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Bioengineering

Microfabrication von Nanoporöse Gold-Patterns für Zell-Material-Interaktion Studies

doi: 10.3791/50678 Published: July 15, 2013

Summary

Wir berichten über Techniken zur Mikrostruktur nanoporöse Gold Dünnschichten durch Schablonendruck und Photolithographie, sowie Verfahren zur Kultivierung von Zellen auf den mikrofabrizierten Muster. Darüber hinaus beschreiben wir Bildanalysemethoden der Morphologie des Materials und der kultivierten Zellen mit dem Rasterelektronenmikroskop und Fluoreszenzmikroskopie zu charakterisieren.

Abstract

Nanostrukturierte Materialien mit Strukturgrößen in zehn Nanometern haben die Leistung von mehreren Technologien, einschließlich Brennstoffzellen, Biosensoren, biomedizinischen Beschichtungen und Drug-Delivery-Tools erweitert. Nanoporöse Gold (np-Au), durch eine Nano-Self-Assembly-Verfahren hergestellt, ist ein relativ neues Material, das großen wirksamen Oberfläche, hohe elektrische Leitfähigkeit und katalytische Aktivität aufweist. Diese Eigenschaften haben np-Au ein attraktives Material für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Die meisten Studien auf np-Au beschäftigen Makroebene Proben und konzentrieren sich auf die Grundlagenforschung des Materials und seiner katalytischen und Sensor-Anwendungen. Die Makro-Skala Exemplare begrenzen np-Au Potenzial in miniaturisierten Systemen, einschließlich biomedizinische Geräte. Um diese Probleme anzugehen, haben wir zunächst beschreiben zwei verschiedene Methoden zur Mikrostruktur np-Au Dünnschichten auf starren Substraten. Die erste Methode beschäftigt manuell hergestellt Stencilmasken zum Erstellen Millimeter-Skala np-Au-Muster, while die zweite Methode verwendet lift-off Photolithographie Muster Sub-Millimeter-Skala-Muster. Da die np-Au Dünnschichten durch Sputter-Abscheidung erhalten werden, sind sie kompatibel mit herkömmlichen Mikrofabrikationstechniken, wodurch zugänglich facile Integration in Mikrosysteme. Diese Systeme umfassen elektrisch adressierbaren Biosensorplattformen profitieren vom hohen effektiven Oberfläche, die elektrische Leitfähigkeit und Gold-Thiol-basierte Oberfläche Biokonjugation. Wir beschreiben Zellkultur, Immunfärbung und Bildverarbeitung Techniken np-Au Interaktion mit Säugerzellen, die ein wichtiger Performance-Parameter für einige Biosensoren ist zu quantifizieren. Wir erwarten, dass die hier dargestellten Techniken wird die Integration von np-Au in Plattformen unterstützen auf verschiedenen Längenskalen und in zahlreichen Anwendungen, einschließlich Biosensoren, Energiespeicher und Katalysatoren.

