Propportionell Biosensors som mäter Mitokondriell redoxtillstånd och ATP i Living jästceller

Summary

Vi beskriver användningen av två ratiometrisk, genetiskt kodade biosensorer, som är baserade på GFP, för att övervaka mitokondrie redoxtillstånd och ATP-nivåer vid subcellulärt upplösning i levande jästceller.

Abstract

Mitokondrierna har roller i många cellulära processer, från energiomsättning och kalciumhomeostas att styrningen av cellernas livslängd och programmerad celldöd. Dessa processer påverkar och påverkas av den redox status och ATP produktionen av mitokondrier. Här beskriver vi användandet av två ratiometrisk, genetiskt kodade biosensorer som kan upptäcka mitokondriell redoxtillstånd och ATP-nivåer vid subcellulärt upplösning i levande jästceller. Mitokondriell redoxtillstånd mäts med redox-känsliga grönt fluorescerande protein (roGFP) som är riktad till den mitokondriella matrisen. Mito-roGFP innehåller cysteiner i positionerna 147 och 204 av GFP, som genomgår reversibel och miljö-beroende oxidation och reduktion, vilket i sin tur förändrar excitationsspektrumet av proteinet. MitGO-ATeam är en Förster resonance energy transfer (FRET) sond i vilken ε-subenheten av F _o F _1-ATP-syntas är inlagt mellan FRET donator och acceptor fluorescent proteiner. Bindning av ATP till resultaten ε subenheten i konformationsförändringar i proteinet som ger FRET donator och acceptor i omedelbar närhet och möjliggöra fluorescensresonansenergiöverföring från donatorn till acceptorn.

Introduction

Mitokondrierna är viktiga organeller för ATP-produktion, biosyntes av aminosyror, fettsyror, häm, järn svavel kluster och pyrimidiner. Mitokondrierna spelar också avgörande roller i kalciumhomeostas, och i regleringen av apoptos. ¹ öka kontakterna bevis mitokondrier till åldrande och åldersrelaterade sjukdomar som Parkinsons sjukdom, Alzheimers sjukdom, amyotrofisk lateralskleros, och Huntingtons sjukdom. ² Medan individer lever hela sina liv med mutationer i mitokondriernas proteiner som är associerade med neurodegenerativa sjukdomar, sjukdomssymptom uppstår först senare i livet. Detta indikerar att förändringar sker i mitokondrier med åldern som tillåter sjukdomspatologin att dyka. Faktum är mitokondrie fitness korrelerad med total cell hälsa och livslängd i jäst och däggdjursceller. ^3,4 Här beskriver vi hur du använder genetiskt kodade, ratiometrisk fluorescerande biosensorer för att bedöma två viktiga funktioner i mitochondria i levande jästceller: redoxtillstånd och ATP-nivåer.

Mitokondriell funktion i aerob energi mobilisering är väl etablerad. Mitochondrial redoxtillstånd är en produkt av reducerande och oxiderande arter i organell, inklusive NAD ⁺ / NADH, FAD / _FADH2, NADP ⁺ / NADPH, glutation / glutation disulfid (GSH / GSSG) och reaktiva syrespecies (ROS). Uncoupling mitokondrier eller hypoxi påverkar mitokondriella andningskedjan aktivitet och förändrar förhållandet mellan NAD ⁺ till NADH i organell. ROS, som framställts av ineffektiva elektron överföring mellan komplex av elektron transportkedjan i det inre mitokondrie membranet, samt från deamineringen av aminer via monoaminoxidas i yttre mitokondriemembranet ^5, lipider skador, proteiner och nukleinsyror och har varit kopplade till åldrande och åldersrelaterade associerade neurodegenerativa sjukdomar ^6,7,8. ROS spelar också en roll i signaltransduktion i mitochondria, genom oxidation av GSH. Till exempel, NADH dehydrogenas inte bara bidrar till ROS produktion men också regleras genom interaktioner med glutation pool ^9,10. α-ketoglutarat dehydrogenas och Aconitase, komponenter i TCA-cykeln, uppvisar minskad aktivitet i oxiderande miljöer ^11,12.

Faktum är redox-beroende reglering av Aconitase aktivitet bevarad från bakterier till däggdjur ^13,14. Således, övervaka redoxtillståndet och ATP nivåer av mitokondrier är avgörande för att förstå deras funktion och roll i sjukdom patologi.

Biokemiska metoder har använts för att bedöma redoxtillståndet eller ATP-nivåer av hela celler eller isolerade mitokondrier. Använda metoderna för att bedöma redoxtillståndet av hela celler eller isolerade mitokondrier bygger på att mäta nivåerna av den redoxpar GSH / GSSG ^15. Luciferin-luciferas-systemet används ofta för att mäta mitokondrieATP-nivåer i antingen permeabiliserade hela celler eller isolerade mitokondrier. ^{16,17,18,19,20} i denna analys, binder luciferas till ATP och katalyserar oxidationen av och kemiluminescens från luciferin. ²¹ Intensiteten av det utsända ljuset är proportionell mot mängden av ATP i reaktionsblandningen. ²²

Dessa metoder har avslöjat grundläggande information om mitokondriell funktion, inklusive den slutsatsen att patienter med neurodegenerativa sjukdomar, såsom Alzheimers sjukdom, har onormalt låga ATP-nivåer. ²³ Men de kan inte användas för att avbilda levande, intakta celler. Dessutom, metoder baserade på helcell-analys ger ett genomsnitt av redoxtillstånd eller ATP-nivåer i alla fack i cellen. Mätningar i isolerade organeller är potentiellt problematiskt eftersom mitokondrie redoxtillstånd eller ATP-nivåer kan ändras under subcellulär fraktionering. Slutligen, nya studier från vårt laboratorium och andra visar attmitokondrier inom enskilda celler är heterogena i funktion, vilket i sin tur påverkar livslängden på mor och dotter-celler. ³ Det finns således ett behov av att mäta mitokondrie ATP-halter och redoxtillstånd i levande celler med subcellulär upplösning.

