min, precisamente em um prato quente (por exemplo, um bloco de aquecimento invertido, passo fundamental: ver Discussão). Coloque uma tampa (caixa de papelão ou sim Ilar) sobre a chapa quente para proteger da luz durante a desnaturação.
17. Incubar durante a noite a 37 ° C numa câmara humidificada à prova de luz. Para umedecer, coloque toalhas de papel em uma caixa à prova de luz e umedecer com água.

2.2 Dia 2

1. Prepare Coplin frascos com soluções na temperatura certa para as etapas de lavagem subsequentes. Proteger as lâminas da luz tanto quanto possível em todas as etapas subsequentes. Um café pode faz uma boa cobertura à prova de luz para Coplin frascos.
2. Peel off cimento de borracha e lugar de slides em 2x SSC até lamelas soltar e escorregar.
3. Lave com 50% formamide/2x SSC durante 15 min a 45 ° C. Coloque a tampa em banho-maria para proteger da luz.
4. Lavar em 0,2 x SSC durante 15 min a 63 ° C.
5. Lavar 2x em SSC durante 5 min a 45 ° C.
6. Lavar 2x em SSC durante 5 min à TA.
7. Lavar com PBS durante 5 min à TA.
8. Mancha com DAPI (5 ug / mL em 2x SSC) durante 2 minutos num frasco Coplin, à TA.

conteúdo "> Nota: DAPI solução pode ser armazenada a 4 ° C no escuro, durante 2 meses.

9. Destain em PBS durante 5 min à TA.
10. Para montar a lamela, pipeta meio de montagem sobre uma lamela. Usar 10 ul por ponto de células, utilizando 22 milímetros x 22 milímetros lamelas para um local, e 22 mm x 50 mm para lamelas 2-3 manchas. Seque PBS ao redor do local da célula, tanto quanto possível, mas tome cuidado para não secar as células. Inverter lamela em slide, e selar com verniz.

Representative Results

O protocolo aqui descrito (Figura 1 para uma descrição) foi usado para um grande efeito de combinar o ADN FISH com captura de imagem de alto rendimento para a análise da organização genómica. A geração de sondas de boa qualidade é fundamental para o sucesso (ver Discussão). Figura 2 demonstra duas importantes controles de qualidade para sondas de peixe. Depois de nick-translation, uma mancha de DNA deve ser visível com a maior parte dos fragmentos de funcionamento, entre 150 e 700 pb (Figura 2A). Após o acoplamento químico, a incorporação do corante fluorescente pode ser medida por meio de análise espectroscópica da sonda (Figura 2B).

Ao utilizar boas sondas, seguindo o protocolo FISH DNA geralmente resulta em claros sinais de FISH de DNA em baixo de fundo. Temos utilizado com sucesso este protocolo em uma variedade de diferentes tipos de células, e tanto com microscópios de epi-fluorescência e confocal. Imagem automatizada usando um epi-fluorescence microscópio de sinais de FISH requer cortantes, facilmente identificáveis ​​com pouco fundo (Figura 3), ao passo que a microscopia confocal requer sinais mais intensos. Figura 4A mostra imagens representativas transformados. Coordenadas nucleares de sinais de peixe pode ser obtida, e as relações espaciais de regiões genômicas pode ser computada (para um exemplo veja a Figura 4B). Temos também utilizado pilhas de imagens obtidas por microscopia confocal para modelagem 3D de sinais de FISH nos seus territórios de cromossomos (Filme 1).

Figura 1. Fluxo de Trabalho para a rotulagem sonda e FISH DNA. Preparação Probe é mostrado em azul. Procedimento FISH DNA é mostrado em preto com detalhes fornecidos em verde.

Figura 2. Marcação de sondas por nick-translation e controle de sondas marcadas qualidade. A) Gel mostrando esfregaço ideal antes de aquecer para inativar DNase I (pista 1: escada de DNA, a pista 2 e 3: BACs após nick-translation). Fragmentos deve estar no intervalo de 150-700 pb. Uma mancha adicional no ~ 1 kb é freqüentemente observada com reações nick-tradução de sucesso. B) análise espectro Microvolume de sondas marcadas. Um pico de ADN, a 260 nm, é observada com um segundo pico, que corresponde ao comprimento de onda de absorvância do fluoroforo a sonda é marcada com: Alexa Fluor 488: 495 nm, Alexa Fluor 555: 555 nm, Alexa Fluor 647: 650 nm. São mostrados três sondas com boa incorporação: os picos de absorção fluoróforo são uma altura similar ou superior aos picos de DNA. Alexa Fluor 647 tipicamente tem maior absorvânciade Alexa Fluor 555, que por sua vez tem uma maior absorvência de Alexa Fluor 488. Alexa Fluor 488 também absorve um pouco de luz a 260 nm, portanto, o primeiro pico para esta sonda é maior do que os outros. Sondas com má incorporação mostra fluoróforo absorvância 2-3-vezes inferior do que a absorção de DNA. Sondas com mais do que um pico maior fluoróforo 2 vezes do que o ADN de pico normalmente contêm corante não conjugada que podem causar fundo no peixe.

