Cooperação entre um oncogene ativado como RAS V12 e mutações em genes de polaridade celular como íntima, resultar em crescimento do tumor em Drosophila, onde as células tumorais também exibem comportamentos invasivos. Aqui, um protocolo simples para a indução e observação dos tumores benignos e invasoras é apresentado.
Drosophila tem iluminado o nosso entendimento da base genética do desenvolvimento normal e da doença para as últimas décadas e hoje continua a contribuir imensamente para a nossa compreensão de doenças complexas 1-7. Progressão de tumores benignos de um para um estado metastático é um evento complexo 8 e foi modelado em Drosophila para nos ajudar a entender melhor a base genética da doença 9. Aqui eu apresento um protocolo simples para induzir geneticamente, observar e, em seguida, analisar a progressão de tumores em larvas de Drosophila. A técnica de indução de tumores baseia-se no sistema MARCM 10 e explora a cooperação entre um oncogene activado, Ras V12 e perda dos genes de polaridade celular (íntima, discos larvas grandes e letal gigante) para gerar tumores invasivos 9. I demonstram como esses tumores podem ser visualizados no larvas intacta eentão como estes podem ser dissecados para análise posterior. O protocolo simplificado aqui apresentados devem tornar possível que esta técnica para ser utilizado pelos investigadores interessados na compreensão da função de um gene na invasão tumoral.
Progressão de tumores benignos de um para um estado metastático é um processo de passo sábio que é caracterizada por a evasão de mecanismos de protecção presentes no corpo 8. Por exemplo células tumorais no corpo deve ser capaz de evitar a apoptose e do sistema imunológico, avanço da matriz extracelular especializada (ECM) chamado Membrana Basal, e superar todos os controles sociais impostas pelas células vizinhas 8. É através de uma progressão sábio passo que as células cancerosas adquirem a capacidade de migrar e colonizar locais distantes em um processo chamado metástase. A nossa compreensão de como a célula tumoral supera as barreiras impostas pelo órgão ainda está em sua infância, no entanto, a imagem que emerge da pesquisa feita pontos, até agora, a um uso repetido de processos normais de desenvolvimento e vias de sinalização pelas células cancerosas 11-13.
A mosca da fruta Drosophila melanogaster tem contribuído enormemente para a nossa understanding do desenvolvimento normal e doença através do uso de técnicas genéticas sofisticadas desenvolvidas ao longo das últimas décadas 14-17. Usando mutagênese e ferramentas superexpressão Chegamos a uma melhor compreensão de vários oncogenes e genes supressores de tumor 18-22. No entanto, a metástase tumoral é um resultado de uma cooperação entre várias lesões genéticas que tem sido estudado principalmente em modelos de cultura de células 23,24, bem como vários modelos de xenotransplante de 25-27. Estes modelos porém poderoso têm suas limitações, pois não reproduzem inteiramente as condições encontradas em um organismo vivo. Além disso, os modelos transgênicos disponíveis em ratos são pesados e não contribuem para a análise genética de comportamento invasivo 28,29. Vários estudos têm tentado compreender a invasão das células tumorais em Drosophila 30,31. Estas técnicas utilizam principalmente transplante de tumores primários para anfitriões e, em seguida, contar com acompanhamento do tratumores nsplanted por invasão de tecidos vizinhos 32,33. Uma poderosa técnica chamada MARCM 10 foi adaptada por Pagliarini e Xu modelar invasão tumoral em Drosophila 9. Esta modelação genética elegante de invasão tumoral explorada a cooperação entre um oncogene activado e a perda da polaridade celular. O poder deste modelagem situa-se no facto de que os tumores invasivos são criados num organismo intacto contornando assim a necessidade de transplante de tecidos. Para provocar a cooperação oncogénica, um oncogene activado como Ras V12 é expressa em clones de células no disco olho-antenais de larvas. Como um resultado da técnica MARCM estes clones também foram marcados com a proteína verde fluorescente (GFP) para facilitar a visualização e são feitas homozigotos para mutantes de polaridade celular como larvas letal gigante, íntima, e discos grandes. O resultado é GFP marcado tumores invasivos no complexo cefálica. Neste relatório eudemonstrar como para induzir, e visualizar estes tumores invasivos, tanto no âmbito de um larvas intacta e em dissecados complexo cefálica. A indução de tumores aqui apresentada utiliza os reagentes no segundo cromossoma de Drosophila. Na Tabela 2, que fornecem um perfil de existências em X e 3 rd cromossomas que podem ser utilizados para o mesmo fim. Acredito que este protocolo simplificado vai fazer esta técnica de fácil acesso para pesquisadores interessados em compreender a base molecular da progressão do tumor.
O cancro é uma doença complexa, com uma muito melhor compreensão hoje do que no passado. No entanto, ainda há muito a ser aprendido e explicou, antes de ter um quadro completo dos mecanismos subjacentes. O protocolo simples aqui apresentada torna possível induzir geneticamente tumores benignos e invasivos num organismo inteiro e depois estudar a biologia associada com a progressão de tumores neste modelo. A maioria das técnicas existentes em Drosophila e outros organismos ou utilizar um sistema de cultur…
The authors have nothing to disclose.
A pesquisa em meu laboratório é apoiado pelo Departamento WKU de fundos de arranque Biologia, WKU Research Foundation RCAP-I conceder # 11-8032 e por uma concessão KBRIN-AREA financiado através de uma subvenção pai do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais da Saúde sob o número prêmio 5P20GM103436-13. Gostaria também de agradecer Dr. Tian Xu, em cujo laboratório fui apresentado a esta técnica e Dr. Raymond Pagliarini que primeiro estabeleceu esta técnica em laboratório Xu.
10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
Chilled 1X PBS pH7.2 working solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | Make fresh and refrigerate, can be used up to a week | |
Flynap | Carolina Biologicals | Fly anesthesia needed to anesthetize larvae | |
Fixative | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde | Needed to fix the dissected cephalic complex | |
Ice Bucket | Several | Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube | |
1.7ml Eppendorf tube | Various | ||
Glass slides, cover glass | Fisher Scientific | ||
Vectashield Mounting Media or any other mounting media | Vector Laboratories | ||
Halocarbon 200 or 700 Oil | Polysciences Inc. or Halocarbon.com | Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope | |
Sally Hansen “Hard as Nails” nail polish | Can be found at any general merchandise store | Needed to seal the edges of Coverslip | |
A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope | Leica and others | Needed to observe the GFP fluorescence in larvae | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | ||
Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish | Sigma Aldrich | ||
Paint Brush | Can be found at any general merchandise store | ||
Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article. |