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Bioengineering

सेल सामग्री बातचीत के अध्ययन के लिए Nanoporous गोल्ड पैटर्न के microfabrication

doi: 10.3791/50678 Published: July 15, 2013

Summary

हम स्टैंसिल मुद्रण और फोटोलिथोग्राफी, साथ ही microfabricated पैटर्न पर संस्कृति कोशिकाओं के तरीकों के माध्यम से micropattern nanoporous सोने की पतली फिल्मों को तकनीक पर रिपोर्ट. इसके अलावा, हम सामग्री और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक का उपयोग कर संवर्धित कोशिकाओं की आकारिकी को चिह्नित करने के लिए छवि विश्लेषण विधियों का वर्णन.

Abstract

नैनोमीटर के दसियों में सुविधा के आकार के साथ nanostructured सामग्री ईंधन कोशिकाओं, biosensors, जैव चिकित्सा उपकरण कोटिंग्स, और दवा वितरण उपकरणों सहित कई प्रौद्योगिकियों के प्रदर्शन में वृद्धि की है. एक नैनो पैमाने पर आत्म विधानसभा की प्रक्रिया द्वारा उत्पादित nanoporous सोना (एनपी-Au), बड़े प्रभावी सतह क्षेत्र, उच्च विद्युत चालकता, और उत्प्रेरक गतिविधि दर्शाती है कि एक अपेक्षाकृत नई सामग्री है. इन गुणों एनपी-Au वैज्ञानिक समुदाय के लिए एक आकर्षक सामग्री बना दिया है. एनपी-एयू पर सबसे अध्ययन वृहद पैमाने पर नमूनों को रोजगार और सामग्री और इसके उत्प्रेरक और सेंसर अनुप्रयोगों के मौलिक विज्ञान पर ध्यान केंद्रित. वृहद पैमाने पर नमूनों जैव चिकित्सा उपकरणों सहित छोटी प्रणालियों, में एनपी-एयू की क्षमता की सीमा. इन मुद्दों का समाधान करने के लिए, हम शुरू में कठोर substrates पर micropattern एनपी-Au पतली फिल्मों के लिए दो अलग अलग तरीकों का वर्णन है. पहली विधि, whil मिलीमीटर पैमाने एनपी-Au के पैटर्न बनाने के लिए मैन्युअल रूप से उत्पादित स्टैंसिल मास्क को रोजगारई दूसरी विधि पैटर्न उप मिलीमीटर पैमाने पैटर्न के लिए लिफ्ट बंद फोटोलिथोग्राफी का उपयोग करता है. एनपी-Au पतली फिल्मों धूम-जमाव प्रक्रिया द्वारा प्राप्त कर रहे हैं, वे माइक्रोसिस्टम्स में सरल एकीकरण के लिए इस तरह उत्तरदायी पारंपरिक तकनीक microfabrication, के साथ संगत कर रहे हैं. इन पद्धतियों उच्च प्रभावी सतह क्षेत्र, विद्युत चालकता, और सोने thiol आधारित सतह bioconjugation से लाभ है कि विद्युत पता biosensor प्लेटफार्मों शामिल हैं. हम कुछ biosensors के लिए एक महत्वपूर्ण प्रदर्शन पैरामीटर है जो स्तनधारी कोशिकाओं के साथ एनपी-एयू की बातचीत यों के लिए सेल संस्कृति, immunostaining, और छवि प्रसंस्करण तकनीकों का वर्णन है. हम यहाँ सचित्र तकनीक विभिन्न लंबाई तराजू और biosensors, ऊर्जा भंडारण प्रणालियों, और उत्प्रेरक सहित कई अनुप्रयोगों, प्लेटफार्मों में एनपी-Au के एकीकरण की सहायता करेंगे कि उम्मीद है.