Figura 3. Tela do software de imagem 3D peixe MetaCyte mostrando uma experiência típica FISH três cores. A tela é dividida em várias partes. A) imagem de campo de visão (FOV) Raw capturado pelo Metafer / MetaCyte sistema de digitalização de slides. B) Gallery de imagens de núcleos identificadas que têm unprocessamento de imagem dergone e segmentação de sinais de peixe. Vários tipos de dados podem ser exibidos em cada galeria de imagens. Neste exemplo, o número de células é mostrada superior esquerdo com vários interallelic e interlocus distâncias topo direita e para ambos os lados por baixo de cada imagem. C) Razão corrediça com o número de núcleos identificados na análise. D) Representação da corrediça com a área digitalizado pela sistema. E) O alargamento da área digitalizada. Manchas brancas representam os núcleos identificados por FOV. F) dados processados. Neste exemplo são apresentados interallelic distâncias máximas entre os sinais verdes (topo) e vermelho (inferior). Os dados mostrados são de rato P20 células germinativas. As sondas estão localizados em cromossomos diferentes, cobrindo HBB e genes HBA e um conjunto de histonas. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 4. Exemplos de imagens processadas e os dados posicionais derivados. A imagens) processados ​​para E13.5 rato as células do fígado fetal corados com sondas BAC localizados em cromossomos diferentes que cobrem Myc e KCNQ1 genes (chamados myc e KvDMR, de cor verde e vermelho, respectivamente). B) Tukey parcelas box-whisker representando a distância interallelic distribuição para os mesmos loci em núcleos 600. Interallelic distância é representada como uma fracção do raio do núcleo '(distância / do raio) para ter em conta as variações no tamanho nuclear. Núcleos de células ES têm um raio de cerca de 5 micrómetros. Sondas vermelhas são significativamente mais juntos do que as sondas verdes (***: p <0,01, teste t não pareado). Dados a partir de ^10.

Filme 1. Modelagem 3D de dois loci dentro de seu cromossomo territory. Duas sondas BAC localizados perto de cada extremidade do cromossomo 7 do mouse foram rotulados (vermelho e vermelho distante, (branco pseudo-colorido)) e hibridizado com uma tinta cromossomo inteiro (verde) de células-tronco embrionárias de rato. Clique aqui para ver filme .

Discussion

FISH DNA 3D tornou-se uma ferramenta amplamente reconhecida para analisar arranjos espaciais no núcleo. Enquanto FISH fornece resultados visuais e direta, como acontece com todas as técnicas, é preciso estar ciente de suas limitações. PEIXES ADN enfrenta o problema inerente que os tratamentos relativamente duras são necessárias para tornar acessível a cromatina sondas FISH que finalmente interrompe-a própria estrutura nuclear coisa que está a ser analisada. Diversas estratégias têm sido perseguidos de conciliar a acessibilidade ea preservação estrutura. No protocolo aqui descrito, o ADN cromossómico é tornada acessível por congelamento-descongelamento a permeabilização das células e desnaturação pelo calor antes da hibridação da sonda. Solovei, et ai., (2002) analisaram as alterações estruturais após tratamento semelhante e verificou que a deslocação média de domínios de cromatina foi de 300 nm, o que limita a resolução da análise estrutural de cerca de 1 Mb regiões no genoma ^8. Embora isso não seja alta resolução, eleé uma escala razoável para analisar a posição nuclear.

Uma consideração mais prático para análise FISH é que a aquisição de imagem e as medições de distâncias nucleares são processos demorados que limitam o número de núcleos que podem ser analisados. A fim de estudar os eventos raros que visam fazer imagens de alta taxa de transferência automatizado. Então, com os controlos apropriados no lugar, um número suficiente pode ser comparado para permitir a análise estatística robusta das relações espaciais. Rotineiramente analisar 600 núcleos por ponto de dados para o qual vamos determinar as coordenadas 3D de todos os sinais de peixe dentro do volume nuclear. Esses dados exigem muito pouco espaço de armazenamento e permitir a análise das distâncias inter e intra-alélicas, ou posições radiais em qualquer momento posterior. Além disso, o processamento automatizado pode ser feito de uma maneira cega investigador que reduz grandemente a probabilidade de polarização inconsciente.

