Summary
Den zebrafisk, en liten tropisk fisk, har blivit en populär modell för att studera geners funktion under ryggradsdjur utveckling och sjukdom. Den temporala och spatiala uttrycket av målgener kan bestämmas genom
Abstract
Denna artikel fokuserar på hel-mount in situ hybridisering (WISH) av zebrafisk embryon. Önskan teknik underlättar bedömningen av genuttryck både vad gäller fördelning till vävnader och utvecklingsstadiet. Protokoll beskrivs för användning av önskan zebrafisk embryon med antisense RNA-prober märkta med digoxigenin. Prober genereras genom införlivande av digoxigenin-kopplade nukleotider genom transkription in vitro av genprodukter mallar som har klonats och linjäriserad. De chorions av embryon skördas vid definierade utvecklingsstadier avlägsnas före inkubering med specifika prober. Genom att följa ett tvättningsförfarande för att avlägsna överskott sond, är embryon inkuberas med anti-digoxigenin-antikropp konjugerad med alkaliskt fosfatas. Genom att använda ett kromogent substrat för alkaliskt fosfatas, kan specifikt genuttryck bedömas. Beroende på graden av genuttryck hela förfarandet kan slutföras inom 2-3 dagar.
Introduction
Den zebrafisk (Danio rerio) har framträtt som ett kraftfullt djurmodell för studier av ryggradsdjur utveckling, sjukdom, beteende, och i-drug screening 1-3. Zebrafish embryon kan erhållas i stort antal från en enda passage. Befruktning och utveckling sker ex utero och optiskt klara embryona utvecklas snabbt. Kritiska utvecklingsmässiga händelser inträffar under de första 48 timmar efter befruktning (HPF). Detta inkluderar utseende orgel primordia och inledandet av cytodifferentiation. Knockdown eller över-uttryck av proteiner kan åstadkommas genom mikroinjektion av embryon med antisens morfolino (MO) oligonukleotider eller mRNA respektive vid en eller två cell stadium (0,75 hpf).
Önskan zebrafiskembryon underlättar studiet av tid och rum uttryck av specifika gener av intresse. Tillämpning av WISH tekniken efter mikroinjektion av embryon med mRNA eller MO till över-uttrESS eller knockdown specifika nivåer protein avslöjar differentiell reglering av andra gener.
Förändringar i genexpressionsmönster kan korreleras med fenotypiska förändringar och avslöja funktionen av målgener under tidig organogenesen. Eftersom prober kan framställas och lagras i förväg, kan den ISH teknik kunna användas för att avslöja genexpressionsmönster minst 20 gener i taget med sex-brunnar och skräddarsydda korgar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Hela montering in situ hybridisering av Zebrafish embryon
1.1 Beredning av embryon
- Samla embryon vid de erforderliga utvecklingsstadier. Vänligen se Kimmel et al. 5 för linda beskrivning.
- Ta chorions manuellt med pincett (Dumont urmakare pincett nej. 5).
- Fix embryon i en 4% lösning av paraformaldehyd (PFA) tillverkad i PBS (fosfatbuffrad saltlösning) över natten vid 4 ° C.
- Tvätta embryon med PBS minst 3x under 5 minuter vardera vid rumstemperatur.
- Förvara embryon i 100% metanol (MeOH) vid -20 ° C fram till användning för framtida tillämpning av tekniker inklusive hel-mount in situ hybridisering.
- Freeze staged embryon i flytande kväve för RNA-extraktion och förvara vid -80 ° C.
- Utdrag RNA från iscensatta embryon och syntetisera cDNA för PCR-amplifiering och efterföljande kloning. 1.2 Syntes av digoxygenin-märkta RNA-sonder
- PCR-amplifiering och genkloning för sond mall. Setup PCR-reaktion med en total volym av 50 pl såsom visas i tabell 1. Använd mer genomiskt DNA eller mindre cDNA i PCR-reaktionen som templat. Inkludera 10 tid min förlängning vid 72 ° C efter den sista cykeln för att säkerställa att PCR-reaktionsprodukterna är fulla längd och 3 'adenylerad för att underlätta TOPO kloning.
- Verifiera storleken av PCR-produkten med hjälp av agarosgelelektrofores. Den uppskattade storleken av PCR-produkten för probsyntes nära 1 kb.