De biosensorer för mitokondriell funktion beskrivs här är båda baserade på GFP. Redox-känslig GFP (roGFP) ^24,25 är en GFP variant där ytexponerade cysteiner tillsättes till molekylen. roGFP, liksom vildtyps-GFP, har två excitations topparna (vid ~ 400 nm och ~ 480 nm) och en emissionstopp vid ~ 510 nm. Oxidation av cysteinresterna i roGFP resulterar i en ökning av excitation vid ~ 400 nm. Minskning av dessa cysteiner gynnar excitation vid ~ 480 nm. Sålunda avslöjar förhållandet 510 nm emission vid excitering av roGFP vid 480 nm och 400 nm den relativa mängden av reducerad och oxiderad roGFP, som återspeglar redoxtillstånd av fluoroforen miljö.

Två versjoner av roGFP används ofta: roGFP1 och roGFP2. Båda innehåller samma cystein infogningar. roGFP1 baseras på naturligt GFP och roGFP2 baseras på S65T GFP, som har mer effektiv excitation vid 480 nm och mindre effektiv excitation vid 400 nm jämfört med wtGFP ^24. roGFP1 är mindre pH-känslig än roGFP2 och dess dynamiska omfång sträcker sig vidare in i den reducerade intervall. Således kan roGFP1 vara mer användbara för övervakning mer reducerande fack såsom mitokondrier eller cytosolen och delområden med varierande pH, såsom endosomer. roGFP2 erbjuder ljusare signal och, i vissa studier, ett större dynamiskt omfång än roGFP1 ^24,26. Studier i Arabidopsis thaliana tyder på att den tid som krävs för att svara på förändringar i redoxtillstånd är likartad för båda sensorerna (t ½ för oxidation, 65 och 95 sekunder och t ½ för reduktion, 272 och 206 sek, för roGFP1 och roGFP2, respektive). ²⁶

MitGO-ATeam2 är en minimalt invasiv, tillförlitligsensor som mäter mitokondriell ATP i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae. GO-ATeam är en Förster resonance energy transfer (FRET) sond som består av ε-subenheten av F _o F _1-ATP-syntas inklämt mellan FRET donator-och acceptor-fluorescerande proteiner (GFP och orange fluorescerande protein (OFP), respektive). ²⁷ Bindning av ATP till resultaten ε subenheten i konformationsförändringar i proteinet som ger FRET donator i nära anslutning till acceptorn och möjliggöra energiöverföring från donator till acceptor. Det finns två varianter av GO-ATeam, GO-ATeam1 och GO-ATeam2. GO-ATeam2 har en högre affinitet för MgATP än GO-ATeam1, vilket gör den mer lämplig för mätning av den typiskt lägre [ATP] i mitokondrier i förhållande till cytosolen. ²⁷

Att söka mitokondriella redoxtillstånd, konstruerade vi ett fusionsprotein (mito-roGFP1) bestående av roGFP1 fuserad till ATP9 ledarsekvensen ennd uttryckt från en centromer-baserad (lågt kopietal) jästexpressionsplasmid under kontroll av den starka glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GPD)-promotorn (p416GPD, Addgene). Vi använde roGFP1 att sondera redox status mitokondrier i samband med åldrandet av modellen svampen Saccharomyces cerevisiae. Vi finner att roGFP1 kan upptäcka förändringar i mitokondriell redoxtillstånd som inträffar under åldrande och som svar på tillgången på näringsämnen men har ingen uppenbar skadlig effekt på jästceller. Vi ser även variabilitet i redoxtillståndet av mitokondrier inom enskilda celler levande jäst, ett konstaterande som understryker vikten av en biosensor med subcellulär rumslig upplösning.

MitGO-ATeam2 är en variant av GO-ATeam2, som har den mitokondriella signalsekvensen av cytokrom c oxidas subenhet VIIIA insatt vid aminoterminalen av GO-ATeam2. ²⁷ Vi modifierade den mitGO-ATeam2 sond (tillhandahölls vänligt av laboratoriet av H. Noji, institf vetenskaplig och industriell forskning, Osaka University, Japan) för användning i jäst genom subkloning det, via Xba1 och Hindlll, i jästexpressionsvektor pAG415GPD-ccdB (Addgene, Cambridge, MA, USA), vilket är en låg-kopia plasmid innehåller den starka konstitutiva GPD promotor. Vi uttryckte mitGO-ATeam2 i spirande jäst, och finna, genom motfärgning med DNA-bindande färgämne DAPI, att den lokaliserar uteslutande till cellernas mitokondrier där det fungerar som ett effektivt sond för att mäta fysiologiska förändringar i mitokondriella ATP-nivåer.

roGFP och GO-ATeam är både genetiskt kodade. Som ett resultat, kan de införas och bibehållas stabilt i intakta celler, och ger information om redoxtillstånd eller ATP-nivåer i enskilda, levande celler. Dessutom är båda biosensorer övervaka förändringar i redoxtillstånd eller ATP-nivåer som förekommer under fysiologiska förhållanden. ²⁸ Båda sonderna är också ratiometrisk. Som ett resultat, är mätningar gjorda med dessa sönder påverkas inte av changes i Biosensor koncentration eller provbelysning eller tjocklek. Slutligen, båda biosensorer ger subcellular rumslig upplösning. Sannerligen, har roGFP varit riktade till mitokondrier, ER, endosomer och peroxisomerna ^24, och kan upptäcka förändringar i redox tillståndet för var och en av dessa organeller, till stor del oberoende av pH.

