Сотрудничество между активированной онкоген как РАН V12 и мутациями в генах клеточной полярности, как написал, приведет к росту опухоли у дрозофилы, когда опухолевые клетки также отображать инвазивных поведения. Вот простой протокол для индукции и наблюдения за доброкачественных и инвазивных опухолей представлена.
Drosophila осветил наше понимание генетической основы нормального развития и заболевания в течение последних нескольких десятилетий, и сегодня он продолжает вносят огромный вклад в наше понимание сложных заболеваний 1-7. Прогрессирование опухоли из доброкачественной в метастатической государства является комплексное мероприятие 8 и был смоделирован у дрозофилы, чтобы помочь нам лучше понять генетическую основу этого заболевания 9. Здесь я представляю простой протокол к генетически индуцировать, наблюдать, а затем анализировать прогрессирование опухолей у личинок дрозофилы. Метод индукции опухолей основана на системе MARCM 10 и использует взаимодействие между активированного онкогена, Рас-V12 и потери генов клеточной полярности (исписанной, диски большой и летальный гигантский личинок) для генерации инвазивных опухолей 9. Я продемонстрировать, как эти опухоли могут быть визуализированы в неповрежденной личинок ито как они могут быть вырезали для дальнейшего анализа. Упрощенная Протокол, представленные здесь, должны сделать возможным для эта техника, которые будут использоваться исследователями, заинтересованных в понимании роли гена в опухолевой инвазии.
Прогрессирование опухоли из доброкачественной в метастатической государства является шагом мудрый процесс, который характеризуется уклонение от защитных механизмов в организме 8. Например опухолевые клетки в организме должны быть в состоянии уйти от апоптоза и иммунную систему, прорыв специализированный внеклеточный матрикс (ECM) под названием базальной мембраны, и преодолеть любые социального контроля, введенные окружающих клеток 8. Именно через шаг мудрого прогрессии, что раковые клетки приобретают способность к миграции и колонизации отдаленных объектов в процессе, называемом метастазы. Наше понимание того, как опухолевая клетка преодолевает барьеры, введенные тела все еще находится в зачаточном состоянии, однако, складывающаяся картина из исследований, проведенных до сих пор указывает на повторном использовании нормальных процессов развития и сигнальных путей по раковых клеток 11-13.
Плодовая муха дрозофилы имеет вносит огромный вклад в нашу ундerstanding нормального развития и болезни за счет использования сложных генетических методов, разработанных в течение последних нескольких десятилетий 14-17. Использование мутагенеза а избыточная экспрессия инструменты мы пришли к лучшему пониманию различных онкогенов и генов-супрессоров опухолей 18-22. Тем не менее, метастазирование опухолей является результатом сотрудничества между несколькими генетических поражений, которые были изучены в первую очередь в клеточных моделях культуры 23,24, а также различные ксенотрансплантата моделей 25-27. Эти модели, хотя мощный имеют свои ограничения, поскольку они не имитировать полностью условиям, имеющимся в живом организме. Кроме того, трансгенные модели доступны у мышей являются громоздкими и не способствует генетического анализа инвазивного поведения 28,29. Несколько исследований пытались понять вторжение опухолевых клеток у дрозофилы 30,31. Эти методы в основном используют трансплантацию первичных опухолей к хостам а затем полагаться на отслеживание траnsplanted опухоли за вторжение в соседние ткани 32,33. Мощная техника называется MARCM 10 была адаптирована Pagliarini и Сюй моделировать опухолевой инвазии у дрозофилы 9. Этот элегантный генетическая моделирование опухолевой инвазии эксплуатировали сотрудничества между активированной онкоген и потери клеточной полярности. Мощность этого моделирования заключается в том, что инвазивных опухолей создаются в здоровом организме, таким образом, обход необходимость трансплантации тканей. Чтобы добиться онкогенного сотрудничества, активированный онкоген как Рас V12 выражается в клонов клеток в личиночной глаз-усиков диска. В результате технике MARCM эти клоны также отмечены зеленого флуоресцентного белка (GFP) для легкой визуализации и сделаны гомозиготных по клеточной полярности мутантов, как летальной гигантских личинок, пометки и дисков больших. В результате GFP помечены инвазивных опухолей в головной комплекс. В этом докладе япродемонстрировать, как вызвать, и визуализировать эти инвазивных опухолей как в контексте интактного личинок и в вырезали головной комплекса. Индукционная опухоль, представленная здесь использует реагенты на втором хромосомы дрозофилы. В таблице 2 я приведу листинг акций на X и 3-м хромосом, которые могут быть использованы для тех же целей. Я считаю, что это упрощенный протокол сделает этот метод легко доступны для исследователей, заинтересованных в понимании молекулярных основ опухолевой прогрессии.
Рак является сложным заболеванием с гораздо лучшего понимания сегодня, чем в прошлом. Тем не менее, многое еще предстоит узнать и объяснил прежде чем мы имеем полную картину основных механизмов. Простой протокол, представленные здесь делает возможным генетически вызывать доброкачест?…
The authors have nothing to disclose.
Исследования в моей лаборатории поддерживается WKU кафедры биологии запуска средств, WKU исследовательский фонд RCAP-Я допускаю # 11-8032 и грантом KBRIN-ЗОНА финансируется за счет родительского грант от Национального Института общей медицинских наук Национального института здравоохранения под награда числа 5P20GM103436-13. Я также хотел бы выразить признательность доктору Тянь Сю в лаборатории которого я познакомился с этой техникой и д-р Раймонд Pagliarini который первым установленном эту технику в лаборатории Сюй.
10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
Chilled 1X PBS pH7.2 working solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | Make fresh and refrigerate, can be used up to a week | |
Flynap | Carolina Biologicals | Fly anesthesia needed to anesthetize larvae | |
Fixative | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde | Needed to fix the dissected cephalic complex | |
Ice Bucket | Several | Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube | |
1.7ml Eppendorf tube | Various | ||
Glass slides, cover glass | Fisher Scientific | ||
Vectashield Mounting Media or any other mounting media | Vector Laboratories | ||
Halocarbon 200 or 700 Oil | Polysciences Inc. or Halocarbon.com | Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope | |
Sally Hansen “Hard as Nails” nail polish | Can be found at any general merchandise store | Needed to seal the edges of Coverslip | |
A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope | Leica and others | Needed to observe the GFP fluorescence in larvae | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | ||
Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish | Sigma Aldrich | ||
Paint Brush | Can be found at any general merchandise store | ||
Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article. |