Vi beskriver en robust och mångsidig protokoll för analys kärnkraft arkitektur med 3D DNA FISH hjälp direkt märkt fluorescerande prober.
3D DNA FISH har blivit ett viktigt verktyg för att analysera tredimensionella organisationen av kärnan, och flera varianter av tekniken har publicerats. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll som har optimerats för robusthet, reproducerbarhet, och användarvänlighet. Ljust fluorescerande direkt märkta prober genereras genom nick-translation med amino-allyldUTP följt av kemisk koppling av färgämnet. 3D DNA FISH utförs med hjälp av en frys-tö steg för cell permeabilization och en uppvärmning steg för samtidig denaturering av prob och nukleärt DNA. Protokollet är tillämpbar på en rad olika celltyper och en mängd av sönder (BAC, plasmider, fosmids eller hela Paints Kromosom) och tillåter hög genomströmning automatiserad bildbehandling. Med denna metod undersöker vi rutinmässigt nukleär lokalisering av upp till tre kromosomala regioner.
DNA fluorescens in situ hybridisering (DNA FISH) möjliggör tredimensionell visualisering av enskilda genloci, subkromosomal domäner och även hela kromosomer under alla faser av cellcykeln. 2D FISH används för metafas studier medan 3D fiskar har i stor utsträckning använts för att sondera förhållandet mellan den rumsliga organisationen av genomet och dess funktion under interphasen (1,2 och referenser däri). Historiskt sett var co-föreningen studier utförs genom att undersöka tiotals till hundratals enskilda loci vid fisken. Mer nyligen kraftfull hög genomströmning 3C-baserade tekniker såsom 4C och Hi-C har utvecklats 3, vilket tillåter undersökning av molekylär överhörning mellan många tusentals olika lokus. Medan 3C-baserade tekniker och DNA fisk kan komplementära metoder, de inte nödvändigtvis svara på samma frågor. 3C baserade metoderna ger en ensemble avläsning av blandade cellpopulationer, vilket resulterar i en sannolikhet för co-föreningar. I kontrast medan låg genomströmning, fisk tekniker erbjuder möjligheten att analysera rumsliga arrangemang av loci eller kromosomer i enskilda celler enligt deras utvecklingsbehov eller cellcykeln stadier. Därför kommer FISH fortsätta att vara ett viktigt verktyg för att sondera nukleära struktur-funktionssamband.
Det finns två viktiga aspekter i att utföra lyckade 3D fiskar experiment. Dessa är; 1. erhålla optimalt märkta prober och 2. Valet av cellulära behandlingar, inklusive fixering, pre-och post-hybridisering steg, för att bevara kärnmorfologi så mycket som möjligt samtidigt som DNA är tillräckligt tillgänglig för probhybridisering. Effektiv sond märkning är oerhört viktigt för fisk. Traditionellt har nick-translation använts för att införa antingen hapten eller fluoroforen-konjugerade nukleotider 4. Likaså kommersiella nick-översättning kit finns för direkt hapten eller fluoroforen införlivande, but även för två-stegs märkning med aminoallyl nukleotider och amin-reaktiva färgämnen. Det senare gör färgämnet införlivande effektivare genom att DNA-polymeras en mindre skrymmande molekyl att arbeta med. På senare tid har byggsatser för den icke-enzymatiska märkning av DNA utvecklats som utnyttjar koordinerade bindning av platina till nukleinsyror. FISH prober kan även köpas redan märkt 5. Medan kit och kommersiellt tillverkade sonder utan tvekan ge användarvänlighet, är de betydligt dyrare än att köpa de enskilda komponenterna och producera prober i-huset. Vi optimerat en låg kostnad nicktranslation protokoll för att direkt märka många olika BAC sönder i flera färger. Vi upptäckte att erhålla högren BAC DNA är kritisk och resulterar i ett krav på endast 10-20 ng prob per FISH slide, jämfört med 10 – 20 gånger mer när oren mall-DNA används, vilket resulterar i stora kostnads-och tid- sparande. Användningen av amino-allyldUTP tillåter flexibel märkning avprober med tillgängliga amin-reaktiva färgämnen (t.ex. Alexa Fluor eller Cy-färgämnen) eller haptener (t.ex. biotin, digoxigenin). Hapten-märkta prober upptäcks av fluorofor-konjugerade antikroppar eller streptavidin att förstärka och visualisera signalen. Ljusa direkt märkta prober visar generellt mindre bakgrundsfärgning och undvika över-förstärkning av signaler, alltså resulterar i en mer korrekt bild av nukleär lokalisering och locus morfologi.