Protocol

Ett. Transformation av jästceller med Biosensors

1. Förvandla önskad jäststam med plasmiden bärande Mito-roGFP eller mitGO-ATeam2 med metoden litiumacetat ^27.
2. För att bekräfta transformation med plasmidburna biosensor och för att förhindra förlust av plasmiden, välja och upprätthålla transformanter på lämpligt selektivt syntetiskt komplett medium (SC-Ura för mito-roGFP, eller SC-Leu för mitGo-ATeam2). Om den fluorescerande sonden har subklonats i en annan plasmid än de som beskrivs här, använd lämpligt selektivt medium. Visualisera transformanter genom fluorescens mikroskopi för att bekräfta att de uttrycker fluorescerande biosensor och uppvisar normala mitokondriell morfologi.

2. Tillväxt av celler och förberedelser för Imaging

Cellernas funktion och respons på läkemedelsbehandling är mycket beroende av cell densitet och metabolisk aktivitet. De bästa resultaten erhålles när cellerär aktivt delande (mid-log-fas, ~ 0,5-1 x 10 ⁷ celler / ml). Det mest tillförlitliga sättet att generera mid-logfas kulturer av jämn densitet är att ympa från en stationär-fas förkultur.

1. Förbered en stationär-fas förkultur: plocka en enda koloni av transformerade celler från en platta och ympa selektiva flytande medier (5 ml i en 50 ml konisk-botten rör). Odla vid 30 ° C med skakning vid 225 rpm tills den optiska densiteten av kulturen vid 600 nm (OD ₆₀₀₎ har nått en platå (24-48 h).
2. Förbered en mid-logfas kultur för observation: använd lämplig volym av pre-kulturen för att ympa 5 ml av selektiva media i en 50 ml konisk botten röret. YPD media är autofluorescent och bör inte användas för dessa studier. Använd syntetiska kompletta, glukos bygger, dropout (SC-Ura) media. Odla celler vid 30 ° C, skakning vid 225 rpm, i 4-16 h, tills de når mitten av log-fasen (~ 0,5-1 x 10 ⁷ celler / ml). Celldensitet kan bestämmasgenom mätning av OD _600, kalibrera spektrofotometer för att bestämma den korrekta OD ₆₀₀ behandlingen. På vår Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN) motsvarar mitten av log-fas till en OD ₆₀₀ av 0,1-0,3.

Mito-roGFP1 sinnen svängningar i organell som svar på metabola förändringar. Till exempel, i denna analys mitokondriella redox tillstånd ändras då jäst växa på fermenterbara kolkällor (t.ex. glukos, såsom i SC medier) kontra icke-jäsbara kolkällor (t.ex. glycerol, såsom i SGlyc media), och även i olika partier av samma medier. Därför använder samma parti medier för alla experiment.

3. Cellerna är redo för koncentration (se steg 2.4) och bildbehandling om ingen behandling utförs. Om cellerna behandlas, inkubera celler med lämplig behandling och fortsätt till nästa steg.
4. Koncentrat 1 ml av kulturen genom centrifugering vid 6000 xg under 15 sek ochåtersuspension av cellpelleten i 20 | il medium. Dessa villkor maximera antalet urskiljbara celler i synfältet.
5. Applicera 2 mikroliter av återsuspenderade celler till en bild. Täck med ett täckglas (nr. 1,5, företrädesvis högpresterande 170 ± 5 | im tjocklek), och försegla kanterna på täckglas med genomskinligt nagellack eller valap (se Reagens). För att täta med valap, smälta en liten mängd på en metallspatel genom att hålla den över en bunsenbrännare flamma, sedan sprida en liten mängd längs kanterna på täckglas.
6. Upprätthåll celler vid 30 ° C under avbildning. En objektiv värmare på 100x oljeimmersion lins används för avbildning fungerar bra för denna applikation. Under dessa betingelser, mitokondriell morfologi, redoxtillstånd och ATP-nivåer oförändrade under avbildning under 10-15 min.

