हम GPCRs में विभिन्न लक्षित पदों पर अप्राकृतिक अमीनो एसिड, पी azido-एल फेनिलएलनिन आनुवंशिक रूप से सांकेतिक शब्दों में बदलना और विभिन्न अनुप्रयोगों में azido समूह की बहुमुखी प्रतिभा दिखा. ये एक एक GPCR के ligand बाध्यकारी जेब में अवशेषों की पहचान करने के लिए लक्षित photocrosslinking प्रौद्योगिकी, और एक पेप्टाइड मिलान टैग या फ्लोरोसेंट जांच के साथ GPCRs की साइट विशेष bioorthogonal संशोधन शामिल हैं.
परिसर संकेत जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCR) की संरचनात्मक और गतिशील पढ़ाई की सुविधा, नए तरीकों रिसेप्टर समारोह उपद्रव नहीं है कि व्यक्त रिसेप्टर्स में जानकारीपूर्ण जांच या लेबल शुरू करने की आवश्यकता है. हम आनुवंशिक रूप से सांकेतिक शब्दों में बदलना करने के लिए एम्बर कोडोन दमन तकनीक का इस्तेमाल किया अप्राकृतिक अमीनो एसिड, heterologously स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त GPCRs में विभिन्न लक्षित पदों पर पी azido-एल फेनिलएलनिन (azF). azido समूह की बहुमुखी प्रतिभा के लिए अपनी मूल सेलुलर वातावरण में या डिटर्जेंट solubilized परिस्थितियों में GPCRs अध्ययन करने के लिए विभिन्न अनुप्रयोगों में यहाँ सचित्र है. सबसे पहले, हम एक ट्रिटियम लेबल छोटे अणु ligand एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग azido अमीनो एसिड के लिए Crosslinked है जहां GPCR के ligand बाध्यकारी जेब में अवशेषों की पहचान करने के लिए एक सेल आधारित लक्षित photocrosslinking प्रौद्योगिकी का प्रदर्शन. हम तो bioorthogonal STAUDINGER-Bertozzi बंधाव reac द्वारा GPCRs की साइट विशेष संशोधन का प्रदर्शनphosphine डेरिवेटिव का उपयोग azido समूह है कि लक्ष्य tion. हम एक पूरे सेल आधारित एलिसा दृष्टिकोण का उपयोग में संस्कृति और अपनी पहचान व्यक्त झिल्ली प्रोटीन के लक्षित पेप्टाइड मिलान टैगिंग के लिए एक सामान्य रणनीति पर चर्चा की. अंत में, हम azF-GPCRs चुनिंदा फ्लोरोसेंट जांच के साथ टैग किया जा सकता है. वे सिद्धांत रूप में सक्रिय संकेतन परिसर पूछताछ करने GPCR व्यक्त किसी में किसी भी अमीनो एसिड की स्थिति के लिए लागू किया जा सकता है कि में चर्चा के तरीके में, सामान्य हैं.
Heptahelical जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) महत्वपूर्ण और विविध बाह्य संकेत मध्यस्थता कि अत्यधिक गतिशील झिल्ली प्रोटीन का एक superfamily शामिल. शास्त्रीय प्रतिमान में, रिसेप्टर सक्रियण ligand प्रेरित गठनात्मक परिवर्तन के साथ युग्मित है. 1, GPCRs की संरचनात्मक जीव विज्ञान में 2 हाल की प्रगति transmembrane संकेतन के आणविक तंत्र पर महत्वपूर्ण जानकारी उपलब्ध कराई है. 3-5 हालांकि, अधिक से अधिक रासायनिक परिशुद्धता के साथ समझने के लिए कार्यात्मक तंत्र और GPCR संकेतन की संरचनात्मक गतिशीलता, दृष्टिकोण की एक टूलकिट सक्रिय संकेतन परिसर से पूछताछ करने के लिए जानकारीपूर्ण आणविक और रासायनिक जांच को शामिल करने की आवश्यकता है.
