Summary
当前文章概述了一个协议来建立体外细胞培养模型系统来研究一种兼人体细胞内的真菌病原体光滑念珠菌与人体巨噬细胞将是一个有用的工具，以增进我们对真菌毒力机制知识的互动。
Abstract
一种细胞培养模型系统中，如果主机环境条件密切模仿，可以作为一种廉价的，可再现的和容易可操纵替代动物模型系统中的微生物病原体感染的特定步骤的研究。一个人单核细胞株THP-1其中，经佛波酯治疗，分化为巨噬细胞，以前被用来研究的许多细胞内的病原体包括结核杆菌毒力的战略。在这里，我们讨论的协议制定的体外细胞培养模型使用THP-1巨噬细胞中描绘的人的机会性病原体酵母光滑念珠菌与宿主吞噬细胞的相互作用的系统。该模型系统结构简单，速度快，适合于高通量突变屏幕，并且不需要复杂的设备。一个典型的THP-1巨噬细胞感染实验大约需要24小时一个额外的24-48小时，使细胞内收回酵母生长在营养丰富的培养基进行菌落形成单位为基础的可行性分析。像其他的体外模型系统中，这种方法的一个可能的限制是难以外推得到的一个高度复杂的免疫细胞的电路存在于人类宿主的结果。然而，尽管这样，目前的协议是要阐明病原真菌可以采用回避/抵抗抗生素的反应和生存，适应和增殖的宿主免疫细胞的营养环境恶劣的策略非常有用。
Introduction
念珠菌是免疫功能低下患者1危及生命的侵袭性真菌感染的主要原因。 光滑念珠菌 ，一个新兴的院内病原体，是从重症监护病房的患者取决于地理位置1-3第二个或第三个最常见的孤立念珠菌。系统发育，C.光滑念珠菌 ，单倍体芽殖酵母，更密切相关的非致病模型酿酒酵母不是致病念珠菌。包括C。白色念珠菌 4。与此相一致，C。光滑缺少一些关键的真菌毒力性状，包括交配，分泌的蛋白水解活性和形态可塑性4-5。
虽然C。光滑不形成菌丝，它可以生存和复制在小鼠和人类巨噬细胞6-8这表明它已经开发了独特的发病机制。有限的信息，请访问有关的策略，C.采用光滑的生存贫营养的巨噬细胞内环境，抵制氧化和挂载宿主免疫细胞5非氧化宿主反应。一个与此相关巨噬细胞模型系统是一个先决条件划定C的相互作用光滑念珠菌与宿主吞噬细胞通过功能基因组学和蛋白质组学的方法。外周血单核细胞（PBMC）和人及鼠源的骨髓衍生的巨噬细胞（BMDMs），分别刚才被用来研究C的相互作用光滑念珠菌与宿主免疫细胞7,9。然而，难以获得外周血单个核细胞和BMDMs，他们有限的生命跨度和不同哺乳动物捐助者之间的内在差异限制了这些细胞的利用率多才多艺的模型系统。
在这里，我们描述了一种建立在体外系统研究intracellul的C的AR行为光滑念珠菌细胞从人单核细胞系THP-1巨噬细胞。本协议的总体目标是制定可以很容易地操纵研究宿主真菌病原体相互作用的不同方面简单，价格低廉，快速，重现性细胞培养模型系统。
THP-1细胞先前已用于解密对广范围的病原体，包括细菌，病毒，真菌和10-12的宿主免疫应答。单核细胞THP-1细胞易于维护，并且可以区分，在佛波酯治疗，巨噬细胞它模仿人类单核细胞源性巨噬细胞和表达适当的巨噬细胞标记物13。 THP-1巨噬细胞模型系统的主要优点是易于使用性和缺乏先进的设备要求。
这里介绍的协议是很容易适应学习其他人的真菌病原体与居屋的相互作用吨的免疫细胞。当前的过程也可以用来识别毒力因子的感兴趣使用高通量突变体屏幕上的病原体。这证明型概念例证的成功使用THP-1培养模型系统来识别一组在人类巨噬细胞8所需的光滑念珠菌生存的56个基因。
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Protocol
建议在执行C。光滑念珠菌感染的实验与生物安全防护水平的2实验室（BSL-2）。
- 制备THP-1巨噬细胞单层。
- C.编制光滑念珠菌细胞悬液。
- THP-1巨噬细胞C的感染光滑的细胞。
- 测量通过集落形成单位测定吞噬率和细胞内复制。
- 监控用共聚焦激光扫描显微镜细胞内复制。
1。 THP-1巨噬细胞单分子膜的制备
- THP-1是一个1岁男孩患急性单核细胞白血病14痛苦的外周血来源的人类单核细胞系。 THP-1中，悬浮细胞系，是经常在潮湿的5％CO 2中在补充有10％FBS（胎牛血清）的RPMI-1640培养基中维持在37℃。治疗与佛波醇12 - myristaTE 13 - 乙酸酯（PMA，佛波酯）导致的THP-1单核细胞的终末分化成巨噬细胞。重要的是，PMA处理不影响细胞活力及分化的细胞不分裂。