- Var särskilt försiktig för att undvika nukleas kontaminering genom att utföra experiment under sterila förhållanden och med sterilt vatten. I händelse av att flera produkter iakttas, gel-rena lämpligt dimensionerad PCR-produkten innan du fortsätter med kloning med TOPO TA Kloning Kit. Optimera PCR-reaktionen för att eliminera förekomsten av utsmetning och flera band.
- Utför Friluftskartan kloning reaktion som anges i tabell 2. Kombinera TOPO vektor och PCR-produkt och inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- Införliva / introducera Friluftskartan kloning produkten i ett skott kompetenta celler. Thans process kallas transformation.
- Inkubera de transformerade cellerna vid 37 ° C under minst en timme vid 260 rpm för att säkerställa uttrycket av de gener för antibiotikaresistens. Plate omvandlingen mix (50-100 | il) på förvärmd Luria Bertani (LB)-agarplattor innehållande 50 | ig / ml ampicillin och X-gal. Inkubera vid 37 ° C över natten.
- Bestämma närvaron av insatsen baserat på utseende av vita eller ljust blå kolonier. The TOPO-vektorn innehåller lacZ-genen, som kodar β-galaktosidas. I närvaro av X-gal, bildar produktion av β-galaktosidas blå färg. DNA ligerades in i plasmiden stör bildandet av funktionella β-galaktosidas och vita kolonier produceras. Vita kolonier eller ljusblåa kolonier bekräfta närvaron av insatsen.
- Plocka de vita kolonierna från agarplatta med sterila pipettspetsar och placera dem i sterila 10 ml rör innehållande 4 ml LB-medium och kultur vid 37 ° C i skakande inkubatorTor natten vid 200 rpm.
- Rena plasmid-DNA med hjälp av plasmid-DNA-kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Linjärisera cDNA följande plasmidrening genom uppslutning 5 ig av cDNA för varje sond med lämpligt restriktionsenzym som har ett unikt ställe beläget 3 '(för sense-prober) eller 5 "(för antisense-prober) till insatsen.
- Rena den lineariserade DNA med användning av fenol / kloroform-extraktion metod. Lägg lika stor volym fenol / kloroform, vertex kraftigt under 30 sekunder, centrifugering under 3 min vid 13000 rpm vid 4 ° C. Överför övre vattenfasen i rena rör och tillsätt lika stor volym kloroform. Snurra under 3 min vid 13000 rpm vid 4 ° C. Överför övre vattenfasen i rent rör. Tillsätt 10% natriumacetat (3 M) och 2,5 gånger volym av 100% etanol för att fälla ut DNA och förvara vid -20 ° C över natten. Snurra under 15 min vid 13000 rpm vid 4 ° C. Avlägsna etanol och tvätta pelleten med 75% etanol. Protokollet kan stoppas och DNA kan sT-opereras vid -20 ° C och återupptogs nästa dag. Snurra under 10 min vid 10000 rpm vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten försiktigt och torka pelleten under 2 minuter vid rumstemperatur. Återsuspendera pelleten i 10 | il DEPC behandlat vatten och inkubera vid 55 ° C under 20 min. Kvantifiera DNA-koncentrationen med hjälp av UV-spektrofotometer.
- Bedöm renhet genom agarosgelelektrofores med användning av 1 | il av DNA på 1% agarosgel och igång i ungefär 30 min.
- Konfigurera RNA märkning reaktion. Med användning av ett RNas-fritt reaktionsflaska, tillsätt 1-5 ig renat templat-DNA till steril, RNas-fritt, DEPC-behandlat, dubbeldestillerat vatten till en volym av 13 | il. Chill reaktionen flaskan på is och lägg till följande reagenser (se tabell 3):
- Blanda reagenset försiktigt sedan samlas på botten genom kort centrifugering vid 2000 rpm under 30 sekunder vid rumstemperatur och inkubera reaktionsblandningen under 2 h vid 37 ° C.
- Avlägsna templat-DNA genom tillsats av 2 | il RNas-fritt DNas I. Inkubera under 30 min vid 37 ° C och avsluta reaktionen genom tillsats av 2 pl 0,2 M EDTA (pH 8,0).