Introduction

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Protocol

1. Nanoporous गोल्ड निर्माण

  1. पिरान्हा समाधान में स्वच्छ substrates के
    1. एक क्रिस्टलीकरण पकवान और गर्मी डिग्री सेल्सियस एक hotplate पर 65 से मिश्रण में 100 मिलीलीटर सल्फ्यूरिक एसिड (96%) के लिए 25 मिलीलीटर हाइड्रोजन पेरोक्साइड (30%) जोड़ें. चेतावनी: तरल पदार्थ बेहद संक्षारक कर रहे हैं और ध्यान से संभाला जाना चाहिए. यह विस्फोट हो सकता है के रूप में खर्च समाधान, एक मोहरबंद कंटेनर में संग्रहित नहीं किया जाना चाहिए.
    2. जगह एसिड प्रतिरोधी संदंश और 10 मिनट के लिए उन्हें साफ उपयोग कर मिश्रण में 3 इंच खुर्दबीन स्लाइड से 1 इंच. छोटे coverslips के बैच की सफाई के लिए एक चीनी मिट्टी के बरतन immunostaining के नाव का प्रयोग करें. पहले समाधान में विसर्जन के लिए 30 सेकंड के लिए 10 डब्ल्यू पर हवा प्लाज्मा के साथ छोटे coverslips समझो.
    3. 3 मिनट के लिए विआयनीकृत (डी) पानी चलाने के अंतर्गत क्रिस्टलीकरण में बर्तन साफ ​​नमूने कुल्ला. प्रकार का वृक्ष मुक्त तौलिए पर एक नाइट्रोजन बंदूक के साथ उड़ा शुष्क नमूनों.
  2. स्टैंसिल मुखौटा (मिलीमीटर पैमाने पैटर्न बनाने के लिए इस प्रयोग विधि 1) तैयार करें
    1. बायोप्सी घूंसे और / या के साथ पंच 250 माइक्रोन मोटी सिलिकॉन elastomer चादरें एक अर्द्ध मुश्किल प्लास्टिक की सतह पर एक स्केलपेल के साथ क्षेत्रों के बाहर काटकर अलग कर देना. नाइट्रोजन बंदूक के साथ isopropanol और सूखी 70% में प्रसंस्कृत इलास्टोमेर चादरें साफ करें.
    2. एक प्रकार का वृक्ष मुक्त cleanroom तौलिया पर मुक्का मारा चादर प्लेस और स्टैंसिल का सामना करना पड़ नमूना सतह के साथ स्टैंसिल पर पिरान्हा साफ coverslips संरेखित.
  3. पैटर्न लिफ्ट बंद photoresist (विधि 2: उप मिलीमीटर पैमाने पैटर्न बनाने के लिए इसका उपयोग करें)
    1. चक कताई पर एक पिरान्हा साफ खुर्दबीन स्लाइड प्लेस और नाइट्रोजन बंदूक के साथ किसी भी कण उड़ा. एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग गिलास स्लाइड पर आसंजन प्रवर्तक (hexamethyldisilazane) के 1.5 मिलीलीटर बांटना. 30 सेकंड के लिए 5 सेकंड और 1500 rpm के लिए 500 rpm पर क्रमिक स्लाइड कताई द्वारा प्रमोटर बिखरा हुआ है. 7 मिनट के लिए 115 डिग्री सेल्सियस पर एक hotplate पर स्लाइड सेंकना और 5 मिनट के लिए शांत करते हैं.
    2. गिलास स्लाइड पर photoresist की 4 एमएल (3 इंच ख बांटनावाई 1 इंच). आसंजन प्रवर्तक के रूप में एक ही प्रोटोकॉल के साथ स्लाइड कताई द्वारा photoresist बिखरा हुआ है. 1.5 मिनट के लिए 115 डिग्री सेल्सियस पर एक hotplate पर photoresist सेंकना और 10 मिनट के लिए शांत करते हैं.
    3. 15 सेकंड के लिए एक पारदर्शिता मुखौटा के माध्यम से: यूवी प्रकाश के साथ photoresist में लिपटे स्लाइड (22 मेगावाट / 2 सेमी तीव्रता) बेनकाब. 1.5 मिनट के लिए 115 डिग्री सेल्सियस पर एक hotplate पर photoresist सेंकना और 45 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें. कम से कम 3.5 मिनट के लिए डेवलपर में उजागर photoresist भंग. डि पानी से अच्छी तरह कुल्ला. एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के तहत विकसित पैटर्न का निरीक्षण किया.