Introduction

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Protocol

1. Gold-Fabrication Nanoporöse

  1. Saubere Substrate in Piranha-Lösung
    1. In 25 ml Wasserstoffperoxid (30%) auf 100 ml Schwefelsäure (96%) in einem Kristallisationsschale und die Mischung auf 65 ° C auf einer Heizplatte. ACHTUNG: Die Flüssigkeiten sind extrem ätzend und muss mit Vorsicht behandelt werden. Die verbrauchte Lösung sollte nicht in einem verschlossenen Behälter aufbewahrt werden, da sie explodieren können.
    2. Platz 1-Zoll mit 3-Zoll-Objektträgern in die Mischung unter Verwendung von Säure-resistenten Pinzette und reinigen Sie sie für 10 min. Verwenden Sie eine Porzellan Immunfärbung Boot für Batch-Reinigung von kleinen Deckgläschen. Gönnen kleine Deckgläschen mit Luft-Plasma bei 10 W für 30 Sekunden vor dem Eintauchen in die Lösung.
    3. Spülen Sie die gereinigten Proben in Kristallisation Geschirr unter fließendem deionisiertem (DI) Wasser für 3 min. Föhnen Proben mit einem Stickstoff-Gewehr über fusselfreien Handtücher.
  2. Bereiten Stencilmaske (Methode 1: Verwenden Sie diese Funktion zum Erstellen von Millimeter-Skala-Muster)
    1. Punch-250 um dicken Siliconelastomerfolien mit Biopsieausstanzungen und / oder einzuschneiden out-Regionen mit einem Skalpell über eine semi-harten Kunststoff-Oberfläche. Reinigen Sie die verarbeiteten Elastomerplatten in 70% Isopropanol und mit Stickstoff trocken gun.
    2. Legen Sie das Lochblech auf einem fusselfreien Handtuch Reinraum und richten Sie die Piranha-gereinigt Deckgläsern über die Schablone mit der Probenoberfläche mit Blick auf die Schablone.
  3. Muster Lift-off-Fotolack (Methode 2: Verwenden Sie diese Funktion zum Erstellen von Sub-Millimeter-Skala-Muster)
    1. Legen Sie eine Piranha-gereinigt Objektträger auf Drückfutter und blasen Sie alle Partikel mit Stickstoff gun. Teststreifen 1,5 ml Haftvermittler (Hexamethyldisilazan) auf die Objektträger mit einem Kunststoff-Pipette. Verbreiten der Promotor durch Drehen der Folie nacheinander bei 500 UpM für 5 sec und 1500 rpm für 30 Sekunden. Backen Sie die Folie auf einer Heizplatte bei 115 ° C für 7 min und abkühlen lassen für 5 min.
    2. Dosieren 4 ml Photoresists auf dem Glasträger (3-Zoll-by 1-inch). Verbreiten des Photoresists durch Drehen der Folie mit dem gleichen Protokoll wie für den Haftvermittler. Backen Sie den Fotolack auf einer Heizplatte bei 115 ° C für 1,5 min und abkühlen lassen für 10 min.
    3. Freilegen Photoresist beschichteten Folie mit UV-Licht (Intensität: 22 mW / cm 2) durch eine Transparenz-Maske für 15 Sekunden. Backen Sie den Fotolack auf einer Heizplatte bei 115 ° C für 1,5 min, und warten Sie 45 min. Man löst den Fotolack belichtet in den Entwickler für mindestens 3,5 min. Gründlich mit DI-Wasser. Überprüfen Sie die entwickelten Muster unter einem optischen Mikroskop.
  4. Kaution Vorläufer Metalle np-Au dünne Filme produzieren
    1. Legen Sie die Proben in einem Sputter-Maschine, die unabhängig hinterlegen kann Gold, Silber und Chrom. Sputter-Reinigen Sie die Proben für 90 sec bei 50 W unter 25 Torr Argon Verarbeitung Atmosphäre bevor Metallabscheidung.
    2. Sputter Chrom für 10 min bei 300 W unter 10 Torr Argon. Sputter Gold für 90 Sekunden bei 400 W under 10 Torr Argon. Co-Sputter-Gold und Silber für 10 min mit Silber bei 200 W und Au Macht bei 100 W. Schalten Gold Sputter-Quelle ca. 10 sec vor dem Ausschalten des Silber Sputter-Quelle.
  5. Erhalten Vorläufermetalls Mikrostrukturen
    1. Beschallen Fotolack beschichteten Proben in ~ 180 ml aus Fotolack Stripperin für 10 Zyklen von 20 sec und 2 min Beschallung Pause zwischen den Zyklen. Spülen Sie die Proben mit DI-Wasser und trocknen Sie mit einem Stickstoff-gun. Überprüfen Sie die Metall-Muster unter dem Mikroskop.
    2. Schälen Sie die Elastomer Schablone aus Nicht-Fotolack beschichteten Proben mit zwei Pinzetten, um das abgeschiedene Metall offenbaren.
  6. Dealloy Vorläufer Metall und modify Nanostruktur durch thermische Behandlung
    1. Füllen Sie ein 200 ml Becherglas mit 170 ml Salpetersäure (70%) und halten die Temperatur der Lösung bei 55 ° C auf einer Heizplatte. ACHTUNG: Die Salpetersäure ist stark ätzend und sollten mit geeigneter Schutzausrüstung gehandhabt werden. Gönnen kleine Deckgläschen mit Luft-Plasma bei 10 W für 30 Sekunden vor dem Eintauchen in Salpetersäure. Platz 1-Zoll mit 3-Zoll-Objektträgern in das Becherglas mit säurebeständigen Pinzette und dealloy sie für 15 min. Verwenden Sie eine Porzellan Immunfärbung Boot für Batch-Legierungsauflösung kleine Deckgläschen.
    2. Spülen Sie die dealloyed Proben durch sukzessives Eintauchen in zwei Becher mit frischem Wasser gefüllt DI dreimal. Lagern Sie die Proben in DI-Wasser und ersetzen Sie das Wasser mit frischem DI-Wasser jeden Tag für mindestens eine Woche. Föhnen Proben mit einem Stickstoff-Gewehr über fusselfreien Tücher vor dem Gebrauch.
    3. Legen Proben auf einem sauberen Silizium-Wafer in einem Rapid Thermal Processing Equipment. Stellen Sie die Temperatur zwischen 200 ° C und 450 ° C und die Rampe auf 10 ° C / sec. Expose der Proben auf die vorgeschriebene Temperatur für 10 min unter Stickstoffatmosphäre. Lassen Sie die Kammer kühl (<100 ° C) und entfernen Sie die Proben. Alternativ legen Sie die Proben langsam auf der Heizplatte zur thermischen treatmENT.