- Fällning reaktionsprodukterna genom tillsats av 2,5 | il 4 M LiCl och 75 ^ il 100% etanol. Blanda lösningen och förvaras vid -20 ° C under 45 min or förvaras vid -20 ° C över natten och protokollet återupptas nästa dag.
- Centrifugera suspensionen under 30 min vid 13000 rpm vid 4 ° C, därefter tvätta pelleten med 500 pl 70% etanol förvarades vid -20 ° C, centrifugera i en ytterligare 10 min, torka i 2 minuter, och återsuspendera i 50 | il och inkubera vid 30 min vid 37 ° C.
- Verifiera sonden kvalitet och integritet genom att köra 1-2 ml på 1% agarosgel under cirka 30 minuter. Detta bekräftas genom närvaron av enda produkt körs vid den förväntade storleken på gelén.
- Kvantifiera koncentrationen av sonden genom mätning av mängden av RNA med hjälp av spektrofotometer. Utbytet från denna reaktion är ca 10 mikrogram av RNA (100-200 ng / pl).
- DAG 1
- Rehydratisering
- Förbered korgar med nylonnät (mindre än 1 mm porstorlek) och Eppendorf-rör. Konstruera korgarna med cutting Eppendorf-rör (1,5 ml) för att avlägsna de koniska ändar. Att identifiera enskilda korgar använder olikfärgade rör och ta bort den övre fälgar från hälften av dem.
- Skär små bitar av nylonnät för att täcka de skurna ändarna av Eppendorf-rör. Stick de skurna ändarna av rören till nylonnät genom upphettning på en elektrisk värmeplatta (in mellan medelhög till hög) i ett dragskåp. När svalnat avlägsna överskottet nylonmesh från korgarna och lagra dem i 100% metanol vid rumstemperatur.
- Bered lösningar av metanol i PBS (75% [vol / vol [metanol, 50% [vol / vol] metanol och 25% [vol / vol] metanol) med de första tre brunnarna i sex-brunnar följt av 100% PBST (fosfatbuffrad saltlösning innehållande 0,1% Tween-20) under de kommande tre brunnar.
- Ämne embryon in situ hybridisering proceduren med hjälp av skräddarsydda korgar som visas i Figurea 1a och b.. Använd RNase-fria lösningar upp till hybridization steg i 6-brunnars plattor (4 ml / brunn). För att uppnå detta, placera upp till sex korgar i den första brunnen. Placera korgen med fälg följt först av korgar utan fälgar i olika färger arrangerade i följd. Använda detta arrangemang upp till 6 genuttryck mönster kan bestämmas samtidigt.
- Placera dehydrerade embryon av samma utvecklingsstadium till samma korg (se figur 1).
- Rehydrera embryon genom att flytta korgar från en bra i sex-brunnars platta till nästa (5 min för varje steg). Använd sex brunnar fyllda med lämplig buffert. Embryon utsätts för varje utspädning gång. På detta sätt embryon tvättas 6x, 5 min / tvätt. Rehydrering av de dehydratiserade embryon uppnås genom att ersätta metanol med PBS och sedan genom tvättning 3x med 100% PBST.
- Permeabilization Digest de rehydrerade embryon med proteinas K (10 | ag / ml) vid rumstemperatur för att göra dem permeabla såsom visas i tabell 4
Fosterstadiet (timmar efter befruktning) Digestion Period (Proteinas K) Upp till 6 15 sek 6-12 30 sek 12-18 3 min 24 12-15 min 48 25-30 min 72 40 min 96-120 50 min Tabell 4. Permeabilization reaktion.
- Postfixation och PBST Tvättar
- Fix embryon genom att inkubera i 4% paraformaldehyd (vikt / volym) i 1 x PBS under 20 min.
- Avlägsna återstående paraformaldehyd genom att tvätta embryon 3x, 5 min / tvätt, i 1x PBST.
- Acetylering Förbered acetylering blandning (125 il trietanolamin och 27 pl ättiksyraanhydrid i 10 ml DDH 2 O) och inkubera embryon två gånger under 10 minuter vardera. För att minimera endogen fosfatasaktivitet, förbereda acetylering blandning fräsch när det behövs. För att ta bort överskott av reagens, tvätta embryon två gånger i PBST (10 min / tvätt)
- Förhybridisering Prehybridize embryon genom att överföra embryon från korgar till 1,5 ml sterila Eppendorf-rör och inkubering med 200 pl hybridiseringsblandning för 2-4 h i en 70 ° C vattenbad.