यह अंत करने के लिए, हम साइट विशेष रूप से पहले से Schultz और सी ने बीड़ा उठाया दमन प्रौद्योगिकी कोडोन एम्बर का उपयोग कर अप्राकृतिक अमीनो एसिड (UAA) mutagenesis के आधार पर व्यक्त रिसेप्टर्स में गैर या न्यूनतम perturbing जांच शुरू करने की एक विधि अनुकूलितoworkers. 6 हम जैसे स्तनधारी कोशिकाओं की तुलना में अन्य अधिकांश heterologous प्रणालियों में व्यक्त करना मुश्किल है जो GPCRs, के रूप में प्रोटीन के लिए एक उच्च उपज अभिव्यक्ति और mutagenesis प्रणाली को प्राप्त करने के लिए UAA mutagenesis पद्धति को अनुकूलित. एक orthogonal इंजीनियर शमन tRNA का उपयोग करना और एक विशिष्ट UAA के लिए अमीनोएसिल-tRNA synthetase जोड़ी विकसित, हम साइट विशेष रूप से व्यक्त लक्ष्य GPCRs में UAAs की शुरुआत की. UAAs का सफल समावेश, P-Acetyl-एल फेनिलएलनिन (ए सी एफ), पी benzoyl एल फेनिलएलनिन (BZF), और पी azido-एल फेनिलएलनिन (azF) हमारे मॉडल GPCRs में प्रदर्शित किया गया है – rhodopsin और मानव सीसी केमोकाइन रिसेप्टर, CCR5. 7, 8
सिद्धांत रूप में, एक UAA आनुवंशिक रूप से प्रोटीन अनुक्रम के भीतर किसी भी स्थिति में इनकोड किया जा सकता है और यह एक लक्ष्य GPCR के एकल कोडोन स्कैनिंग सक्षम बनाता है के रूप में यह संपत्ति एक अमूल्य जैव रासायनिक उपकरण है. हम एक प्रतिक्रियाशील Azi है जो UAA, azF, की चंचलता पर विशेष रूप से यहां ध्यान केंद्रितआधा भाग कर. 9 azF भी पड़ोसी प्राथमिक amines या स्निग्ध hydrogens साथ प्रतिक्रिया द्वारा एक photoactivatable पार linker के रूप में काम कर सकते हैं एक अद्वितीय अवरक्त (आईआर) की जांच, 8, के रूप में सेवा करने के अलावा. इसके अतिरिक्त, जैविक रूप से अक्रिय azido समूह bioorthogonal लेबलिंग प्रतिक्रियाओं में एक चयनात्मक रसायन के संभाल के रूप में भाग ले सकते हैं. यहाँ हम इस तरह के जाल को लक्षित photocrosslinking एक रिसेप्टर ligand जटिल है, और bioorthogonal मिलान टैगिंग और फ्लोरोसेंट लेबलिंग रणनीतियों से GPCRs के संशोधन के रूप में GPCRs, में azF की साइट विशेष समावेश की उपयोगी अनुप्रयोगों illustrating उदाहरण प्रस्तुत करते हैं.
Photoactivatable अभिकर्मकों 1960 के दशक के बाद से जैविक प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस अवधि में 10, रिसेप्टर ligand crosslinking प्रयोगों की एक बहुतायत GPCR परिसरों का अध्ययन करने के लिए सूचित किया गया है, जिनमें से अधिकांश photoaffinity ligands के उपयोग को शामिल किया. 11, 12 हालांकि, इन वे requir के रूप में आवेदन तकनीकी रूप से, सीमित हैंएक crosslinking समूह असर ligands की ई संश्लेषण. 13-15 इसके अलावा, ligand में crosslinker आधा भाग के साथ, यह GPCR पर Crosslink के स्थान की पहचान करने के लिए चुनौतीपूर्ण है. साइट विशेष रूप से दमन प्रौद्योगिकी कोडोन एम्बर का उपयोग प्रोटीन में UAAs रूप photocrosslinking समूहों को शुरू करने के लिए एक मूल्यवान प्रगति है. 16, 17 हम में एक रिसेप्टर ligand जटिल के गठन में शामिल है कि एक रिसेप्टर पर बाध्यकारी इंटरफेस की पहचान करने के लिए एक photocrosslinking तकनीक विकसित की GPCRs में photolabile समूहों को शुरू करने से कोशिकाओं रहते हैं. 18, 19 यहाँ हम एक छोटे अणु ligand के बंधन स्थल, CCR5 पर tritiated maraviroc, की पहचान करने के लिए इस लक्षित photocrosslinking प्रौद्योगिकी को लागू करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल और डेटा विश्लेषण की विधि का वर्णन. इस विधि ligand की देशी रासायनिक संरचना को बनाए रखने के अलावा ligand पर रेडियोधर्मी संभाल, की सटीक मात्रा का ठहराव पर capitalizes.