Tre. Imaging Setup

1. Inställning för avbildning mito-roGFP1 på ett brett fält fluorescens mikroskop
   Stegen här är skräddarsydda för AxioObserver.Z1 mikroskop utrustat med en Colibri LED exciteringskälla, ett brett fält Orca ER kamera och AxioVision förvärvet programvara. Fotoblekning av båda kanalerna och photoconversion av oxiderade Mito-roGFP1 reduceras avsevärt med hjälp av LED-belysning jämfört med kvicksilverbåglampa belysning (se nedan).
   För att maximera signal och upplösning, använd den högsta numeriska bländaröppningen möjligt i målet, och den lägsta förstoringen som ger tillräcklig rumslig upplösning. Dessutom, för mito-roGFP avbildning, kontrollera att målet sänder väl vid 365 nm. Den 100x/1.3NA EG PlanNeofluar objektiv (Zeiss) fungerar bra för denna applikation.
   Konfigurera förvärvet programvara för att fånga de oxiderade och reducerade Mito-roGFP1 arter. Vi använder följande villkor.
   1. Konfigurera kanal för oxiderade Mito-roGFP att använda excitation vid 365 nm (100% LED effekt) och ett utsläpp filter lämpligt för GFP, såsom 38 HE filtrera set (Zeiss), med den medföljande excitation filtret avlägsnas från kuben. Avlägsnande av excitationsfilter tillåter excitation vid både 365 nm och 470 nm utan att behöva byta filter, vilket sålunda ökar uppnåeliga tidsupplösning.
   2. Konfigurera kanal för minskad mito-roGFP att använda excitation vid 470 nm (100% LED effekt) och, såsom nämnts ovan, samma emissionsfiltret kub som används för den oxiderade mito-roGFP. Ställ in kameran på 1x1 binning att optimera rumslig upplösning.
   3. Ställ programvara för att förvärva az stack består av 11 skivor med 0,5 um avstånd, samla båda kanalerna vid varje z position. Detta läge av förvärvet är långsammare än att skaffa varje z stack i sin tur, men det hindrar artefakter uppstår mitokondrie rörelse mellan förvärvet av de oxiderade och reducerade kanaler.
   4. Bild flera celler för att bestämma en lämplig exponeringstid, som producerar en stark men inte mättar signal. Det är viktigt att bibehålla förhållandet av exponeringstider för oxiderat och reducerat mito-roGFP1 för alla experiments. Till exempel bör om exponeringstider för oxiderat och reducerat Mito-roGFP1 är 300 och 100 ms, respektive, då exponeringstiden för oxiderad Mito-roGFP1 vara 3 gånger som för reducerad mito-roGFP för alla experiment.
2. Inställning för avbildning mitGO-ATeam2 på en spektral konfokalmikroskop
   För att kvantifiera ATP nivåer med mitGO-ATeam2, fluorescens från GFP (emissionsmaximum 510 nm) måste särskiljas från den från OFP (emissionsmaximum 560 nm). Det finns fluorescens filter set som löser den fluorescens som emitteras från dessa fluoroforer. Däremot finner vi att en spektrala detektor, som finns på många laserskanning konfokala mikroskop, fungerar bäst för denna applikation. En spektrala detektor separerar fluorescensemissionen in många komponenter (typiskt 32 eller mer) enligt våglängd. Flera närliggande våglängdsband kan kombineras till en enda bild kanal. De våglängder som ska kombineras väljs empiriskt för att maximera signalen från GFP och OFP samtidigt undvika crossover av signal som skulle förbrylla FRET mätning. Använd den högsta numeriska bländare tillgängliga. Vi använder en 100x/1.49 eller 60x/1.49 Apo-TIRF lins. Vi använder Nikon A1R konfokalmikroskop kör NIS Elements. Konfigurera förvärvet programvara för att fånga de ATP-bundna och ATP-obundet mitGO-ATeam2 arter. Vi använder följande villkor.
   1. Ställ hål till 1,0 Airy enheter (AU), som i vårt system motsvarar az upplösning på cirka 0,42 | im.
   2. Ställ skanna zoom närma Nyquist provtagning gränsen, vilket kommer att maximera rumslig information i bilden. På vårt system pixelstorlek är 0.12 pm.
   3. Eftersom mitokondrierna kan röra sig under avbildning, kan det vara till hjälp att öka utskriftshastighet genom att beskära fältet till 512 x 256 pixlar. Den totala tid som krävs för att en bildruta i vårt system är 1,0 sek, inklusive en 2-faldig scan genomsnittet. Beroende på önskad spatial upplösning, kan fältet ytterligare beskärs för att ökae tidsupplösning.
   4. Excite vid 488 nm, och samla utsläpp 500-520 nm för GFP, och 550-580 nm för OFP. Faktiska optimala värden kan variera med egenskaperna hos bildsystem.
   5. Den optimala lasereffekt för vårt system är mellan 6,0 och 6,4%. Den optimala lasereffekten kommer att variera för varje mikroskop system, men kommer helst vara så låg som möjligt och ändå producera en tolkningsbara bild. Använd en intern eller extern ström mätare för att övervaka förändringar i laser makt, som förekommer normalt över tid i varje optiskt system.
   6. Justera detektorförstärkningen och belysningsljus intensitet för att maximera den detekterade intervallet pixelvärden men undvika mättning av signalen, för så många celler som möjligt. Analyserar inte några celler som innehåller mer än 1% mättade pixlar. Bildens alla prover med samma mål, laser makt, skanna zoom, pixelstorlek, förstärkning och offset.

4. Image Acquisition

1. Leta i fokus PLA n av celler av intresse med hjälp av genomlysning för att minimera blekning av fluorescerande sond.
2. Efter lokalisering av en eller flera celler av intresse, samla en z-serie genom hela djupet av en typisk cell (ca 7 ^ m) med användning av en stegstorlek av 0,5 um.
3. Image andra celler av intresse på bilden, men inte bilden en enda bild under längre tid än 15 minuter. Efter 15 min på bilden, celler förlorar livskraft.