- Preadsorption av Antikropp Ta bort ca 50 embryon från korgarna och överföra dem till ett 1,5 ml sterilt Eppendorf-rör. Inkubera med anti-DIG-AP (1:500) antikropp med användning av blockeringsbuffert (1x PBST, 2% kalvserum [volym / volym], 2 mg / ml bovint serumalbumin [BSA]) vid rumstemperatur under 2-4 h, och sedan lagra vid 4 ° C över natten. Ta bort från inkubatorn på morgonen end låta embryon att nå rumstemperatur.
- Hybridisering Lägg 100-200 ng sökfragment till förhybridiserades embryon och inkubera över natten vid 70 ° C i vattenbad.
- Rehydratisering
- DAG 2
- SSC (Saline-natriumcitrat) Tvättar
- Placera 50 ml rör av hybridiseringsblandningen (HM), 2X SSC och 0,2 x SSC i en bägare med vatten i en 70 ° C vattenbad och Förvärm dem under minst 20 min. Avlägsna blandningen hybridiseringsreaktion innehållande proben, tillsätt 1 ml förvärmd hybridiseringsblandning till rören och inkubera under 15 min vid 70 ° C. Fyll sex-brunnars plattor med olika utspädningar av förvärmd HM i 2 x SSC genom att ersätta 100% HM genom 50% till 25% HM för att avlägsna överskott av reagens.
- Medan du väntar, fyller sex-brunnar med 2x SSC för tvättar och hålla dem vid 70 ° C.
- Efter 15 min plats embryon från röret till korgarna förvaras i sex brunnar fylls med utspädnings of HM med 2x SSC och tvätta de hybridiserade embryon genom att flytta korgen från en brunn till nästa (15 min vardera i en 70 ° C vattenbad). Tvätta embryon 2x, 15 min / tvätt, i 100% 2x SSC vid 70 ° C.
- Ställ annan vattenbad vid 65 ° C. Fyll sex-brunnar med 0,2 x SSC för hög stringens tvättar för att undvika ospecifik hybridisering av transkript med sonden.
- Efter embryona tvättades två gånger med 2 x SSC vid 70 ° C, följer ytterligare två 30 min tvättar i 0,2 x SSC vid 65 ° C.
- PBST Tvättar Förbered sex-brunnars plattor med successiva utspädningar av 0,2 x SSC i PBST enligt följande: 75% (vol / vol) 0,2 x SSC, 50% (vol / vol) 0,2 x SSC, 25% (vol / vol) 0,2 x SSC, och de återstående två-brunnar med 100% PBST. Tvätta de hybridiserade embryon genom att flytta korgen från en brunn till nästa (5 min för varje steg vid rumstemperatur med hjälp av en vippa).
- Förinkubering preinkubera embryon för 3-4 timmar vid rumstemperatur i blocking buffert (1x PBST, 2% kalvserum [volym / volym], 2 mg / ml BSA).
- Inkubering med anti-DIG embryon Antibody Inkubera med en lösning av anti-DIG-AP-antikropp (1:5000) i blockerande buffert över natten vid 4 ° C med försiktig omrörning.
- SSC (Saline-natriumcitrat) Tvättar
- DAG 3
- PBST Tvättar Förbered sex-brunnar med 4 ml / brunn PBST. Tvätta ruvade embryon genom förflyttning korgarna i sex-brunnar innehåller PBST 6x för perioder om 15 minuter. Embryon kan lagras vid 4 ° C och protokollet återupptogs nästa dag.
- Prestaining Prestain embryona genom tvättning 2 x för 15 min med prestaining buffert vid rumstemperatur under försiktig omrörning före inkubation i närvaro av BCIP (5-brom-4-klor-3-indolylfosfat) och NBT (nitroblå tetrazolium). BCIP och NBT är de substrat som används för att färga utvecklingen av alkaliska fosfataser. Eftersom sonderna fästs med alkaliskt fosfatas the utveckling av lila färg indikerar uttrycket av målgenen. Embryon kan lagras vid 4 ° C och protokollet återupptogs nästa dag.