प्रतिदीप्ति आधारित तकनीक सीधे रिसेप्टर के गठनात्मक राज्य द्वारा जांच भी रिसेप्टर सक्रियण की संरचनात्मक आधार की सटीक समझ समर्थन करते हैं. 20 21 बहरहाल, GPCRs में फ्लोरोसेंट लेबल पेश करने लचीलापन रखने तकनीकों साइट विशेष रूप से सीमित कर रहे हैं. हम GPCR संकेत परिसरों की एकल अणु का पता लगाने (एसएमडी) की सुविधा के लिए bioorthogonal रासायनिक संशोधन रणनीति को रोजगार में रुचि रखते हैं. 22 azido समूह ऐसे STAUDINGER-Bertozzi बंधाव, 23, 24 तांबे से मुक्त तनाव पदोन्नत azide के रूप bioorthogonal chemistries में भाग ले सकते हैं alkyne cycloaddition (SpAAC) 25 और तांबे उत्प्रेरित azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). 26 हम एक azide और एक phosphine के बीच विशेष प्रतिक्रिया शामिल है कि STAUDINGER-Bertozzi बंधाव प्रतिक्रिया पर यहाँ ध्यान केंद्रित. हम एक पेप्टाइड मिलान (फ्लैग पेप्टाइड) या एक फ्लोरोसेंट लेबल संयुग्मित दो अलग phosphine डेरिवेटिव, के उपयोग के प्रदर्शनGPCRs की साइट विशिष्ट संशोधन प्राप्त करने के लिए (fluorescein).
हम पहले से अवगत कराया विलायक हैं कि लक्षित साइटों का चयन करने के लिए एक्स – रे क्रिस्टल संरचना और गतिशील सिमुलेशन का उपयोग azF वेरिएंट rhodopsin की साइट विशेष लेबलिंग के लिए शर्तें अनुकूलित. 27, 28 हम भी पृष्ठभूमि से मुक्त लेबलिंग प्राप्त करने के लिए व्यवहार्यता सचित्र STAUDINGER- Bertozzi बंधाव. 29 हम यहाँ एक क्रोमैटोग्राफी मैट्रिक्स पर स्थिर है और बाद में जेल प्रतिदीप्ति द्वारा कल्पना है कि एक डिटर्जेंट solubilized रिसेप्टर के फ्लोरोसेंट लेबलिंग को प्राप्त करने के लिए नियोजित सामान्य प्रक्रिया का प्रदर्शन. इसके अतिरिक्त, हमने अज्ञात संरचना, CCR5 के एक रिसेप्टर पर लेबलिंग करने के लिए उत्तरदायी पदों की पहचान करने के लिए इस लेबलिंग रणनीति पर एक उपयोगी एक्सटेंशन प्रदर्शित करता है. इस azF-GPCR एक सेल आधारित अर्द्ध उच्च throughput प्रारूप में वेरिएंट की bioorthogonal संशोधन पर निर्भर करता है कि एक लक्षित पेप्टाइड मिलान टैगिंग रणनीति का प्रयोग किया जाता है. 30 यहविधि लेबलिंग की घटनाओं पर नजर रखने के लिए एक सेल सतह एलिसा की बहु कदम का पता लगाने के गुणों का लाभ उठाते.
हम यहां चर्चा के तरीके में सामान्य हैं और सिद्धांत में दमन प्रौद्योगिकी कोडोन एम्बर का उपयोग azF के साथ शामिल किसी भी GPCR के लिए लागू किया जा सकता है. हम विस्तार GPCRs की संरचनात्मक और गतिशील अध्ययन की सुविधा के लिए अप्राकृतिक अमीनो एसिड mutagenesis के विधि और उनके बाद अनुप्रयोगों का उपयोग कर ऐसे azF रूप UAAs के साथ शामिल रिसेप्टर्स की स्तनधारी सेल अभिव्यक्ति में शामिल कदम यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में.