Para habilitar este tipo de analys de alto rendimentoé, nosso objetivo foi o de estabelecer uma maneira rápida e eficiente de realizar FISH DNA. Encontramos o protocolo descrito aqui para ser extremamente robusto, de forma consistente a produção de sinais luminosos, com baixo fundo. Ela trabalhou para todos os tipos de células que tentaram desde que adaptado a etapa de fixação das células para o slide. Além disso, com exceção de uma, todas as BACs que usamos poderia ser transformado em sondas brilhantes. Temos também detectado com êxito um certo número de proteínas nucleares por coloração de anticorpos após ADN FISH. Enquanto para algumas proteínas Isso funciona bem, recomendamos comparação com a imunofluorescência tradicional (IF) para garantir a consistência do padrão de coloração de anticorpos entre IF e DNA imuno FISH (compare ^11).

Geralmente, verificou-se que as sondas marcadas com cores diferentes produziu os mesmos resultados. No entanto, os seguintes aspectos devem ser considerados ao escolher a tinta rotulagem. Primeiro, a cor do fluoróforo deve ser bem detectável pelo u microscópiosed. Em segundo lugar, o comprimento de onda da luz emitida pelos fluoroforos deve ser suficientemente diferente para evitar sangramento através do canal para o outro. Isto irá depender dos filtros no microscópio. E em terceiro lugar, pelo menos em nossas mãos, algumas cores produzir sinais luminosos de forma mais consistente do que outros. Nós sempre usaram DAPI (azul) como um contrastante que faz Alexa Fluor 555 (vermelho), 488 (verde) e 647 (muito vermelho) boas opções para marcação de sondas. Com o nosso sistema de imagens, encontramos Alexa Fluor 555 (vermelho) para produzir os sinais mais brilhantes, seguidos por Alexa Fluor 488 (verde). Alexa Fluor 647 (vermelho longínquo) tem a desvantagem de que não pode ser detectada pelo olho humano e, portanto, não há sinais pode ser visto quando se olha através do microscópio. Assim, se fazendo FISH duas cores, recomendamos a combinação de corantes vermelhos e verdes.

Podem surgir dois problemas principais: células lavando os slides e sinais fracos. Como as células também aderir ao slide é entr extremamente variáveltipos de células een, eo melhor protocolo para resolver / seed as células precisa ser determinado. Nós utilizamos com sucesso, quer carregados positivamente ou poli-L-lisina lâminas revestidas (comprado pronto a utilizar), mas foram encontradas células geralmente adere melhor à poli-L-lisina lâminas revestidas. Descobrimos também que, quando as células eram muito densas áreas inteiras seria descascar como uma folha, enquanto imagem automatizada foi prejudicada se as células eram muito escassos. Assim, se a amostra não for muito precioso, diferentes números de células deveriam ser semeadas para determinar a densidade ideal. Se as células são particularmente propensas a lavar, uma caneta de barreira hidrofóbica pode ser usado, e os passos de peixe pode ser realizada por pipetagem cuidadosa soluções directamente sobre a lâmina. Pipetagem também reduz drasticamente os volumes de reagentes necessários, mas leva muito mais tempo ao fazer vários slides.

Sinais fracos são geralmente devido a sondas pobres, e vale a pena investir tempo em fazer bons. Limpo DNA CCB deve ser usard como material de partida, que pode ser obtido por precipitação repetida ou kits disponíveis comercialmente. A contaminação com ADN genómico bacteriano afecta negativamente a qualidade da sonda e tratamento cuidadoso durante a lise celular e de filtragem do lisado de células é necessária para mantê-lo a um nível mínimo. É, no entanto, não é necessário usar um passo de digestão com exonuclease de ADN linear, como esta reduz grandemente o rendimento. Rotulagem eficiente da sonda é crucial. O controle de qualidade mais importante para esta etapa é verificar o tamanho do fragmento após a tradução nick (ver resultados representativos). A 'boa' smear quase sempre resultam em uma sonda de cor viva. No entanto, verificou-se que, ocasionalmente, uma certa BAC não pode ser transformado em um bom sonda, e uma TAS diferente deve ser escolhido. Outro passo importante é a desnaturação pelo calor. Se a temperatura for demasiado baixa, o ADN será apenas parcialmente desnaturada e hibridação da sonda será prejudicada. Se a temperatura for demasiado elevada, a estrutura nuclear wivai ser perturbado mais do que o necessário. Nas nossas mãos, 78 ° C sobre um bloco quente invertida é o compromisso ideal, mas isto pode variar, dependendo do respectivo bloco quente utilizado.

Temos tido bons resultados usando meio de montagem Vectashield, mas descobriu que SlowFade Gold tem menos fundo e preserva o sinal fluorescente por mais tempo. Nós não recomendamos o uso de hard-set meio de montagem como descobrimos isso afetar a estrutura 3D e formar bolhas de ar ao longo do tempo.