2. Cell Culture

  1. Bereiten np-Au Proben für die Zellkultur
    1. Platz np-Au Proben in Polystyrol Gerichte und behandeln mit Luft-Plasma bei 10 W für 30 s und übertragen Sie die Proben bis zum 24-well-Zellkulturplatten.
    2. In 500 ul komplette Kulturmedien (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin / Streptomycin) in jede Vertiefung. Shop in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 bis Aussäen der Zellen (<1 h).
  2. Pflegen, Passage, und Samenzellen
    1. Pflegen Zellen von Interesse (in diesem Fall 3T3-Fibroblasten NIH oder murine Astrozyten) in T75-Flaschen mit Nährmedien und Passage, wenn die Zellen 70% konfluent sind.
    2. Für Passagieren der Zellen entfernen Medien aus dem Kolben, zweimal waschen mit 10 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), 2 ml 1x Trypsin / EDTA und Inkubation bis die Zellen detach (~ 5 min). In 3 ml frisches Medium undZentrifuge bei 1.200 rpm für 3 min. Saugen Sie den Überstand und setzt das Pellet in 2 ml Medium.
    3. Entfernen Sie die verbrauchte Medien aus den Vertiefungen und Samen die Zellen auf den Deckgläsern in einer Dichte von 25.000 Zellen / cm 2 mit einem Endvolumen von 1 ml. Schütteln Sie die Kultur Platte vorwärts-rückwärts und rechts-links, um eine gleichmäßige Beschichtung der Zellen über die Proben zu gewährleisten. Inkubieren Sie die Zellen bis zur Analyse bei der Inspektion täglich.