हम GPCRs में, एक प्रतिक्रियाशील जांच, azF की साइट विशिष्ट शामिल करने के लिए यहाँ एक मजबूत कार्यप्रणाली का वर्णन है और GPCRs की संरचना और गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए इस उपकरण का तीन उपयोगी अनुप्रयोगों प्रदर्श?…
The authors have nothing to disclose.
हम कई नींव और परोपकारी दाताओं की उदार सहायता (SakmarLab.org देखें) धन्यवाद.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Plasmid pSVB. Yam | (Ye et al., 2008) | ||
Plasmid pcDNA.RS for azF | (Ye et al., 2009) | ||
Plasmids pMT4.Rho and pcDNA 3.1.CCR5 | Optionally contain the amber stop codon (TAG) at a desired position | ||
HEK 293T cells | Adherent cells | ||
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco | 10566 | |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14200 | |
Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
Lipofectamine Plus | Invitrogen | Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015 |
|
p-azido-L-phenylalanine | Chem-Impex International | 6162 | |
Table 1. Site-specific genetic incorporation of unnatural amino acids into GPCRs materials | |||
[header] | |||
Maxima ML-3500S UV-A lamp | Spectronics Corporation | azF is activated by 365-nm light | |
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14065 | |
HEPES | Irvine Scientific | 9319 | |
Bovine serum albumin | Roche | 3117405001 | |
Tritium-labeled ligand | From collaborator (Grunbeck et al., 2012) | ||
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166 | |
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
Trans-Blot SD apparatus | Biorad | Apparatus for semi-dry transfer | |
Immobilon polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Millipore | IPVH00010 | |
Non-fat powered milk | Fisher Scientific | NC9934262 | |
Tween-20 | Aldrich | 274348 | |
Ecoscint A | National Diagnostics | LS-273 | Scintillation fluid |
Scintillation vials | Fisher Scientific | 333726 | |
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillation Counter | Perkin Elmer | Beta-Scintillation counter | |
Anti-rhodopsin 1D4 mAb | National Cell Culture Center | custom | |
Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-mouse IgG | KPL, Inc. | 474-1806 | |
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34080 | |
Hyblot CL AR film | Denville | E3018 | |
Table 2. Targeted photocrosslinking materials | |||
[header] | |||
0.25% Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
FLAG-triarylphosphine | Sigma | GPHOS1 | |
M2 FLAG mAb | Sigma | F1804 | |
anti-CCR5 2D7 mAb | BD Biosciences | 555990 | |
Poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
96-well plate | Costar | 3601 | Clear bottom, high binding EIA/RIA |
Phosphate Buffered Saline (Calcium, Magnesium) | Gibco | 14040 | |
16% Paraformaldehyde | EMS | 28908 | |
HRP-conjugated | KPL, Inc. | 474-1516 | |
anti-rabbit IgG | KPL, Inc. | 474-1516 | |
Amplex Red | Invitrogen | A12222 | |
Hydrogen peroxide | DE Healthcare Products | 97-93399 | |
CytoFluor II fluorescence multi-well plate reader | Perseptive Biosystems | ||
Table 3. Targeted peptide-epitope tagging and cell surface ELISA materials | |||
[header] | |||
Fluorescein-phosphine | (Huber et al., submitted 2012) | ||
Nonapeptide (C9 peptide) | AnaSpec | 62190 | Peptide mimicking the 1D4-epitope NH2-TETSQVAPA-COOH |
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside | Anatrace | D310LA | |
1D4-sepharose resin | 1D4 mAb immobilized on CNBr-activated sepharose 2B resin | ||
NuPAGE Novex 4 – 12% SDS gels | Invitrogen | NP0322BOX | SDS-PAGE performed on NuPAGE apparatus |
Confocal Typhoon 9400 fluorescence scanner | GE Healthcare | discontinued | Scanner with 488-nm wavelength laser |
Table 4. Fluorescent labeling materials |