Fem. Analys

Mitochondrial ATP nivå bestäms genom att mäta förhållandet mellan mitGO-ATeam2 emission vid 560 nm och den vid 510 nm ²⁷ Den redoxtillstånd av organellen mäts som reduceras till oxiderade (R / O)-förhållande av mito-roGFP,. Dvs emission vid 510 nm vid excitering vid 470 nm dividerat med emission vid 510 nm vid excitering vid 365 nm. Innan beräkna förhållandet, subtrahera vi bakgrunden och fastställa ett tröskelvärde för bildpunkter som hör till den fluorescerande mitokondrier.

tält "> Offentlig sektor (t.ex. ImageJ ³⁰⁾ eller kommersiellt tillgängligt (t.ex. Volocity, Perkin-Elmer) programvara kan användas för analys av mito-roGFP1 eller mitGO-ATeam2. Beroende på vilket program som används för bildtagning och för analys, bilderna kanske först måste konverteras till ett annat format, t.ex. TIFF, innan du öppnar dem i analysprogram. Om bilder omvandlas, är det viktigt att kontrollera att bildpunktsvärden inte ändras under konverteringen. Analys av mito-roGFP1 uppgifter, med båda programmen beskrivs nedan. Program menyer och alternativ att välja inom varje meny är markerade med fet stil.

5,1 ImageJ analys

1. Öppna bilder och ändra typ till 32 bit: Bild → Typ → 32 bit.
2. Rita en region av intresse (ROI) i ett område där det inte finns några celler. Beräkna medelvärdet intensiteten i denna ROI: Analysera → Mät.
3. Subtrahera det beräknade medelvärdet bakgrund från stacken: Process → Math → subtrahera.
4. Använda subtraheras z-stack, hitta mitt slice och tröskeln på mitokondrier: Bild → Justera → Tröskel och klicka på Verkställ på Threshold fönstret. Tillämpa på alla skivor i stapeln. Kontrollera Ställ bakgrund pixlar till Nan.
5. Skapa förhållandet z stacken: Process → Bild Calculator Dela reducerade stapeln den oxiderade z stacken för mito-roGFP1 analys. Fördela 560 nm (ATP bunden) bild av de 510 nm (ATP obunden) bilden för mitGO-ATeam2 analys.
6. Rita en ROI runt området av intresse. Välj Analysera → Verktyg → ROI Manager och klicka på Lägg till registrera ROI. Flera regioner kan lagras i hanteraren. I ROI Manager, väljer allt ROI, välj sedan Mmalm → Multi-Mät för att mäta alla stack segment. Exportera data till ett kalkylark för analys.

5,2 Volocity analys

1. Importera bilder till en Volocity bibliotek och skapa en bildsekvens med 2 kanaler.
2. Rita en region av intresse (ROI) i ett område där det inte finns några celler. Välj: Verktyg → Ratio.
3. Använd Volocity att beräkna bakgrunden: Get From ROI.
4. Justera tröskeln att inkludera mitokondriella strukturer.
5. Markera alternativet för att tillämpa en regnbåge LUT till förhållandet kanalen. Intensiteten-modulerad kanal kan ge en mindre bullriga bilder för presentation, men det bör inte användas för kvantifiering av genomsnittliga förhållandet.
6. Välj Mätning, välj förhållandet kanal och rita en ROI runt det intressanta området. Mät förhållandet kanalen, exklusive nollvärden. Flera regioner kan väljas och mätaspå samma gång. Exportera data till ett kalkylark för analys.

Representative Results

Mätning mitokondrie redoxtillstånd med mito-roGFP

Här visar vi att mito-roGFP1 har det dynamiska området för att upptäcka förändringar i mitokondriernas redoxtillstånd från helt oxideras till minskade i levande jästceller, utan att påverka tillväxten jäst cell eller mitokondriell morfologi. Först hittar vi celler som uttrycker mitokondrier riktade GFP och roGFP1 växa i normal takt (Figur 1A). Den högsta tillväxttakten, mätt som maximal lutning på tillväxtkurvan under log-fas tillväxt och tiden för att nå maximal tillväxt, är likartad i celler som uttrycker Mito-GFP och mito-roGFP1. Vidare mitokondrier i jäst uttryckande mito-roGFP1 uppvisar vildtyp morfologi (Figur 1B). Specifikt är de rörformade, rikta längs mor-bud axel, och ansamlas på tips av mor och dotter celler. Eftersom mitokondriell dysfunktion ofta framkallar fragmentering, stöder denna normal morfologi idén att mito-roGFP1 görinte stör mitokondriell funktion.

För att bedöma det dynamiska området för mito-roGFP1, behandlade vi mid-logfas vildtyp jästceller med väteperoxid (H ₂ O ₂₎ och ditiotreitol (DTT), respektive, och mätte medelvärdet mitochondrial R / O-förhållandet för att bedöma mitokondrie redoxtillstånd (Figur 2). Titrering med _{H2O två} eller DTT 0-10 mM resulterar i en dosberoende förändring i genomsnittlig cellulär R / O-förhållandet med ett uppmätt intervall från 0,6 (under oxiderande betingelser) till 1,23 (under reducerande betingelser). Således är mito-roGFP1 en effektiv biosensor för analys av mitokondrie redoxtillstånd i levande celler.

