Zebra balığı, küçük tropikal balık, omurgalı geliştirme ve hastalık sırasında gen fonksiyonu çalışmak için popüler bir model haline gelmiştir. Hedef genlerin uzaysal ve zamansal ifade ile tespit edilebilir<em> In situ</em> Melezleme. Bizim geliştirilmiş protokol düşük spesifik olmayan arka plan sinyal düşük bol transkript tespiti için izin verir.
Bu makale Zebra balığı embriyolarının in situ hibridizasyon (DİLERİZ) in tüm montaj odaklanır. WISH teknoloji doku dağılım ve gelişim aşamasında açısından hem de gen ifadesinin değerlendirilmesi kolaylaştırır. Protokoller digoksijenin ile etiketlenmiş antisens RNA probları kullanılarak zebrabalıkları embriyoların WISH kullanımı tarif edilmektedir. Problar klonlanmış ve lineerize edilmiş gen şablonlar in vitro transkripsiyon yoluyla digoksigenin-bağlı nükleotit ilave edilerek oluşturulur. Belirlenen gelişim aşamalarında hasat embriyoların chorions spesifik problar ile inkübasyondan önce kaldırılır. Aşırı prob kaldırmak için bir yıkama işlemi sonrasında, embriyolar alkalin fosfataz ile konjuge edilmiş anti-digoksigenin antikor ile inkübe edilir. Alkalin fosfataz için bir kromojenik substrat kullanılarak, belirli bir gen ekspresyonu tespit edilebilir. Gen ifade seviyesine bağlı olarak tüm işlem 2-3 gün içinde tamamlanabilir.
Zebra balığı (Br.rerio) omurgalı geliştirme, hastalık, davranış çalışma için güçlü bir hayvan modeli olarak ortaya, ve-ilaç tarama 1-3 oldu. Balığı embriyolar, tek bir geçiş yerinden çok sayıda temin edilebilir. Gübreleme ve geliştirme eski rahim ve optik açık embriyoların hızla geliştirmek oluşur. Kritik gelişimsel olaylar ilk 48 saat sonrası fertilizasyon (hpf) meydana gelir. Bu organın taslakları ortaya ve hücre farklılaşması ve başlanması. Proteinlerin demonte veya aşırı ifadesi, morfolino antisens (MO) oligonükleotidlerle embriyoların mikroenjeksiyon yoluyla elde ya da bir ya da iki hücreli aşamada (0,75 HPF) sırasıyla mRNA olabilir.
Zebra balığı embriyoların DİLERİZ ilgi belirli genlerin uzay-zamansal ifade çalışma kolaylaştırır. DİLERİZ tekniğin uygulama aşırı ifade için mRNA veya MO ile embriyo mikroenjeksiyon takipess veya demonte özel protein düzeyleri diğer genlerin diferansiyel düzenleme ortaya koymaktadır.
Gen ekspresyonu değişiklikleri fenotipik değişikliklerle ilişkili ve erken organogenez sırasında hedef genlerin işlevini ortaya olabilir. Probes hazırlanmış ve önceden depolanmış olabilir, çünkü ISH tekniği altı oyuklu plakalar ve özel yapılmış sepet ile aynı anda en az 20 gen için gen ekspresyonu ortaya çıkarmak için uygulanabilir.
Biz yüksek çözünürlüklü RNA görselleştirmek için geliştirilmiş yöntemler geliştirdik. In situ hibridizasyon prosedürlerinde gözenekli alt (Şekil 1) ile basit bir ölçüye sepet ile gerçekleştirilmektedir. Embriyolar, steril koşullar altında, oda sıcaklığında 6 oyuklu plakalarda RNase içermeyen çözeltiler kullanılarak işlenir.
Ayırmak için embriyolar sepetleri farklı renkli Eppendorf tüpleri yapılır. Ya da bir ağız olma…
The authors have nothing to disclose.
Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Store at 4 °C. Eyes, skin, and respiratory tract irritant and suspected carcinogen. Care should be taken while handling. |
Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxic and suspected carcinogen. Work under fume hood. |
RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Prepare small aliquots and store at -20°C. |
DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
100% Ethanol | Commercial alcohols | ||
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is an eye, skin, and respiratory irritant. Avoid contact with skin and eyes. Use safety glasses, gloves, and mask. |
NaOH | Fisher | SS255-1 | |
EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Prepare and store at -20°C as 40 ml aliquots for later use. PFA is toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is highly toxic. Use safety glasses, gloves, and dust mask. |
Methanol | Fisher | A947-4 | |
Dumont (Watchmaker’s) Forceps pattern no. 5 | Fine Science Tools | ||
Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
Baskets are made of nylon mesh and Eppendorf tubes | In-house preparation | To make the baskets, cut Eppendorf tubes (1.5 ml) with or without rims to remove the conical end. Cut nylon mesh into small pieces corresponding to the size of the cut ends of the Eppendorf tubes. Place tubes with the nylon mesh covering the cut end on an electrical hot plate until both the tube and nylon mesh stick together (carry out in fume hood). Cut off the excess mesh from the baskets and store them in 100% methanol until used. | |
Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
Acetic Anhydride | Sigma | 242845 | |
Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
Formamide, high purity grade | Sigma | F9037 | |
AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
Citric Acid monohydrate | Sigma | C0706-500G | |
Heparin Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
Saline-sodium Citrate Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
tRNA from bakers yeast type X | Sigma | R5636-1ML | |
NaCl | Fisher | S640-500 | |
Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
MgCl2 | Fisher | S25403 | |
Levamisole Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) |
Sigma | 227056 | Irritant, toxic, combustible, and suspected teratogen. Handle with proper safety attire including gloves and goggles. |
5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) | Sigma | N6639 | Protect this solution from light. |
Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Protect this solution from light. |
Albumin from Bovine Serum, purified fraction V (BSA) | Sigma | A8806 | |
Sheep Anti-digoxigenin-AP Fab Fragments | Roche | 1093274910 | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
96-well cell culture plates | Sarstedt | 83.1835 | |
Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |