Samarbeid mellom en aktivert onkogen som RAS V12 og mutasjoner i celle polaritet gener som skriblet, resultere i tumorvekst i Drosophila hvor kreftceller også vise invasive atferd. Her en enkel protokoll for induksjon og observasjon av de godartede og invasive svulster er presentert.
Drosophila har belyst vår forståelse av det genetiske grunnlaget for normal utvikling og sykdom de siste tiårene og i dag fortsetter å bidra umåtelig til vår forståelse av komplekse sykdommer 1-7. Progresjon av svulster fra en godartet til en metastatisk staten er en kompleks hendelse 8 og har blitt modellert i Drosophila å hjelpe oss å bedre forstå det genetiske grunnlaget for denne sykdommen ni. Her vil jeg presentere en enkel protokoll til genetisk indusere, observere og deretter analysere utviklingen av svulster i Drosophila larver. Den tumorinduksjon teknikken er basert på det MARCM systemet 10 og utnytter samarbeidet mellom en aktivert onkogen, Ras V12 og tap av celle polaritet gener (scribbled, plater store og dødelig gigantiske larver) til å generere invasive tumorer 9. Jeg viser hvordan disse svulstene kan visualiseres i intakt larver ogderetter hvordan disse kan bli dissekert ut for videre analyse. Det forenklede protokoll som presenteres her bør gjøre det mulig for denne teknikken for å bli utnyttet av etterforskerne som er interessert i å forstå rollen av et gen i tumor invasjon.
Progresjon av svulster fra en godartet til en metastatisk stat er et skritt klok prosess som er preget av unndragelse av beskyttende mekanismer i kroppen åtte. For eksempel kreftceller i kroppen må være i stand til å unngå apoptose og immunsystemet, gjennombrudd spesialisert ekstracellulære matrix (ECM) som heter Basement Membrane, og overvinne eventuelle sosiale kontroller pålagt av de omkringliggende cellene åtte. Det er gjennom et skritt klok progresjon at kreftcellene tilegne seg evnen til å migrere og kolonisere fjerne områder i en prosess som kalles metastasering. Vår forståelse av hvordan svulsten cellen overvinner barrierer pålagt av kroppen er fortsatt i sin spede begynnelse, men den nye bildet fra forskning gjort hittil poeng til en gjentatt bruk av normale utviklingsprosesser og signalveier ved kreftcellene 11-13.
Frukten fly Drosophila melanogaster har bidratt enormt til vår understanding av normal utvikling og sykdom gjennom bruk av avanserte genetiske teknikker utviklet i løpet av de siste tiårene 14-17. Bruke mutagenese og høyekspresjonsystemer verktøy vi har kommet frem til en bedre forståelse av ulike onkogener og tumor suppressor gener 18-22. Men, er tumor metastase et resultat av samarbeid mellom flere genetiske lesjoner som har hovedsakelig blitt undersøkt i cellekultur modeller 23,24 samt ulike xenograft modeller 25-27. Disse modellene skjønt kraftig har sine begrensninger som de ikke etterligne helt de forholdene som finnes i en levende organisme. Videre transgene modeller tilgjengelig i mus er tungvint og ikke bidrar til genetisk analyse av invasiv atferd 28,29. Flere studier har forsøkt å forstå invasjon av tumorceller i Drosophila 30,31. Disse teknikkene primært utnytte transplantasjon av primære svulster til vertene, og deretter stole på sporing av transplanted svulster for invasjonen av nabo vev 32,33. En kraftig teknikk som kalles MARCM 10 ble tilpasset av PAGLIARINI og Xu å modellere tumor invasjon i Drosophila ni. Denne elegante genetisk modellering av tumor invasjon utnyttet samarbeidet mellom en aktivert onkogen og tap av celle polaritet. Kraften av denne modelleringen ligger i det faktum at de invasive tumorer er skapt i et intakt organisme og dermed omgå behovet for transplantasjon av vev. For å få til den onkogene samarbeid, er et aktivert onkogen som Ras V12 uttrykt i kloner av celler i larve øye-antennal plate. Som et resultat av den MARCM teknikken disse kloner er også merket med grønt fluorescerende protein (GFP) for enkel visualisering og er laget homozygote for celle polaritet mutanter som dødelig giant larver, scribbled, og store plater. Resultatet er GFP merket invasive tumorer i cephalic kompleks. I denne rapporten jegvise hvordan å indusere, og visualisere disse invasive tumorer både i sammenheng med en intakt larver og dissekert ut cephalica kompleks. Den tumorinduksjon som presenteres her benytter reagenser på den andre kromosomet til Drosophila. I tabell 2, I gir en oversikt over aksjer på X og 3. kromosomer som kan utnyttes for samme formål. Jeg tror at denne forenklede protokollen vil gjøre denne teknikken lett tilgjengelig for forskere interessert i å forstå det molekylære grunnlaget for tumorprogresjon.
Kreft er en kompleks sykdom med en mye bedre forståelse i dag enn tidligere. Men trenger mye fortsatt må læres og forklares før vi har et komplett bilde av de underliggende mekanismene. Den enkel protokoll er presentert her gjør det mulig å genetisk indusere godartede og invasive tumorer i en hel organisme og deretter studerer biologien i forbindelse med utviklingen av svulster i denne modellen. De fleste av de eksisterende teknikker i Drosophila og andre organismer enten bruke en cellekultur basert syste…
The authors have nothing to disclose.
Forskning i laboratoriet mitt er støttet av WKU Institutt for Biologi oppstart midler, WKU Research Foundation RCAP-Jeg gir # 11-8032 og etter en KBRIN-AREAL stipend finansiert gjennom en forelder stipend fra National Institute of General Medical Sciences av National Institutes Helse henhold award nummer 5P20GM103436-13. Jeg ønsker også å erkjenne Dr. Tian Xu i hvis laboratorium Jeg ble introdusert til denne teknikken og Dr. Raymond PAGLIARINI som først etablert denne teknikken i Xu laboratoriet.
10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
Chilled 1X PBS pH7.2 working solution | Invitrogen, Sigma Aldrich | Make fresh and refrigerate, can be used up to a week | |
Flynap | Carolina Biologicals | Fly anesthesia needed to anesthetize larvae | |
Fixative | 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde | Needed to fix the dissected cephalic complex | |
Ice Bucket | Several | Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube | |
1.7ml Eppendorf tube | Various | ||
Glass slides, cover glass | Fisher Scientific | ||
Vectashield Mounting Media or any other mounting media | Vector Laboratories | ||
Halocarbon 200 or 700 Oil | Polysciences Inc. or Halocarbon.com | Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope | |
Sally Hansen “Hard as Nails” nail polish | Can be found at any general merchandise store | Needed to seal the edges of Coverslip | |
A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope | Leica and others | Needed to observe the GFP fluorescence in larvae | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | ||
Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish | Sigma Aldrich | ||
Paint Brush | Can be found at any general merchandise store | ||
Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article. |