Det finns flera olika FISK tekniker som använder olika fixativ, pre-behandlingar och post-hybridisering tvättar men dessa generellt delas in i följande kategorier: glutaraldehyd fixering med NaOH denaturering, formaldehyd fixering med HCl denaturering, och formaldehyd fixering med värmedenaturering 6-9 . Alla dessa har fördelar och nackdelar. Glutaraldehyd fixering resulterar i god kärn strukturell konservering, men kräver behandling med reduktionsmedel för att minimeraden resulterande autofluorescensen, och NaOH behandling måste noga kontrolleras för att balansera tillräcklig DNA denaturering och potentiell skada på kärnkraft struktur 6. Formaldehyd fixering är mindre stark, vilket ger en ökad risk för störningar av kärnkraft arkitektur, men även typiskt ger starkare och mer tillförlitliga signaler och lägre autofluorescens 9. HCl behandling depurinates DNA och remsor ut proteiner, som ger god tillgång till DNA för sonderna, men kan också införa DNA-avbrott. Uppvärmning separerar fysiskt de två DNA-strängarna som resulterar i bra mål hybridisering och starka signaler men kan orsaka viss störning av kärnkraft struktur 8. I vilken mån var och en av dessa tekniker påverkar proteinepitoper varierar kraftigt 6,9, vilket resulterar i kravet att experimentellt bestämma för varje protein optimal protokoll som ska användas i immuno-FISH experiment.
Det finns ingen "perfekt" DNA FISH technique, kan de alla vara användbart om välkontrollerad. Vårt mål var att optimera ett protokoll för robust och reproducerbar DNA FISH att undersöka rumsliga placeringen av flera loci i en mängd olika celltyper 10, med fokus på uppvärmning metod för mest pålitliga signaler. Med denna och användning av ett automatiserat avbildningssystem vi syftade till att öka genomströmningen för en enda cell analys av nukleära arrangemang.
3D DNA FISH har blivit en allmänt erkänd verktyg för att analysera rumsliga arrangemang i kärnan. Även fisk ger visuella och direkta resultat, som med varje teknik, måste man vara medveten om sina begränsningar. DNA FISH står det inneboende problemet att relativt hårda behandlingar behövs för att göra kromatin tillgänglig för fisk sonder som slutligen stör kärnkraft struktur-just det som ska analyseras. Flera strategier har eftersträvas att jonglera tillgänglighet och struktur bevaras. I det protokoll som beskrivs här, är kromosomal DNA görs tillgänglig genom frysning-tining permeabilization av celler och värmedenaturering före probhybridisering. Solovei, et al., (2002) analyserade strukturella förändringar efter liknande behandling och fann att den genomsnittliga förskjutningen av kromatin domäner var 300 nm, vilket begränsar upplösningen av strukturell analys att cirka 1 Mb regioner i genomet 8. Även om detta inte hög upplösning, detär en rimlig nivå för att analysera kärnkraft position.
En mer praktisk fråga för FISH analys är att bilden förvärv och mätningar av nukleära avstånden är tidskrävande processer som begränsar antalet kärnor som kan analyseras. För att studera ovanliga händelser vi siktade på att göra hög genomströmning automatiserad bildbehandling. Sedan, med lämpliga kontroller på plats, kan tillräckligt antal jämföras för att möjliggöra robust statistisk analys av rumsliga relationer. Vi analyserar rutinmässigt 600 kärnor per datapunkt som vi bestämmer 3D-koordinaterna av all fisk signaler inom det nukleära volymen. Dessa uppgifter kräver mycket lite utrymme och möjliggör analys av inter-och intra-allel avstånd eller radiella positioner vid någon senare tidpunkt. Dessutom kan automatiserad behandling ske i en forskare blint sätt som i hög grad minskar sannolikheten för omedvetna fördomar.