3. Zell-und Materialanalyse

  1. Stain Zellen Zytoskeletts und Kerne visualisieren
    1. Entfernen verbrauchte Medium aus den Vertiefungen und wäscht die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Fix Zellen in 4% Paraformaldehyd in PBS für 15 min.
    2. Bereiten Färbelösung von 300 nM Alexa Fluor 488 Phalloidin in PBS mit 1% Rinderserumalbumin.
    3. Waschen der Zellen zweimal mit PBS permeabilisiert und sie in 500 ul 0,1% Triton X-100 in PBS für 5 min.
    4. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und übergeben sie an Brunnen reinigen. Blot 50-200 ul Färbelösung auf die Proben und nur im Dunkeln für 20 min.
    5. Waschen der Zellen mit PBS und Gegenfärbung mit 3 nM DAPI in PBS für 5 min.
    6. Waschen der Zellen mit PBS, und tauchen in entionisiertem Wasser vor der Montage auf Glas Abdeckung gleitet mit Montageplatte Medien und Dichtung mit klarem Nagellack.
  2. Erwerben Sie Bilder von np-Au Proben und Zellkulturen auf np-Au Oberflächen
    1. Bild np-Au Oberflächen mit Rasterelektronenmikroskop (SEM) mit 50.000-facher Vergrößerung bei 10 kV Elektronenenergie mit Sekundärelektronen-Detektor.
    2. Erfassen Verbundzelle Bilder an verschiedenen Stellen auf den Proben unter Verwendung eines invertierten Fluoreszenzmikroskop bei 10-facher Vergrößerung mit den entsprechenden Filter Würfel schneiden.
  3. Bild bearbeiten, um festzustellen, Poren-und Zellmorphologie
    1. Öffnen von Bildern in ImageJ und aufgeteilt in einzelne Kanäle falls zutreffend. Konvertieren Sie die Bilder auf 8-bit, subtrahieren Sie den Hintergrund und glätten sie durch Median filtering. Stellen Schwelle entweder manuell oder durch eingebaute Schwellwertbildung Algorithmen, um die Poren (Hohlräume) und Zellkörper / Kerne zu markieren.
    2. Verwenden Wasserscheide Befehl fusionierten Poren oder Zellen zu trennen. Set Partikelanalytik Parameter und führen Sie den Befehl auf die Anzahl der Teilchen, durchschnittliche Fläche und Prozent Deckung durch Partikel zu extrahieren. Verwenden DAPI-gefärbte Zelle Bilder zur Zellzählung und Phalloidin-gefärbte Zelle Bilder zur Quantifizierung Prozent Netzabdeckung.
    3. Ändern Sie die enthaltenen Dateien auf Makro-Batch-Analyse von mehreren Bildern durchzuführen.

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Representative Results

Abbildung 1 fasst die wichtigsten Verfahrensschritte, einschließlich der Erstellung der np-Au-Muster, das Kultivieren von Zellen, die Quantifizierung der Nanostruktur und Charakterisierung Zellmorphologien. Das Elastomer Schablone in 2a gezeigt (oben) ist für die Erstellung der np-Au-Muster in den Bildern unten gezeigt werden. 2b ist ein Foto von der Porzellan-Boot für die Batch-Verarbeitung Proben. Abbildung 2c zeigt die Farbänderung der abgeschiedenen Metallstrukturen vor und nach Legierungsauflösung. Der silberne Finish (vor Legierungsauflösung) ist aufgrund der Silber-reiche Legierung Inhalt. Nach Ablegieren erwirbt der Film eine sichtbar orange-braunen Farbton. Abbildung 2d zeigt die feinere Ausstattung durch photolithographische Strukturierung der Metall hergestellt. Verschiedene Porenmorphologien kann durch thermische Behandlung von np-Au Folien 9, wie in 3 gezeigt, erhalten werden. Das Schnittbild (Abb.Abbildung 3) zeigt an, ob die Filme gleichmäßig über die Schichtdicke dealloyed. Die SEM-Bilder können segmentiert werden (gethresholdeten) in binäre Bilder (Abbildung 3 untere Reihe) für die Bestimmung der Größe und Prozent Deckung durch Hohlräume (Code 1). Ein repräsentatives Bild der Fluoreszenz haftenden murinen Astrozyten auf np-Au-Oberfläche kultiviert wird in Abbildung 4 dargestellt. Die einzelnen Kanäle des Bildes kann Split und segmentiert, um binäre Bilder für die Analyse von Zell-Material-Wechselwirkung zu erzeugen. Segmentierte Zytoskelett Bilder können zur Quantifizierung Zellfläche und Flächendeckung (Code 2) verwendet werden, während die segmentierten Zellkern Bilder nützlich für Zellzählung (Code 3) sind. Abbildung 5 ist eine visuelle Zusammenfassung der gemeinsamen Ausfälle bei der Herstellung von np-Au Strukturen einschließlich schlechter Filmhaftung, das Fehlen von Porosität und hoher thermischer Behandlung.