- Färgning
- Inkubera embryon vid rumstemperatur i mörker med BCIP och NBT i 30 min.
- Övervaka färgningsreaktionen var 30 min med hjälp av ett stereomikroskop. Reaktionstiderna varierar från 15 min-16 h beroende på nivån av genuttryck. Reaktionstider är kortare för högt uttryckta gener och längre för svagt uttryckta gener. Sense sonder kommer att upptäcka signaler om den intressanta genen uttrycker komplementär antisense (AS) transkript.
- Stoppa reaktionen Efter att den önskade färgningsintensitet uppnås, stoppa reaktionen genom att överföra korgar innehållande embryona till brunnar innehållande stopplösning (1 x PBS, pH 5,5, 1 mM EDTA, 0,1% Tween). Detta kommer att undvika ytterligare utveckling av färgen. Skölj embryon för 10 min 2x på en rocker med mild agitation vid rumstemperatur.
- Postfixation
- Inkubera embryon i paraformaldehyd 4% (vikt / volym) i PBS under 20 min.
- Tvätta embryona (5 min / tvättning) tre gånger med PBST för att avlägsna rester av paraformaldehyd. Förvara de fasta embryon i stopp-lösning i mörker vid 4 ° C.
- Montering, Observation och Image Acquisition
- Överför embryon till en sex-brunnar innehåller 100% glycerol med minsta möjliga volym PBS. Placera sex brunnar på en rocker och skaka försiktigt över natten vid rumstemperatur i mörker.
- Placera embryon i 100% glycerol och sedan iaktta signalen under ett stereomikroskop.
- Förvärva bilder och spara som TIFF-format eller någon annan typ som tillåter produktion av högkvalitativa bilder med hjälp av bildbehandlingsprogram som Photoshop (figurerna 3-6).
- För att uppnå dubbel märkning den metod som beskrivs ovan från 1,1 - 1.3.1.7 används men inkluderar samtidig inkubering av både digoxigenin och fluorescein märkta prober under hybridisering.
- Följ samma procedur för post-hybridisering tvättar nämligen SSC och PBST tvättar (steg 1.3.2.1 och 1.3.2.2) och blockering inkubationer (steg 1.3.2.3). Utför antikropp och färgning reaktioner sekventiellt som beskrivs nedan.
- Inkubera embryon med AP-kopplad-anti-digoxigenin antikropp (1:5000) vid 4 ° C med försiktig omrörning.
- Tvätta och inkubera med BCIP-NBT (steg 1.3.3.1 - 1.3.3.6).
- Efter upptäckt, tvätta embryona två gånger med PBST vid rumstemperatur under 20 min.
- Inkubera embryon vid 65 ° C i PBST med 1 mM EDTA under 30 minuter för att inaktivera anti-digoxigenin antikropp.
- Inkubera embryon i 100% metanol följt av utspädning i 75%, 50%, och 25% metanol with PBST och tillbaka till PBST under 1 timme.
- Inkubera embryon över natten med AP-kopplad fluorescein (1:2000) i blockerande buffert vid 4 ° C med försiktig omrörning.
- Tvätta embryon med PBST (steg 1.3.3.1) och pre-fläck embryon två gånger under 15 minuter med pre-färgning buffert (0,1 M Tris-HCl, pH 8,2) vid rumstemperatur under försiktig omrörning före inkubation i närvaro av Fast Red . Protokollet kan stoppas och embryon kan lagras vid 4 ° C under försiktig omrörning och återupptogs nästa dag.
- Lös upp en Fast Red tablett i 2 ml färgning buffert omedelbart före användning.
- Starta färgning reaktionen genom att placera embryon i färgningsbuffert med Fast Red reagens.
- Stoppa färgreaktion när önskad färgningsintensitet uppnås. Det kan ta från några timmar vid rumstemperatur till en eller två dagar natten när färgning vid 4 ° C. Stoppa reaktionen omedelbart om färgningsintensiteten inte utvecklas vidare eller börjar att visa icke-specifikten i jämförelse med den meningen kontroll.