För att möjliggöra denna typ av hög genomströmning analysär, var vårt mål att skapa ett snabbt och effektivt sätt att utföra DNA-FISH. Vi hittade det protokoll som beskrivs här för att vara extremt robust, konsekvent producerar ljusa signaler med låg bakgrund. Det fungerade för alla celltyper vi försökt förutsatt att vi anpassat steget att fästa cellerna till bilden. Dessutom, med ett undantag, kunde alla BAC vi använt vändas till ljusa sonder. Vi har också framgångsrikt upptäckt ett antal nukleära proteiner genom antikroppsfärgning efter DNA-FISH. Även för vissa proteiner detta fungerar bra, rekommenderar vi jämförelse med traditionella immunofluorescens (IF) för att säkerställa konsekvens av antikroppen färgningsmönstret mellan IF och DNA immuno FISH (jämför 11).
Generellt fann vi att prober märkta i olika färger gav samma resultat. Dock bör följande aspekter beaktas när man väljer märkning färgämnet. Först måste färgen av fluoroforen vara väl detekterbar genom mikroskopet used. Andra bör våglängden hos det ljus som avges av fluoroforer vara tillräckligt olika för att undvika blöda igenom till den andra kanalen. Detta kommer att bero på filtren i mikroskopet. Och för det tredje, åtminstone i våra händer, vissa färger ger ljusa signaler mer konsekvent än andra. Vi har alltid använt DAPI (blå) som en motfärg som gör Alexa Fluor 555 (röd), 488 (grön), och 647 (långt rött) bra val för märkning av prober. Med vårt avbildar systemet, fann vi Alexa Fluor 555 (röd) för att producera de ljusaste signaler, följt av Alexa Fluor 488 (grön). Alexa Fluor 647 (långt rött) har den nackdelen att den inte kan upptäckas av det mänskliga ögat, och därför inga signaler kan ses när man tittar ner i mikroskopet. Således, om gör tvåfärgad FISK, rekommenderar vi en kombination av röda och gröna färger.
Två huvudsakliga problem kan uppstå: celler tvätta bort bilderna och svaga signaler. Hur väl celler följer bilden är enormt varierande between celltyper, och det bästa protokollet för att lösa / frö cellerna måste fastställas. Vi har framgångsrikt användas antingen positivt laddad eller poly-L-lysinbelagda objektglas (köpta färdig att använda), men fann celler i allmänhet vidhäftade bättre att poly-L-lysinbelagda objektglas. Vi fann också att när celler var alltför täta hela områden skulle lossna som ett ark, medan automatiserad bildbehandling hämmades om cellerna var alltför gles. Således, om provet inte är alltför dyrbar, bör olika cellantal seedas att bestämma den ideala densiteten. Om celler är särskilt benägna att tvätta bort, kan en hydrofob barriär penna användas och fisk stegen kan utföras genom att försiktigt pipettera lösningar direkt på bilden. Pipettering också drastiskt minskar volymerna av nödvändiga reagenser, men tar betydligt längre tid när man gör flera bilder.
Svaga signaler är oftast på grund av dåliga sönder, och det är väl värt att investera tid på att göra bra. Clean BAC-DNA bör användad som utgångsmaterial, som kan erhållas genom upprepad utfällning eller kommersiellt tillgängliga kit. Förorening med bakterie-DNA påverkar negativt sond kvalitet och noggrann hantering under cellysering och filtrering av cellysatet är skyldig att hålla det till ett minimum. Det är emellertid inte nödvändigt att använda ett exonukleas steg att smälta linjärt DNA, eftersom detta i hög grad reducerar utbyte. Effektiv märkning av sonden är avgörande. Den viktigaste kvalitetskontrollen för detta steg är att kontrollera fragment storlek efter nicktranslation (se Representativa resultat). En "bra" smeta kommer nästan alltid att resultera i en färgglad sond. Vi har emellertid funnit att ibland en viss BAC inte kan bearbetas till en bra sond, och en annan BAC måste väljas. Ett annat viktigt steg är värmedenaturering. Om temperaturen är för låg, kommer DNA vara endast delvis denatureras och probhybridisering risk för skada. Om temperaturen är för hög, kärn struktur will störas mer än nödvändigt. I våra händer, är 78 ° C på en inverterad varma blocket den idealiska kompromissen, men detta kan variera beroende på respektive använd varma blocket.