Abbildung 1. Schematische Darstellung der wesentlichen Verfahrensschritte. Säure-gereinigten Substrate sind entweder mit einem manuell geschnitten Schablonenmaske oder photolithographisch strukturierten Photoresistschicht maskiert. Die Gold-und Silber-Ziele gleichzeitig zerstäubt, um eine Silber-Gold-Legierung reich, wo die Masken übertragen Sie die Muster auf den Glassubstraten erstellen. Alloy Muster sind dealloyed in Salpetersäure zu nanoporöser Gold (np-Au)-Muster zu erstellen. Zellen von Interesse werden an den Proben kultiviert und sie sind mit Fluoreszenz-und Rasterelektronenmikroskop sowohl biologische und morphologische Merkmale extrahieren abgebildet. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .


Abbildung 2. Optische Bilder A (a) Silikon Schablone (oben) zur Strukturierung Vorläufer Gold-Silber-Legierung, die die np-Au array (unten) produziert verwendet;. (B) Porzellanschiffchen für Batch-Verarbeitung Proben; (c) typische Farbe der gesputterten AuAg Legierung (oben) und dealloyed Film (unten) und (d) mit höherer Auflösung np-Au-Muster durch Photolithographie Maskierung während Gold-Silber-Abscheidung hergestellt.

Abbildung 3
Abbildung 3. Np-Au REM-Aufnahmen (obere Reihe) und entsprechende segmentierte Bilder (untere Reihe), die zum Extrahieren durchschnittliche Porengröße einer Verwendungnd Prozent Leere Abdeckung. SEM-Bild (rechts oben) von einem gespaltenen np-Au Probe zeigt homogene Porenstruktur durch die Schichtdicke. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Fig. 4
Abbildung 4. Verbundmaterial F-Aktin (grün) und Kern (blau) gefärbte Zelle Bild, das segmentiert Prozent Netzabdeckung von den grünen Kanal und Zellen aus dem blauen extrahieren.

Abbildung 5
Abbildung 5. Bilder von typischen Fehlern. (A) Ablösungwährend Entlegieren aufgrund einer unzureichenden Haftschicht aus Chrom, (b) die Abwesenheit von Porosität nach Entlegieren aufgrund unzureichender Silbergehalt in der Legierung, und (c) vollständige Sintern np-Au-Film durch die Wärmebehandlung eine zu hohe Temperatur.

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Discussion

Wir zeigen zwei verschiedene Techniken, um Mikrostruktur np-Au Filme für den Ausbau der Nutzung dieser Filme in der Mikrosystemtechnik und biologische Studien. Sputter-Beschichtung Gold und Silber ist eine vielseitige Methode, um np-Au-Muster zu erstellen, wie Sputtern ist kompatibel mit konventionellen microfabrication Prozesse und die Legierung Zusammensetzung und Dicke leicht durch Variation der einzelnen Sputterkanone Mächten gesteuert werden kann (für Gold-und Silber-Ziele) und die Abscheidung jeweils. Typische np-Au Schichtdicken im Bereich von 200 nm bis 2 um. Die Schablone (Methode 1, Abbildung 2a) mit Biopsieausstanzungen und Skalpell können für die Erstellung von Millimeter-Skala Muster Umgehung der Notwendigkeit für die Photolithographie. Kompliziertere Muster können durch einen programmierbaren Laserschneiders hergestellt werden. Die nachgiebige Silikon-Elastomer Schablone selbst haftet auf Glasflächen, wodurch Metallabscheidung unter der Maske und die zunehmende Auflösung Muster. Aber auch kleinere features (<1 mm) sind in der Regel schwierig, mit diesem Verfahren zu erzeugen, wie die Dicke der Schablone verhindert einheitliche Metallabscheidung durch die Öffnungen in der Maske. Anwendungen, die eine höhere Auflösung erfordern Funktion kann mit photolithographische Strukturierung (Methode 2, Abbildung 2d) erreicht werden. Die Transparenz Masken, Muster über Photolithographie übertragen können von mehreren Firmen (zB Ausgang City, Bandon, OR) erhalten werden und sind wirtschaftliche Alternativen zu Chrom-Glas-Masken, wenn minimale gewünschte Strukturgrößen mehr als ~ 20 um sind. Die Metallabscheidung auf der nachgiebigen Schablone führt manchmal zu einer Ablösung der Schablone von dem Substrat durch ungleichmäßige Belastung Generation. Wir in der Regel zu mildern dieses Problem durch die Sicherung der Schablone auf das darunter liegende Substrat mit einem Polyimid-Band an den Rändern.