- 种子约1.5×10 6 THP-1单核细胞在100毫米的培养皿中，在RPMI-1640完全培养基（RPMI-1640培养基补充有10％血清，2mM谷氨酰胺和1x抗生素;为10ml /皿），并让细胞生长在37 °℃，5％CO 2的2天。
- 一旦THP-1细胞已经达到了8×10 5细胞/ ml的密度，将培养皿转移至细胞培养物层流罩，轻轻地摇动它重新悬浮沉淀的细胞。
- 吸取细胞悬液出来，放入15毫升无菌试管中并离心分离机以1000rpm（130×g离心）4分钟。弃上清，并暂停THP-1细胞沉淀在5ml新鲜，预热的培养基，RPMI-1640完全培养基中。
- 列举细胞用血细胞计数器和稀的大公升悬浮至10 6个细胞/ ml用预热的RPMI-1640完全培养基中的终浓度
- 加入1μl的160毫米PMA股票（佛波醇12 - 十四烷酸酯-13 - 乙酸酯溶液制备的二甲基亚砜）至10 ml THP-1细胞悬液（终浓度为16纳米）拌匀。分配1毫升细胞悬液到24孔组织培养板的各孔中，并在保持在37℃，5％CO 2的12小时培养箱孵育板。
- 除去旧培养基，加入1 ml预热的RPMI-1640完全培养基中，并让细胞恢复12小时，于37℃在5％CO 2。
- 观察在倒置显微镜下观察细胞，以确保椭圆形的THP-1单核细胞的悬浮液已分化为扁平，梭形和附着的巨噬细胞。这些分化的细胞现在已经准备好进行C。光滑念珠菌感染的研究。
2。 C.编制光滑 ＆＃160;细胞悬浮
光滑念珠菌野生型菌株BG2将被用于感染的THP-1巨噬细胞。C.光滑念珠菌细胞常规培养在液体YPD（酵母提取物（1％）-蛋白胨（2％）-葡萄糖（2％））培养基中。固体YPD培养基中，加入2％的琼脂培养基在高压灭菌前制备。
- 为了准备C.文化光滑念珠菌 ，挑取单个菌落从琼脂平板上，用无菌的，一次性环，接种到10ml的YPD液体培养基和14-16小时，孵育在30℃下振荡（200rpm）下
- 离心该培养（1毫升）在4,000 rpm（1,800×g离心）5分钟，在台式微量离心机，三次洗涤细胞，用无菌PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4）中，并暂停细胞沉淀在1ml PBS中。
- C.测量外径600 光滑念珠菌细胞悬浮液，并用无菌PBS中适当体积稀释到获得的2×10 6个细胞/ ml的密度（OD 600= 0.1）。或者，所需的细胞密度可以通过使用血球计数酵母细胞来实现。
3。的THP-1巨噬细胞与C感染光滑念珠菌细胞
- 加入50微升C。光滑念珠菌细胞悬浮液以THP-1巨噬细胞（每24孔培养板的井10 6个细胞接种），得到的MOI为0.1（感染复数）孵育板在37℃下用5％的CO 2。
- 为了确定可行的酵母计数，稀释50微升C.光滑念珠菌细胞悬液100倍的无菌PBS和板100微升在YPD固体培养基。孵育板在30°C和手工清点后1-2天出现酵母菌菌落数。这些数字将，从此，被称为0小时C。光滑的CFUs（菌落形成单位）。
- 后的THP-1细胞与C的2小时共培养通过反相24孔培养板光滑细胞，弃培养基我呐水库和轻轻地洗三次，用预热无菌PBS去除nonphagocytosed外三光滑的细胞。轻柔洗涤，用PBS是绝对必要的，以实现完全除去所有细胞外的酵母而不会造成对THP-1巨噬细胞单层的任何损坏。
4。通过集落形成单位测定吞噬率和细胞内复制的测量
- 裂解C。光滑念珠菌感染的THP-1巨噬细胞以1毫升无菌H 2 O的2分钟，轻轻刮掉，除去从井的巨噬细胞碎片和在微量离心管收集细胞裂解液。的完整的巨噬细胞裂解微观验证是举足轻重的所有内在化酵母的回收。
- 制备100倍稀释的溶胞产物的无菌PBS，板100微升在YPD固体培养基中孵育板在30℃下
- 1-2天后，手动计数C的数光滑念珠菌菌落APpeared YPD培养基上，乘以稀释倍数（2小时的CFU），并计算吞噬率是指C的百分比是由THP-1巨噬细胞后2小时共同孵育使用下列公式计算摄入的光滑念珠菌细胞。
％吞噬= [（CFU的在2小时）/（CFU的，在0小时）]×100 - 测量C的胞内复制的速率光滑念珠菌细胞在THP-1巨噬细胞，在不同时间点感染后，即收集细胞酵母。 4，6，8，10，12，和24小时，通过重复步骤3.3-4.3。
- 计算C的折叠生存/复制光滑念珠菌细胞在THP-1巨噬细胞中通过将总的CFUs在任何给定时间点与那些在2小时（吞噬的酵母）。
5。细胞内复制的使用共焦拉斯监控呃扫描显微镜
- 以下在第1节中所述的步骤，种子PMA处理的5×10 5个THP-1细胞中的2 4 -孔室玻片各孔中，在37℃，5％CO 2下12小时。