Mito-roGFP1 erbjuder också subcellulära upplösning av mitokondriell redoxtillstånd. Denna subcellulära upplösning visar att mitokondrierna inom enskilda jästceller skiljer sig i relativ redoxtillstånd. Om mitokondrierna inom en enda jästcell är funktionellt olika, är det möjligt att deny är passivt eller aktivt segregerad (Figur 3). Sådan segregation kan bidra till mor-dotter ålder asymmetri och föryngring av dotterceller. Detta fynd understryker behovet av en biosensor med subcellulär upplösning av mitokondriell redoxtillstånd.

Det har länge varit känt ³¹ att ljuset kan åstadkomma förändringar av GFP-kromoforen. Vid exponering för höga intensitet 400 nm ljus, undergår roGFP1 photoconversion till en art med en annan emissionsspektrumet ^26. När photoconversion inträffar, finns det en minskning i grön emission från oxiderad mito-roGFP1 och en ökning av gröna emissionen vid excitering av reducerad mito-roGFP1, som ändrar förhållandet mellan R / O mito-roGFP1 (Figur 4B). Använda lågintensiv excitation (t.ex. belysning vid 40% med hjälp av de 400 nm LED i Colibri ljuskälla), finns det ingen signifikant photoconversion under den analyserade perioden (Figur 4C). Den p avses sätt att minska photoconversion är att excitera den oxiderade formen av roGFP vid 365 nm (se diskussion).

Mätning mitokondriella ATP med mitGO-ATeam2

MitGO-ATeam2 lokaliserar till mitokondrier när de uttrycks i däggdjursceller. ²⁷ Vi finner att mitGO-ATeam2 colocalizes med DAPI-färgade mitokondrie-DNA i jäst, och finns i rörformiga strukturer typiska för vildtyp jäst mitokondrier (Figur 5A). Således, kontrollerade vi att den mitokondriella målsökningssekvensen från däggdjur cytokrom c oxidas subenhet VIIIA lokaliserar sonden till mitokondrierna i jäst utan att störa mitokondriell morfologi. Dessutom finner vi att tillväxten av celler som uttrycker mitGO-ATeam2 är liknande till det av celler som uttrycker mitokondrier riktad GFP i både glukos och media glycerol (Figur 5B). Således förefaller uttryck av mitGO-ATeam2 icke skadlig för cellen eller mitokondrier.

_content "> Därefter testade vi huruvida mitGO-ATeam2 FRET reagerar på förändringar i mitokondriernas ATP-nivåer. För att göra detta, behandlade vi celler med antimycin A, ett medel som binder till cytokrom c reduktas, hämmar oxidation av ubiquinol i elektron transportkedjan , stör protongradient, och hämmar mitokondriella ATP produktionen. ²⁰ Medianen FRET förhållandet minskar i celler som behandlats med antimycin A (figur 6C).

Vittnat om att mitGO-ATeam2 är en effektiv biosensor för mitokondriell ATP, använde vi denna sond för att övervaka mitokondriella ATP-nivåer i jäst som förökades med en fermenterbar eller icke-fermenterbar kolkälla (Figur 6A och 6B). Minskningen av den totala fluorescerande ytan i glukos-odlade celler bekräftade att resultaten glukosrepression i en minskning av mitokondriell överflöd. Vi noterar cell-till-cell variation i nivån av mitGO-ATeam2. Intressant, indikerar våra preliminära data som finns ma y vara skillnader i ATP-nivåer i olika mitokondrier inom samma cell (Figur 6D).

Figur 1. Mito-roGFP1 detekterar mitokondriell redoxtillstånd utan att påverka klassar celltillväxtmedium eller mitokondriell morfologi. (A) Tillväxt av jäst som uttrycker mitochondria-riktade GFP eller ro-GFP1 mättes som förändringen i optisk densitet vid 600 nm som en funktion av tid av tillväxt i SC-Ura flytande medium vid 30 ° C. (b) Övre paneler: Normal mitokondriell morfologi och lokalisering kanal i RAW-bilder. Lägre paneler: Ratio bilder visar den minskade kanalen dividerat med oxiderade kanal (färg referens till höger). Bilderna visar effekten av tröskeln val på resultat. Den optimala tröskelvärdet inkluderar mitokondriella strukturer och exkluderar bakgrund.jove.com/files/ftp_upload/50633/50633fig1hires.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2. Mito-roGFP1 känner av förändringar i mitokondriell redoxtillstånd som svar på behandling med väteperoxid eller ditiotreitol. (AB) Mid-logfas jästceller som uttrycker mito-roGFP1 inkuberades i SC-Ura-media med ingen behandling (0) eller med de angivna koncentrationerna av H ₂ O ₂ eller DTT under 20 minuter vid 30 ° C. (A) är maximal intensitet projektioner av R / O mito-roGFP1 ratio bilder ovanpå genomlysning bilder, som visar cell konturer. Färgen referens för mito-roGFP1 visas uppe till höger. Bar:. 5 ^ M (B) Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3. Mito-roGFP1 erbjuder subcellulära upplösning av mitokondriell redoxtillstånd. En maximal intensitet projektion i R / O mito-roGFP1 förhållandet kanal överlagras på en sänd-ljusbild. Färgen referens för mito-roGFP1 visas uppe till höger. Bar: 5 iM. Denna särskilda cell har en genomsnittlig R / O mito-roGFP1 förhållande av 0,88. Men enskilda mitokondrier inom denna cell visar olika redox stater. De visade siffrorna är beräknade R / O mito-roGFP1 förhållande för olika mitokondrie reregioner. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 4. Högintensiv excitation leder till photoconversion och förändrad R / O-mito-roGFP1 nyckeltal. Mid-log-fas jäst uttryckande mito-roGFP1 belystes med 400 nm ljus vid 40% (A) eller 100% (B) effekt från en LED-ljuskälla , och fluorescens från reducerad och oxiderad Mito-roGFP1 fångades var 4 sek. Bilderna är största projektionerna i vilka färger representerar R / O-förhållande av mito-roGFP1 (se färgskala i nedre högra). Bar:. 5 ^ M (C) R / O-förhållande av mito-roGFP1 förblev konstant under avbildning perioden vid belysning vid 40% LED-effekt. Men vid belysning vid 100% LED makt, viobservera en tidsberoende förändring i R / O-förhållande av mito-roGFP1, som speglar photoswitching av fluoroforen. Svarta rutor, LED 40% effekt,. Grå diamanter, 100% LED Power Klicka här för att visa en större bild.