Wenn kleinere Proben, wie kreisförmige Deckgläschen (12 mm Durchmesser), die typischerweise in unseren Studien verwendet, Porzellan Boote in gezeigt (zB sauber, dealloy) mehrere kleine Proben. Die Batch-Verarbeitung von Proben erhöht die Gleichförmigkeit der erzeugten Nanostruktur in verschiedenen Proben. Kleine Proben neigen zu schweben beim Eintauchen in Piranha oder Legierungsauflösung Lösungen, da sie hydrophob, wenn in der Luft gespeichert werden. Vor jedem Schritt erfordern Proben in Flüssigkeit eingetaucht wird, die Behandlung von Plasma ihnen (10 W für 30 s) macht die Glasoberfläche hydrophilen und hilft, den schwimmenden Problem zu mildern. Das häufigste Problem bei der Herstellung von np-Au Filmen ist während der Ablösung Ablegieren Schritt. Dieser ist in der Regel auf Zug beansprucht Akkumulation aufgrund Volumenschwund während Legierungsauflösung 21 zugeschrieben. Um Delaminierung zu verhindern, ist es wichtig, eine starke Adhäsion zwischen der np-Au-Schicht und dem Substrat haben. Dies wird durch einen ausreichend dicken Chrom (~ 150 nm) und der Zwischenstufe g erreichtalte Schicht (~ 200 nm). Abgeschiedenen Filme erscheinen sollte hell-bis dunkelgrau, wenn von der Rückseite eines transparenten Substrats angesehen. Die geschälte Folie in Abbildung 5a dargestellt ist ein gutes Beispiel, wie die Rückseite des Films sollte nicht aussehen - die Gold-Finish zeigt an, dass die Chromschicht nicht dick genug ist, um eine starke Haftung zu gewährleisten. Ein weiterer Grund für Delamination ist unrein Probenoberfläche, daher ist es wichtig, Piranha-clean Oberflächen vor der Metallabscheidung. Darüber hinaus ist es wichtig, sicherzustellen, dass der Photolack vor dem Aufbringen der Folie vollständig entwickelt, als der restliche Photoresist verhindert die starke Haftung des abgeschiedenen Metalls auf der Glasoberfläche.

Thermische Behandlung von np-Au Filme ist eine bequeme und kontrollierbares Verfahren zur Modifizierung Porenmorphologie (Abbildung 3). Während eine schnelle thermische Tempern Instrument ist wünschenswert für die thermische Behandlung, Öfen und Kochplatten produzieren auch akzeptable Ergebnisse. Ter thermische Dosis und die Temperatur sollten sorgfältig überwacht werden, da hohe Temperaturen (> 500 ° C) kann dazu führen, dass das Sintern des np-Au und das Verschwinden von Porosität (5c) abzuschließen. Unzureichende Silbergehalt in der abgeschiedenen Legierung (weniger als 60% Silber, auf.%) Auch verhindert Porosität Bildung (Fig. 5b).

Um lebensfähig Zellkulturen auf den vorgenannten np-Au beschichteten Oberflächen zu schaffen, ist es wichtig, die Proben in DI Wasser einweichen mit mehreren Wasserwechsel zur vollständigen Beseitigung der Salpetersäure Rückstand aus dem porösen Netzwerk. Obwohl es nicht notwendig gewesen, um die Oberflächen mit spezifischen extrazellulären Matrix (ECM)-Proteine ​​vor der Aussaat der Zellen zu behandeln, beobachteten wir, dass Plasmabehandlung und Einweichen der Proben in Zellkulturmedium vor Aussaat der Zellen drastisch verbessern Zell-Adhäsion und Lebensfähigkeit. Diese Verbesserung ist höchstwahrscheinlich auf unspezifische Adsorption von Adhäsionsproteine ​​aus dem Serum in cell Kulturmedien auf die np-Au-Oberfläche. Für die Zellkultur Bedingungen, die Serum-freiem Medium erfordern, kann es notwendig sein, vor der Behandlung die np-Au-Oberfläche mit ECM-Moleküle (zB Fibronektin).