- Följ de förfaranden som beskrivs ovan för de återstående stegen nämligen efter fixering, montering, observation och bild förvärv (steps1.3.3.5 och 1.3.3.6).
| Reagens | Volym |
| Mall-DNA | 100 ng |
| PCR-buffert (10x) | 5 | il |
| dNTP (10 mM) | 2 pl |
| Primers (10 mM) | 1 pM vardera |
| Tillsätt vatten till en slutlig volym av | 49,7 | il |
| Taq-polymeras (5 enheter / & #956; l) | 0,3 | il |
| Reaktion Volym | 50 | il |
Tabell 1. PCR-amplifieringsreaktionen.
Tabell 2. TOPO kloning reaktion.
| Reagens | Volym |
| NTP märkning blandning (10x) | 2 pl |
| Transkription buffER (10x) | 2 pl |
| Protector RNas inhibitor | 1 il |
| RNA-polymeras eller SP6 | |
| RNA-polymeras T7 | 2 pl |
| Slutlig volym | 20 | il |
Tabell 3. RNA märkning reaktion.
1.3 Hela montering in situ hybridisering
I n situ hybridisering
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använda protokoll med 50 embryon per korg (per gen / per experimentell betingelse) uttrycket mönster av denna gen kan uppnås i ett experiment. Nästan alla embryon visar liknande uttrycksmönster för en särskild gen. Representativa exempel på in situ hybridisering färgning visas i Figurerna 3-6.
Både sense och antisense riboprober syntetiserades från cDNA: n som motsvarar PC5.1, PC5.2 6, SCL/tal-1 7, gata-1 8,9, FLK / kdrl 10, shh 11, dlx2 12, fkd7 / foxa1 13, har insulin 14,15, och trypsin 16 konstruerats genom att amplifiera ett segment av den fullängds mRNA med användning av Taq DNA-polymeras, och klonades in i pCRII-TOPO (Invitrogen). Äktheten av enskilda amplikonerna bekräftades genom sekvensering. Efter kontroll av klonen orientering, var motsvarande antisense riboprobes syntetiseradevia de protokoll 17 med modifieringar 18,19 som beskrivs här använder antingen SP6 eller T7 RNA-polymeraser. Stegen i hela montera in situ hybridisering illustreras kortfattat i figur 2. Lila färgning observerades efter hybridisering med riboprobe ränta utgör både överflöd och platserna för uttryck av viss gen. Till exempel PC5.1 visar mycket diskret uttryck i den främre och bakre delen av öron vesikler och sidolinje primordium på 24hpf och är starkt lokaliserade inom de främre och bakre sidolinje neuromasts med 72 HPF (Figur 3). Däremot PC5.2 shows ubiquitous uttryck i CNS med distinkt regionaliseringen inom somites, öron vesikler och pronephric kanal och uttrycks starkt i levern och tarmen vid 96 HPF (Figur 4). Frånvaro av genexpression vid användning av respektive sense ribosonder tjänar som en negativ kontroll. (
Figur 1. Framställning och användning av Eppendorf-nylon mesh korgar att hålla iscensatt embryon. En väl rymmer sex Eppendorf-nylonnät korgar. Bilden visar 6-well sterila plattor innehållande sex Eppendorf-nylonnät korgaranvändas för de efterföljande utspädningar av metanol i PBS.
Figur 2. Diagram som visar de olika stegen i hela montera in situ hybridisering teknik. Efter fixering staged embryon kan lagras i metanol vid -20 ° C tills de användes. Sönder kan syntetiseras i förväg och hölls vid -80 ° C. Lagra sönder i små portioner är lämpligt om de ska användas under långa perioder. I allmänhet hela montering in situ hybridisering experiment kan fyllas i 3 eller 4 dagar. Den färgningsreaktionen för svagt uttryckta gener kommer att ta upp till 16 timmar vid rumstemperatur eller längre när färgningsreaktionen sker vid 4 ° C Klicka här för att visa en större figure.