  4. एनपी-Au पतली फिल्मों का निर्माण करने के लिए जमा अग्रदूत धातुओं
    1. स्वतंत्र रूप से सोने, चांदी, और क्रोम जमा कर सकते हैं कि एक sputtering मशीन में नमूने लोड. धातु बयान शुरू करने से पहले 25 mTorr आर्गन प्रसंस्करण वातावरण के तहत 50 डब्ल्यू से कम 90 सेकंड के लिए नमूने धूम-साफ.
    2. 10 mTorr आर्गन के तहत 300 डब्ल्यू पर 10 मिनट के लिए क्रोम धूम. 400 डब्ल्यू संयुक्त राष्ट्र में 90 सेकंड के लिए सोने की धूमडेर 10 mTorr आर्गन. सोने चांदी को बंद करने से पहले स्रोत लगभग 10 सेकंड धूम बंद करें 100 डब्ल्यू कम 200 डब्ल्यू और Au सत्ता में चांदी के साथ 10 मिनट के लिए सोने और चांदी सह धूम स्रोत धूम.
  5. अग्रदूत धातु micropatterns प्राप्त करें
    1. 20 सेकंड sonication के 10 चक्र और चक्र के बीच 2 मिनट ठहराव के लिए photoresist के स्ट्रिपर का ~ 180 मिलीलीटर में photoresist में लिपटे नमूने Sonicate. डि पानी के साथ नमूने कुल्ला और एक नाइट्रोजन बंदूक के साथ सूखी. एक खुर्दबीन के नीचे धातु पैटर्न का निरीक्षण किया.
    2. जमा धातु प्रकट करने के लिए दो चिमटी का उपयोग गैर photoresist लेपित नमूनों से इलास्टोमेर स्टैंसिल पील.
  6. थर्मल उपचार के माध्यम से Dealloy अग्रदूत धातु और संशोधित nanostructure
    1. नाइट्रिक एसिड (70%) के 170 मिलीलीटर के साथ एक 200 मिलीलीटर कांच बीकर भरें और एक hotplate पर 55 डिग्री सेल्सियस पर समाधान तापमान बनाए. चेतावनी: नाइट्रिक एसिड बेहद संक्षारक है और उचित सुरक्षा उपकरण के साथ संभाला जाना चाहिए. पहले नाइट्रिक एसिड में विसर्जन के लिए 30 सेकंड के लिए 10 डब्ल्यू पर हवा प्लाज्मा के साथ छोटे coverslips समझो. एसिड प्रतिरोधी संदंश का उपयोग बीकर में 3 इंच खुर्दबीन स्लाइड द्वारा जगह 1 इंच और dealloy उन्हें 15 मिनट के लिए. छोटे coverslips के बैच dealloying के लिए एक चीनी मिट्टी के बरतन immunostaining के नाव का प्रयोग करें.
    2. क्रमिक ताजा डि पानी के साथ तीन बार भरी दो बीकर में उन्हें डुबो कर dealloyed नमूने कुल्ला. डि पानी में नमूनों की दुकान और कम से कम एक सप्ताह के लिए हर दिन ताजा डि पानी के साथ पानी की जगह. उपयोग करने से पहले एक प्रकार का वृक्ष मुक्त तौलिए पर एक नाइट्रोजन बंदूक के साथ उड़ा शुष्क नमूनों.
    3. एक तेजी से थर्मल प्रसंस्करण के उपकरण में एक स्वच्छ सिलिकॉन वेफर पर नमूने लोड. 200 डिग्री सेल्सियस और 450 डिग्री सेल्सियस और रैंप दर के बीच के तापमान को समायोजित करने के लिए 10 डिग्री सेल्सियस / सेक. नाइट्रोजन परिवेश के तहत 10 मिनट के लिए निर्धारित तापमान पर नमूनों को बेनकाब. चैम्बर शांत करते हैं (<100 डिग्री सेल्सियस) और नमूनों को हटा दें. वैकल्पिक रूप से, धीरे धीरे थर्मल उपचार के लिए hotplate पर नमूने जगहईएनटी.