Em conclusão, brilhantemente fluorescentes directamente sondas marcadas em conjunto com o protocolo de ADN FISH aqui descrito oferecem uma solução eficaz para a análise robusta e rápida da arquitectura nuclear, que é aplicável a uma ampla variedade de questões biológicas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent/Material
NTB buffer			Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
DTT	Invitrogen	D-1532	Step 1.1.1
dNTPs	Bioline	BIO-39025	Step 1.1.1 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Aminoallyl-dUTP	Ambion	AM8439	Step 1.1.1
DNA Polymerase I	New England Biolabs	M02095	Step 1.1.1
DNase I recombinant RNase free	Roche	4716728001	Step 1.1.1
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104	Step 1.1.4, 1.2.3
NaOAc	VWR	27653	Step 1.1.5, Step 2.1.1.2
NaHCO3	Sigma	S5761	Step 1.2.1
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications	Invitrogen (Molecular Probes)	A32750, A32756, A32757	Step 1.2.2
DMSO (anhydrous)	Sigma Aldrich	276855	Step 1.2.2
SYBR Safe DNA gel stain	Life Technologies	S33102	Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide)
Cot-1 DNA	Invitrogen	18440-016	Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well)
Single stranded DNA from salmon testes	Sigma	D7656	Step 2.1.1.1
Deionised formamide	Sigma	F-9037	Step 2.1.1.3 (Health hazard)
Dextran sulphate	Sigma Life Sciences	D8906	Step 2.1.1.4 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
XMP painting probes	MetaSystems	000000-0528-837	Step 2.1.1.4
Poly-L-lysine coated slides	Sigma Aldrich	P0425	Step 2.1.2
Hydrophobic pen (ImmEdge)	Vector Laboratories	H-4000	Step 2.1.2
70 μm sieve (Mouse f–tal liver cells only)	BD Falcon	352350	Step 2.1.2.1
PFA	Sigma Aldrich	P6148	Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Tris-Cl			Step 2.1.3 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Saponin from Quillaja bark	Sigma Aldrich	47036	Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Triton X-100	Sigma	T9284	Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment)
10 x PBS	Life Technologies (GIBCO)	70011-036	Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9,
Glycerol	Fisher Scientific	G/0650	Step 2.1.6
HCl	VWR	20252	Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive)
Formamide	Sigma Aldrich	47670	Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard)
SSC			Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See 'FISH buffers and reaction mixes' list below)
Coverslips 22 x 22	Menzel-Glaser	BB022022A1	Step 2.1.15
Coverslips 22 x 50	Menzel-Glaser	BB022050A1	Step 2.1.15
Rubber cement	Marabu	2901 (10 000)	Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment)
DAPI	Invitrogen Molecular Probes	D3571	Step 2.2.8 (Health hazard)
SlowFade Gold	Invitrogen	S36936	Step 2.2.10 (mounting medium)
Clear nail polish	Any supplier		Step 2.2.10
Equipment
Nanodrop 2000	Thermo Scientific		Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy)
Typhoon FLA 7000 phosphoimager	GE Life Sciences		Step 1.2.4
Coplin jars	Sigma-Aldrich	S6016 (6EA)/S5516 (6EA)	Step 2.1.3 onwards
Liquid nitrogen dewar	Any supplier		Step 2.1.7
Base with Black Lid (light-tight chamber)	Simport	M920-2	Step 2.1.17
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.011	Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room)
Imaging and Image processing
Metafer - Imaging Automation Platform	MetaSystems		automated imaging software
MetaCyte - Automated Interphase FISH analysis	MetaSystems		automated imaging software
Axio Imager Z2 upright	Zeiss		epifluorescence microscope used with automated imaging
IX81 confocal microscope (FV1000)	Olympus		confocal microscope
Bitplane, version 7.3	Imaris		image analysis and 3D modelling software
Scientific volume Imaging, version 4.1	Huygens		image analysis and deconvolution software
FISH buffers and reaction mixes Name Composition Comments 10 x NTB buffer 0.5 M Tris-HCl, pH 7.5 0.05 M MgCl2 0.5 mg/ml BSA dNTP Mix 0.5 mM dGTP Store 50 μl aliquots at -20 °C 0.5 mM dATP 0.5 mM dCTP 0.125 mM dTTP 4 % PFA Weigh 4 g/100 ml PFA in PBS and heat to 62 °C. Adjust pH with NaOH to 7.0 to dissolve remaining PFA. Store 50 ml aliquots at -20 °C, do not re-freeze 2 % saponin solution Dissolve 2 g saponin per 100 ml PBS by extended stirring. Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. Store 5 ml aliquots at -20 °C 20 x SSC Weigh 175.3 g NaCl and 88.2 g sodium citrate and add to 80 ml ddH20 . Dissolve and adjust pH to 7.0 with NaOH. Bring to 1 l with ddH20 and autoclave. Dextran sulphate mix 20 % dextran sulphate in 2 x SSC buffer; Vortex solution and mix on a rocker overnight. Store 500 μl aliquots at -20 °C