Figur 5. MitGO-ATeam2 lokaliserar till mitokondrier i jäst och påverkar inte jäst klassar celltillväxt. (A) Jästceller som uttrycker mitGO-ATeam2 odlades till mitten av log-fas, fixeras med paraformaldehyd och färgades med den DNA-bindande färgämne DAPI, såsom beskrivits tidigare . ¹⁹ bilder som visas är maximala intensitet projektioner av avfaltade z-serien. För enkelhetens skull har de mitGO-ATeam2 bilder som erhållits med hjälp av en konventionell GFP filter, så de bara utgör befolkningen obundna till ATP. Cell utrader visas med vitt. N: kärn-DNA. mtDNA: mitokondrie-DNA. Bar: 1 ^ m (B) Tillväxtkurvor av vildtyp jästceller som uttrycker mitochondria-riktade GFP eller mitGO-ATeam2 i glukos-baserad (SC) och glycerol-baserade (SGlyc) flytande medier vid 30 ° C.. Dessa data är genomsnittet av kvadruplikat för varje stam vid varje tidpunkt, och är representativa för två oberoende experiment. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 6. MitGO-ATeam2 mäter förändringar i ATP-nivåer i jäst mitokondrier vid subcellulär och suborganellar upplösning. (AB) Emission av mitGO-ATeam2 från GFP (510 nm) och OFP (560 nm) och kvantifiering av 560/510 nm emission förhållandet jäst celler odlade över natten i glucoSE-baserad (SC) (A) eller glycerol-baserade (SGlyc) (B) media. Färgen referens för 560/510 förhållandet kanal visas nere till höger. Bar:. 1 ^ m (C) Kvantifiering av 560/510-förhållande för celler förökades i SGlyc medier med eller utan antimycin A (2 | ig / ml) under 1 h vid 30 ° C. Minskningen i ATP-nivåer vid antimycin En behandling är statistiskt signifikant (Kruskal-Wallis signifikanstest). (D) 560 nm/510 nm förhållandet mitGO-ATeam2 av en mid-log-fas vildtypscell förökas på SC media. Färgen referens för 560/510 förhållandet kanal visas nere till höger. Den Cellkonturen visas i vitt. Medelvärdet 560/510 nm förhållande för hela cellen är 0,43. De visade siffrorna är de 560/510 nm förhållanden av specifika områden i mitokondrier. Bar: 1 pm. Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

Här beskriver vi metoder att använda Mito-roGFP1 och mitGO-ATeam2 som biosensorer för att bedöma mitokondrie redoxtillstånd och ATP-nivåer i levande jästceller. Vi finner att uttrycket av plasmidburna Mito-roGFP1 eller mitGO-ATeam resulterar i kvantitativ inriktning till mitokondrierna, utan någon uppenbar effekt på mitokondriell morfologi eller distributionen eller på cellulär tillväxt. ³ Mito-roGFP1 kan upptäcka förändringar i mitokondriernas redoxtillstånd från starkt oxideras till mycket reducerade tillstånd. Likaså kan mitGO-ATeam mäta förändringar i mitokondriella ATP-nivåer som förekommer i jäst genomgår respiration-driven tillväxt och jäst behandlades med en andning hämmare. Eftersom båda biosensorer erbjuder subcellulära upplösning, kan de upptäcker heterogenitet i redoxtillståndet eller ATP nivåer av mitokondrier inom enskilda celler. Slutligen, eftersom båda biosensorer är ratiometriska sönder, är de inte påverkas av förändringar i koncentrationen eller variabilitet i provtjocklek eller sjukumination. Dessa sonder ger en minimalinvasiv metod för att studera mitokondriernas funktion med subcellulärt upplösning i levande celler.

För att framgångsrikt tillämpa denna metod, bör bilderna förvärvas med den högsta möjliga signal-till-brus-förhållande. Ett viktigt första steg är att undersöka celler 10-20 transformantkolonier under mikroskop och välj dem med robust fluorescens och normal mitokondriell morfologi och tillväxttakt. Vidare skall avbildningsbetingelser optimeras för att producera hög, men inte mättar, intensiteter utan att orsaka fotoskador till det fluorescerande proteinet eller cellerna. Några celler i en population (<1%) kan ha ovanligt hög eller låg total fluorescens på grund av variation i plasmidkopieantalet, dessa kan lämnas utan avseende i favör av att fånga tolkningsbara bilder av de flesta celler.