- 更换旧培养基用预热的RPMI-1640完全培养基中和允许细胞从PMA处理恢复12小时。
- 制备GFP（绿色荧光蛋白）标记的C.光滑念珠菌细胞悬浮液作为第2节所述，感染到的THP-1巨噬细胞为1的MOI。如果C。光滑念珠菌菌株表达GFP不可用，用FITC标记的（荧光素异硫氰酸酯）的酵母细胞，可用于监测早期事件感染后即 。吞噬率和phagolysosomal成熟时2小时。
- 孵育玻片2小时，在37℃，5％CO 2，反转它们仔细地丢弃培养基，用无菌洗3次，预热的PBS中。
- 加入500μl预热的RPMI-1640完全的Medi微米至1滑动的各腔室，并用5％CO 2的22小时孵育它在37℃。
- 要解决2小时C。光滑念珠菌感染的THP-1巨噬细胞，加入500μl的3.7％甲醛（在PBS中制备的）的其他幻灯片的各腔室和孵化它在室温下放置20分钟，在黑暗中。
- 洗净用PBS三次滑动，加入500μl的Triton-X（0.7％），并在室温下孵育5分钟，在黑暗中。
- 滑洗3次，用PBS，从文化的幻灯片中删除室和空气干燥在黑暗中3-5分钟。
- 使用含DAPI的Vectashield封固剂（4'，6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚）上滑动，避免形成气泡小心装入盖玻片。轻轻地取出多余的液体用的Kimwipe和密封盖玻片的边缘用指甲油。在黑暗中，在4°C，直到使用存储的幻灯片。
- 重复步骤5.4和5.6-5.9处理THP-1细胞24小时后的感染。
- 使用激光扫描confo细胞图像卡尔显微镜（60X油浸物镜，激发波长为405纳米和488纳米的DAPI和GFP染色，分别）。
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Representative Results
PMA处理的THP-1巨噬细胞C.感染分析光滑念珠菌的野生型（wt）细胞中发现， 重量细胞，巨噬细胞在2小时后共同培养的速率的55-65％，吞噬。此外，C。光滑念珠菌细胞能够由THP-1巨噬细胞的抗杀并进行了适度的5 -至与THP-1巨噬细胞的共培养8的24小时后的7倍增加的CFUs。野生型细胞，转化有表达GFP的质粒，在THP-1巨噬细胞内的复制，也验证了用共聚焦荧光显微镜，其特征在于每THP-1巨噬细胞内的酵母细胞的数目从一个或两个增加为7至12在一段24小时（ 图1）。
图1。甲醛的共聚焦图像固定，GFP标记C。光滑念珠菌感染的THP-1巨噬细胞内显示复制与THP-1细胞窝藏1-2和5-8的酵母在2小时和24小时，分别为。细胞核用DAPI染色。标尺=10μm以下。
图2。在C的示意图通过签名标记的诱变光滑念珠菌突变体库画面中的THP-1巨噬细胞中改变的存活曲线（STM）的方法。红色和杂交膜绿色圆圈表示降低和升高的代表性的标签相比，分别对输入样本输出样本。
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Discussion
先天免疫系统中起着的机会性真菌感染的控制中起重要作用。巨噬细胞促进食入和破坏病原真菌的抗真菌防御。因此，所需要的生存和/或对抗巨噬细胞的抗菌功能的因素，阐明将增进我们对真菌毒力的战略认识。在这方面，我们已经建立了使用来自人单核细胞系THP-1巨噬细胞以表征一个人的机会性真菌病原体C的相互作用在体外细胞培养模型系统光滑念珠菌与宿主吞噬细胞。虽然这THP-1巨噬细胞模型系统已成功用于识别C.与全身性念珠菌8小鼠模型显示减毒毒力降低生存光滑突变，该系统的合理限制是其孤立背景下，因此，得到的结果可能不始终适用于复杂的哺乳动物宿主的免疫系统。此外，该系统不同于活细胞成像的方法，是无法解释的要么未获THP1巨噬细胞吞噬或被杀时的酵母细胞。
本协议的意义在于它的简单性，可重复性和可扩展性。该方法可以按比例缩小到一个96孔板中，并调整到150 cm 2的组织培养瓶。在这个协议中的关键步骤是选择适当的MOI和广泛的PBS洗涤，以减少相应的裂解物的稀释细胞外复制，电镀，得到每片100-200酵母菌落。 0.1 MOI非常适合监测细胞内复制了一段24小时为细胞外酵母细胞的数量THP-1巨噬细胞C的这场旷日持久的共培养过程中保持最小光滑的细胞。进一步，为1.0的MOI是最佳的可视化的最大数目