Figur 3. Uttrycket av PC5.1 genom hela montering in situ hybridiserings-analyser utfördes med användning av 24 HPF och 72 HPF rekvisitabilar embryon. (A) sidovy av 24 HPF embryon visar mycket diskret uttryck av PC5.1 inom den främre och bakre delen av öron vesikler och sidolinje primordium hjälp PC5.1 antisense riboprob. Vid 72 hpf specifik färgning observerades inom de främre och bakre sidolinje neuromasts. (B) Avsaknad av genuttryck med PC5.1 känsla riboprobe tjänar som en negativ kontroll. Klicka här för att visa en större bild .
gether.within-sida = "alltid"> 
Figur 4. Vid 24 HPF och 96 HPF hela montering hybridisering in situ analyser av PC5.2 utfördes med användning PC5.2 antisens-och sens-riboprober. (A) Lateral vy av 24 HPF embryon visar ubiquitous uttryck inom CNS, somites öron vesikler och pronephric kanal. Specifik färgning i levern och tarmen ses vid 96 HPF hjälp PC5.2 antisense riboprob. (B) Avsaknad av genuttryck med PC5.2 känsla riboprobe tjänar som en negativ kontroll. Klicka här för att visa en större bild .
oad/50644/50644fig5.jpg "width =" 500px "/>
. Figur 5 Whole-mount i situ hybridisering analyser vid 24 HPF hjälp SCL/tal-1 riboprobe visade färgning inom de bilaterala kraniala cellerna och i den mellanliggande cellmassan (ICM), gata-1 riboprobe färgningen ses i ICM, Flk / kdrl uttryck inom hindbrain, huvud, och intersegmental fartyg och i ICM. Färgningen för shh observerades i notochord.
. Figur 6 Hel-mount i situ hybridisering analyser vid 34 HPF hjälp dlx2 riboprobe avslöjade expression av dlx2 i telencephalon, diencefalon, hypotalamus, och cranial ectomesenchymal valv, den fkd7/foxa1 uttryck vid 24 HPF ses främst i golvet psent och hypochord, insulin färgning observeras i endokrina pankreas och trypsin uttryck i exokrina pankreas.
Figur 7. Adekvat permeabilization och lämplig hybridiseringstemperatur är avgörande för tydlig i situ hybridisering signaler. Hela montering i situ hybridisering analyser vid 24 HPF och 48 hpf med ett shh riboprobe avslöjade uttryck inom notochord och golvplattan utan bakgrund signal när embryona permeabiliseras av proteinas K-spjälkning för 12-15 min och hybridiserades vid 70 ° C. Ofullständiga expressionsmönster och höga signaler bakgrund observerades då embryona utsattes för otillräcklig matsmältning (5 min proteinas K-behandling) eller hybridiserades vid låg temperatur (60 ° C). Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utvecklat bättre metoder för att visualisera RNA med hög upplösning. In situ hybridiserings-försök utförs med hjälp av enkla skräddarsydda korgar med porösa bottnar (figur 1). Embryon bearbetas med RNase-fria lösningar i 6-brunnars plattor vid rumstemperatur under sterila betingelser.
Segregera embryon korgar är tillverkade av olika färgade Eppendorf-rör. Korgar med eller utan en kant används för enkel orientering och att identifiera de embryon i korgen som motsvarar en särskild sond.
Förhybridisering vid 65 ° C och hybridisering vid 70 ° C med 50% avjoniserad formamid befanns vara särskilt viktigt att erhålla hög upplösning signaler. Dessutom inkubera embryona två gånger med alkalisk Tris-buffert under 15 min efter PBST tvättar efter inkubation med anti-DIG-antikropp och före inkubering i närvaro av BCIP ochNBT underlättar uppkomsten av högkvalitativa tydliga signaler. I våra händer vi upplevt att permeabilisering och fastställande av embryon för optimal tid och hybridisering vid 70 ° C var mycket kritisk att få tydliga signaler. Otillräcklig permeabilisering producerade höga bakgrundssignaler. Förlängd permeabilisering eller otillräcklig fixering resulterade i nedbrytningen av embryon medan förlängd fixering inhiberade signaldetektering. Hybridisering mellan 55-60 ° C också producerade höga bakgrundssignaler (Figur 7).
Känslan sonden kommer att upptäcka en signal för AS transkript om den intressanta genen kodar antisense (AS) transkript. Efter färgning reaktionen slutade placera embryon i metanol under 30 min eller längre omvandlar signalen till en sann lila färg, och tar bort icke-specifik färgning. Fasta embryon kan förvaras i mörker i stop lösning vid 4 ° C i flera månader.