Medan fördelarna med mito-roGFP är klart, är det också viktigt att vara medveten om potentiella fallgropar. Vi upptäckerskillnader i mitokondriell redoxpotential inte bara med kolkälla-inducerade skillnader i cellernas ämnesomsättning, men också vid förökning av jäst i olika partier av samma medium. Därför måste man vara försiktig när man väljer celltillväxtmedium för mitokondriella redoxmätningar. Även om mito-roGFP erbjuder oöverträffad rumsliga upplösningen i mitokondriell redoxtillstånd, är temporala upplösningen i roGFP inte tillräckligt för att detektera skurar av ROS som är associerade med ROS signaltransduktion ^31. Slutligen måste man vara försiktig när man väljer excitationsvåglängden och intensitet för den oxiderade formen av roGFP. Belysning vid 400 nm hetsar optimalt de oxiderade arter av roGFP. Emellertid exciterar man reducerade roGFP i större utsträckning jämfört med excitation vid 365 nm. Detta leder till minskad känslighet för mätning av mitokondriell redoxtillstånd. Vidare, exponering av mito-roGFP1 till högintensiv belysning vid 400 nm leder till photoconversion av proteinet till en spectalet med förändrade spektrala egenskaper. Vi har inte sett photoconversion vid högintensiv belysning vid 365 nm. Därför rekommenderar vi excitation med 365 nm om möjligt.

MitGO-ATeam2 har också begränsningar. Till exempel, eftersom mitGO-ATeam2 är själv ett protein som den kan skadas av cellulära förolämpningar inklusive reaktiva syreradikaler, som kan hämma dess biosensoraktivitet. Dessutom måste GFP och OFP emissionsvåglängder (510 och 560 nm) lösas för FRET analys, vilket kan vara svårt på konventionella fluorescensmikroskop.

Till skillnad från in vitro enzymanalyser, dessa levande cellanalyser rapporterar relativa förändringar i mitokondriernas ATP eller redoxtillstånd, och mäter inte den absoluta koncentrationen av ATP eller minskas cystein. Även om en standardkurva teoretiskt skulle kunna genereras genom att mäta svaret hos sensorn proteiner i lösning, kan detta inte gälla annan molekylär miljö inom mitokondrier. Ther öre, dessa analyser ger ett sätt att jämföra celler under olika förhållanden. Dessutom avbildning varierar, så det exakta förhållandet som erhålls på en avbildning inställning inte kan kopieras på en annan.

Dessa tekniker för förhållandet avbildning kan anpassas för andra ratiometriska indikatorer, bland annat roGFP eller GO-ATeam isoformer och andra funktionella prober. Valet av brett fält eller konfokalmikroskopi kommer att bero på sonden och den rumsliga upplösningen krävs. Den brett fält metod användes här för mito-roGFP eftersom det tillåter excitation vid 365 nm, vilket förbättrar känsligheten och stabiliteten av sensorn. Den konfokala metoden med en spektral detektor, som används här för mitGO-ATeam, erbjuder ett bekvämt sätt att eliminera utsläpp crossover genom att justera de spektrala upptäckt fönstren. Det är dock möjligt att utföra liknande experiment i brett fält mikroskopi genom att använda anpassade filter eller eliminera crossover beräkningsmässigt.

ntent "> Den vanligaste svårighet i denna typ av att avbilda experiment är otillräcklig signal. Imaging hårdvara (särskilt objektivlinsen och detektor) är kritisk för att samla tillräckligt med signal för att tolka data.

Tröskelfunktionen stegen har stor inverkan på resultaten, eftersom införandet av bakgrunden pixlar kan dämpa eventuella trender i de erhållna förhållanden. Automatiska metoder är att föredra, men på grund av begränsad signal, är manuell tröskling ofta den bästa tillgängliga metoden. Om manuella gränsvärden används, bör de kriterier som formuleras så bra som möjligt, och analysen kan behöva utföras blinda eller genom olika praktiker att påvisa reproducerbarhet. Kontrollexperiment med antimycin A (för mitGO-Ateam2) och H ₂ O ₂ eller DTT (för mito-roGFP) kan användas för att bekräfta de förutsagda förändringar i fluorescens nyckeltal.

Mito-roGFP och mitGO-ATeam2 är icke-invasiva, ratiometriska prober för övervakning mitochondrial fitness i levande jästceller. De ratiometriska sensorer som används här var riktade till mitokondrierna genom fusion av mitokondrier-specifika signalsekvenser. Andra cellulära utrymmen kunde studeras med tillsats av lämpliga målsökningssekvenser till de ursprungliga sensorer. Dessutom är det möjligt att kombinera någon av dessa sensorer med kompletterande fluorescerande markörer (t.ex. för organeller eller signalerande faktorer) eller sensorer (t.ex. för kalcium) att samtidigt mäta flera processer i levande celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagents
Antimycin A	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	1397-94-0	Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution.
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu			Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine
Valap			Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin
			Equipment and Software
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides	Thomas Scientific (Swedesboro, NJ)	3050	Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm
High-performance coverslips, No. 1.5, 18x18 mm	Zeiss (Thornwood, NY)	474030-9000-000	These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5	Fisher Scientific (Pittsburgh, PA)	12-545E	Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm)
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective	Nikon (Melville, NY)
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software	Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan)
Volocity 3D Image Analysis software	Perkin Elmer (Waltham, MA)		Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement
ImageJ software	National Institutes of Health (Bethesda, MD)		http://rsb.info.nih.gov/ij/