具体列举的细胞内生存/复制，CFU比较应该被内化酵母的数量之间在2小时和那些在稍后的时间点进行。 0小时CFU的比较将扭曲的结果，如果最初的依恋和吞噬率是不同的不同的菌株。值得注意的是，在这里，在感染期细胞内的酵母细胞的数目也可以通过流式细胞术和共聚焦/活细胞成像显微术的方法进行测定。
此外，细胞内的酵母recove红色在不同时间点后使用该协议感染可用于多个分析，包括显微镜，活性氧（ROS）的积累，染色质提取，RNA和蛋白质的分离辨别后生，转录和光滑念珠菌细胞的代谢反应对巨噬细胞内环境。它执行任何生化分析对巨噬细胞内化酵母之前完全消除细胞外酵母和巨噬细胞的碎屑是很重要的。
在体外细胞培养模型系统的另一个应用是它的适应性突变的屏幕为改变生存的配置文件，单独或复用的96株通过信号标签突变（STM）的方式池。在STM战略的优点是数以百计的突变体中的单个实验的平行筛选。这种方法最近被用于筛选C。光滑突变丽brary当中包括18,350随机Tn的7插入突变体，并组装在总共192个池，其中每个池是由96独特的寡核苷酸标记的突变体8'15。 图2形象地说明了STM屏方法，它包括三个大纲主要步骤。首先，96 C的过夜生长池光滑的突变体是培养无论是在营养丰富的培养基（输入）或感染，以THP-1巨噬细胞在24孔培养板。 2小时后感染，胞酵母细胞通过PBS洗涤除去感染的THP-1细胞在37℃。 24小时感染后，细胞内的酵母细胞（输出）是由THP-1细胞的osmolysis回收。第二个步骤涉及从输入和输出样本接着独特的签名标记与32 P标记的dCTP标记的扩增使用拘谨提取基因组DNA的ERS互补的不变区域侧翼每一个独特的寡核苷酸序列。第三，从输入和输出池放射性标记杂交到Hybond尼龙膜，其中包含各持一个独特的签名标记96质粒。杂交信号的一个独特的寡核苷酸序列反映了突变株的丰度，携带该特定的标签，在96突变体池。输出（OP），以输入（Ip）的比率为每个标签是通过将输出信号的强度通过将输入信号的强度来计算。突变体显示至少6倍高和低10倍的生存可以分别被视为“向上”（OP / IP = 6.0，增加存活）和“向下”（OP / IP = 0.1，存活率降低）突变体（ 图2）。备选地，荧光标记的探针依赖性DNA微阵列可用于确定在输入变量和输出的采样的信号强度这反映细胞内的沟通和对话的任何变化IOR的突变体。
此方法也可以用于研究活性氧和细胞因子反应和吞噬细胞的感染后phagolysosomal酸化真菌病原体。最后，由于该过程的这两个的适应性，各种免疫细胞类型，包括原代细胞和真菌生物，这个协议是合适的，以解决宿主菌相互作用的几个方面。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作得到了创新的年轻生物技术专家奖BT/BI/12/040/2005和BT/PR13289/BRB/10/745/2009赠款生物技术，印度和中心的DNA指纹图谱和诊断核心资金的政府部门的支持，海得拉巴。 MNR和GB是初中和科学与工业研究理事会对追求马尼帕尔大学博士学位的高级研究奖学金的受助人。 SB是初中和生物技术部高级研究奖学金朝着追求马尼帕尔大学的博士学位获得者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | For maintaining THP-1 cells |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Caution: Hazardous |
| YPD | BD-Difco | 242710 | For growing Candida glabrata cells |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | For fixation of C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl, pH 7.4) for washes | ||
| Saline-sodium citrate (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0.3 M sodium citrate for 20x concentration) for washes | ||
| Prehybridization buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt’s solution, 5x SSC, 1% SDS) for hybridization | ||