Fördelarna och disadvantages av WISH
Wish är en effektiv teknik för att karakterisera både tidsmässiga och rumsliga uttryck av målgener under fosterutvecklingen och larvstadier. Detta protokoll tillåter även visualisering av RNA-expression av två gener eller co-lokalisering av RNA och proteinuttryck på samma gång med hjälp av lämpliga modifikationer beroende på de experimentella mål. Denna höga upplösning protokoll kan användas för att detektera RNA-expression i många vävnader och celltyper. Den kan användas för detektion av mycket låga överflödande RNA-species med minimala bakgrundssignaler. Men, för att visualisera exakt uttryck av gener inom innerfack av vävnader kräver in situ hybridisering med vävnadssnitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling. |
| Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood. |
| RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Prepare small aliquots and store at -20°C. |
| DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
| RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% Ethanol | Commercial alcohols | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
| Methanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 | Fine Science Tools | ||
| Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
| Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes | In-house preparation | To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used. | |
| Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| Acetic Anhydride | Sigma | 242845 | |
| Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamide, high purity grade | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
| Citric Acid monohydrate | Sigma | C0706-500G | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
| Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA from bakers yeast type X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) |
Sigma | 227056 | Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles. |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protect this solution from light. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protect this solution from light. |
| Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| 96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |
References
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
- Lawson, N. D., Wolfe, S. A. Forward and reverse genetic approaches for the analysis of vertebrate development in the zebrafish. Dev. Cell. 21, 48-64 (2011).
- Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev. Biol. 365, 290-302 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Chitramuthu, B. P., et al. Molecular cloning and embryonic expression of zebrafish PCSK5 co-orthologues: functional assessment during lateral line development. Dev. Dyn. 239, 2933-2946 (2010).
- Liao, E. C., et al. SCL/Tal-1 transcription factor acts downstream of cloche to specify hematopoietic and vascular progenitors in zebrafish. Genes Dev. 12, 621-626 (1998).
- Stainier, D. Y., Weinstein, B. M., Detrich, H. W. 3rd, Zon, L. I., Fishman, M. C. Cloche, an early acting zebrafish gene, is required by both the endothelial and hematopoietic lineages. Development. 121, 3141-3150 (1995).
- Detrich, H. W. 3rd, et al. Intraembryonic hematopoietic cell migration during vertebrate development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10713-10717 (1995).
- Liao, W., et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. , 124-381 (1997).
- Krauss, S., Concordet, J. P., Ingham, P. W. A functionally conserved homolog of the Drosophila segment polarity gene hh is expressed in tissues with polarizing activity in zebrafish embryos. Cell. 75, 1431-1444 (1993).
- Akimenko, M. A., Ekker, M., Wegner, J., Lin, W., Westerfield, M. Combinatorial expression of three zebrafish genes related to distal-less: part of a homeobox gene code for the head. J. Neurosci. 14, 3475-3486 (1994).
- Alexander, J., Rothenberg, M., Henry, G. L., Stainier, D. Y. casanova plays an early and essential role in endoderm formation in zebrafish. Dev. Biol. 215, 343-357 (1999).
- Milewski, W. M., Duguay, S. J., Chan, S. J., Steiner, D. F. Conservation of PDX-1 structure, function, and expression in zebrafish. Endocrinology. 139, 1440-1449 (1998).
- Argenton, F., Walker, M. D., Colombo, L., Bortolussi, M. Functional characterization of the trout insulin promoter: implications for fish as a favorable model of pancreas development. FEBS Lett. 407, 191-196 (1997).
- Biemar, F., et al. Pancreas development in zebrafish: early dispersed appearance of endocrine hormone expressing cells and their convergence to form the definitive islet. Dev. Biol. 230, 189-203 (2001).
- Thisse, C., Thisse, B., Schilling, T. F., Postlethwait, J. H. Structure of the zebrafish snail1 gene and its expression in wild-type, spadetail and no tail mutant embryos. Development. 119, 1203-1215 (1993).
- Cadieux, B., Chitramuthu, B. P., Baranowski, D., Bennett, H. P. The zebrafish progranulin gene family and antisense transcripts. BMC Genomics. 6, 156 (2005).
- Chitramuthu, B. P., Bennett, H. P. Use of zebrafish and knockdown technology to define proprotein convertase activity. Methods Mol. Biol. 768, 273-296 (2011).
- Thisse, C., Thisse, B. High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. Protoc. 3, 59-69 (2008).