Zur Bestimmung Pore / void Größe und Reichweite, sowie Zellzahl und Zell-Abdeckung, Bilder müssen in binäre Schwarzweißbilder umgewandelt werden (siehe Abbildungen 3 und 4) - der Prozess wird auch als Segmentierung bezeichnet. Dies erfordert Kommissionierung eine Schwelle Grauwert, die anfällig für Benutzer-Bias ist. Daher sollte absolute Werte durch Bildverarbeitung bestimmt mit Vorsicht gemeldet werden. Die meisten Studien erfordern einen Vergleich verschiedener Morphologien von Zellen und Nanostruktur, daher solange die Analyse-Parameter (zB Schwelle Teilchengröße Fenster) gehalten sind konsistent Proben statistisch signifikant mit einer relativ kleinen Anzahl von Proben erreicht werden. Vor Bildaufteilung ist es auch hilfreichum die Bilder zu glätten und subtrahieren Sie den Hintergrund unter Verwendung der eingebauten Befehle in ImageJ (oder eine spezielle Version, Fidschi). Wir passen die Parameter in der mitgelieferten Makro (Supplemental-Code Files 1-3), um Batch-Prozess mehrere Bilder.

Wir erwarten, dass die Techniken gezeigt, hier wird die wissenschaftliche Gemeinschaft zu integrieren np-Au in Mikrosysteme, darunter mehrere Elektroden-Arrays für die Elektrophysiologie, Biosensoren, und Miniatur-Energiespeicher Systeme unterstützen. Darüber hinaus glauben wir, dass die semi-quantitative Methoden der Bildverarbeitung wird wertvoll für eine breite Palette von Studien über die Wechselwirkung von Materialien und anhaftenden Zellen.

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Disclosures

Autoren haben keine widerstreitenden finanziellen Interesse.

Acknowledgments

O. Kurtulus und D. Dimlioglu werden von einem Labor der University of California Gebühren Research Program Auszeichnung 12-LR-237197 unterstützt. P. Daggumati wird durch eine University of California Davis Research Investments im Sciences & Engineering (RISE) Zuschlagskriterien unterstützt. CA Chapman wird von einem Department of Education Graduate Assistance Bereiche der nationalen Need Fellowship unterstützt. Diese Arbeit wurde von UC Lab Gebühren Research Program, UC Davis RISE und UC Davis College of Engineering Anschubfinanzierung unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold target Lesker EJTAUXX403A2 Precursor to alloy for producing np-Au
Chrome target Lesker EJTCRXX353A2 Adhesive layer
Silver target Lesker EJTAGXX403A2 Precursor to alloy for producing np-Au
Porcelain boat Thomas Scientific 8542E40 Used for processing small samples
Nitric acid Sigma-Aldrich 43873 Used at 70% for dealloying
Sulfuric acid J.T Baker 7664-93-9 Used at 96% for piranha cleaning
Hydrogen peroxide J.T Baker 7722-84-1 Used at 30% for piranha cleaning
Biopsy punches Ted Pella 150xx Available in several sizes
Silicone elastomer sheets Rogers Corporation HT 6240 Available in several thicknesses
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191-100ML Used as adhesion promoter for positive resist
Microposit MF CD26 Shipley 38490 Positive photoresist developer
PRS 3000 J.T Baker JT6403-5 Positive photoresist stripper
Circular glass coverslips (12 mm) Ted Pella 26023 Used as substrate for metal patterns and cell culture
Glass slides (1 x 3 inch) Ted Pella 26007 Used as substrate for metal patterns
Kapton polyimide tape VWR 82030-950 Used for securing elastomer
Transparency masks Output City Used in photolithography http://www.outputcity.com/
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G Used for activating glass surfaces
Sputtering machine Kurt J. Lesker LAB18 Used for depositing metals

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References

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Daggumati, P., Kurtulus, O., Chapman, C. A. R., Dimlioglu, D., Seker, E. Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies. J. Vis. Exp. (77), e50678, doi:10.3791/50678 (2013).More

Daggumati, P., Kurtulus, O., Chapman, C. A. R., Dimlioglu, D., Seker, E. Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies. J. Vis. Exp. (77), e50678, doi:10.3791/50678 (2013).

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