| VECTASHIELD mounting medium | Vector Labs | H-1200 | For mounting slides for confocal microscopy |
| 32P-labeled α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | For radiolabeling of signature tags |
| 100 mm tissue culture dishes | Corning | 430167 | To culture THP-1 cells |
| 24-well tissue culture plate | Corning | 3527 | To perform C. glabrata infection studies in THP-1 macrophages |
| 4-chamber tissue culture-treated glass slide | BD Falcon | REF354104 | To image C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Hemocytometer | Rohem India | For enumeration of cells | |
| Table top microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | For spinning down cells in microtubes |
| Table top centrifuge | Remi | R-8C | For spinning down cells in 15 ml tubes |
| Spectrophotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | To monitor absorbance of yeast cells |
| Plate incubator | Labtech | Refrigerated | To grow C. glabrata cells |
| Shaker incubator | New Brunswick | Innova 43 | To grow C. glabrata cells |
| Water jacketed CO2 incubator | Thermo Electron Corporation | Forma series 2 | To culture THP-1 cells |
| Confocal microscope | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | To observe C. glabrata-infected THP-1 macrophages |
| Compound microscope | Olympus | CKX 41 | To observe C. glabrata and THP-1 macrophages |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | To amplify unique tags from input and output genomic DNA |
| Hybridization oven | Labnet | Problot 12S | For hybridization |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | For scanning hybridized membranes |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | For denaturation of radiolabeled signature tags |
| Gel documentation unit | Alphainnontech | Alphaimager | To visualize ethidium bromide-stained DNA in agarose gels |
References
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