Vi har haft bra resultat med Vectashield monteringsmedium, men fann att SlowFade Gold har mindre bakgrund och bevarar den fluorescerande signalen längre. Vi rekommenderar inte användning av hård-set montage mediet som vi funnit att påverka 3D-struktur och att bilda luftbubblor över tiden.
Sammanfattningsvis ljust fluorescerande direkt märkta prober tillsammans med DNA-FISH protokoll som beskrivs här erbjuda en effektiv lösning för robust och snabb analys av kärn-arkitektur, som är tillämplig på en mängd olika biologiska frågeställningar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av BBSRC och Wellcome Trust. Vi vill tacka Simon Walker för hjälp med bildbehandling och Felix Krueger för hjälp med bioinformatiska analyser.
Reagent/Material | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NTB buffer | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DTT | Invitrogen | D-1532 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
dNTPs | Bioline | BIO-39025 | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aminoallyl-dUTP | Ambion | AM8439 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNA Polymerase I | New England Biolabs | M02095 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I recombinant RNase free | Roche | 4716728001 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Step 1.1.4, 1.2.3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaOAc | VWR | 27653 | Step 1.1.5, Step 2.1.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Step 1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications | Invitrogen (Molecular Probes) | A32750, A32756, A32757 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMSO (anhydrous) | Sigma Aldrich | 276855 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma | D7656 | Step 2.1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deionized formamide | Sigma | F-9037 | Step 2.1.1.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dextran sulphate | Sigma Life Sciences | D8906 | Step 2.1.1.4 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
XMP painting probes | MetaSystems | 000000-0528-837 | Step 2.1.1.4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Poly-L-lysine coated slides | Sigma Aldrich | P0425 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hydrophobic pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
70 μm sieve (Mouse fetal liver cells only) | BD Falcon | 352350 | Step 2.1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PFA | Sigma Aldrich | P6148 | Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Tris-Cl | Step 2.1.3 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Saponin from Quillaja bark | Sigma Aldrich | 47036 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Sigma | T9284 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
10 x PBS | Life Technologies (GIBCO) | 70011-036 | Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glycerol | Fisher Scientific | G/0650 | Step 2.1.6 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HCl | VWR | 20252 | Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Formamide | Sigma Aldrich | 47670 | Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SSC | Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 22 | Menzel-Glaser | BB022022A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 50 | Menzel-Glaser | BB022050A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rubber cement | Marabu | 2901 (10 000) | Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DAPI | Invitrogen Molecular Probes | D3571 | Step 2.2.8 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | Step 2.2.10 (mounting medium) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Clear nail polish | Any supplier | Step 2.2.10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Typhoon FLA 7000 phosphoimager | GE Life Sciences | Step 1.2.4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coplin jars | Sigma-Aldrich | S6016 (6EA)/S5516 (6EA) | Step 2.1.3 onwards | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Liquid nitrogen dewar | Any supplier | Step 2.1.7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Base with Black Lid (light-tight chamber) | Simport | M920-2 | Step 2.1.17 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Imaging and Image processing | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafer – Imaging Automation Platform | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MetaCyte – Automated Interphase FISH analysis | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Axio Imager Z2 upright | Zeiss | epifluorescence microscope used with automated imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
IX81 confocal microscope (FV1000) | Olympus | confocal microscope | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bitplane, version 7.3 | Imaris | image analysis and 3D modeling software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Scientific volume Imaging, version 4.1 | Huygens | image analysis and deconvolution software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
FISH buffers and reaction mixes
|