2. सेल संस्कृति

  1. सेल संस्कृति के लिए एनपी-एयू के नमूने तैयार
    1. जगह एनपी-Au polystyrene के बर्तन में नमूनों और 30 सेकंड के लिए 10 डब्ल्यू पर हवा प्लाज्मा के साथ इलाज के लिए और 24 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेटें नमूने हस्तांतरण.
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से 500 μl पूरी संस्कृति मीडिया (10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन साथ Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम) जोड़ें. 37 पर एक humidified इनक्यूबेटर में स्टोर डिग्री सेल्सियस और कोशिकाओं (<1 घंटा) बोने तक 5% सीओ 2.
  2. बनाए रखें, यात्रा, और बीज कोशिकाओं
    1. संस्कृति मीडिया और कोशिकाओं के 70% मिला हुआ हैं जब बीतने के साथ T75 बोतल में ब्याज की कोशिकाओं (इस मामले में 3T3-एनआईएच fibroblasts या murine astrocytes) बनाए रखें.
    2. कोशिकाओं passaging के लिए, कुप्पी से मीडिया को दूर, 10 मिलीलीटर फॉस्फेट के साथ दो बार धोने खारा (पीबीएस), कोशिकाओं को अलग (~ 5 मिनट) तक 1x trypsin / EDTA और सेते के 2 मिलीलीटर जोड़ने बफर. 3 मिलीलीटर ताजा मीडिया जोड़ें और3 मिनट के लिए 1200 rpm पर अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला Aspirate और 2 मिलीलीटर मीडिया में गोली निलंबित.
    3. कुओं और बीज 25,000 कोशिकाओं / 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा के साथ 2 सेमी की एक घनत्व पर कांच coverslips पर कोशिकाओं से बिताया मीडिया निकालें. नमूने पर कोशिकाओं की एक समान कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए आगे पीछे और दाएं बाएं संस्कृति थाली हिलाएँ. दैनिक निरीक्षण करते हुए विश्लेषण जब तक कोशिकाओं को सेते हैं.

3. सेल और सामग्री विश्लेषण

  1. Cytoskeleton और नाभिक कल्पना करने के लिए कोशिकाओं दाग
    1. कुओं से खर्च मीडिया निकालें और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लो. 15 मिनट के लिए पीबीएस में 4% paraformaldehyde में कोशिकाओं को ठीक करें.
    2. 1% गोजातीय सीरम albumin साथ पीबीएस में 300 एनएम एलेक्सा Fluor 488 phalloidin की धुंधला समाधान तैयार है.
    3. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं, और 5 मिनट के लिए 500 μl 0.1% ट्राइटन पीबीएस में एक्स 100 में उन्हें permeabilize.
    4. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं और कुओं को साफ करने के लिए उन्हें स्थानांतरित. ब्लाट 50 - 20 मिनट के लिए नमूने और अंधेरे में दुकान पर 200 μl धुंधला समाधान.
    5. पीबीएस और 5 मिनट के लिए पीबीएस में DAPI की 3 एनएम के साथ काउंटर दाग के साथ कोशिकाओं को धो लें.
    6. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें, और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ बढ़ते मीडिया और सील के साथ कांच के कवर स्लाइड पर बढ़ते पहले विआयनीकृत जल में डुबकी.
  2. एनपी-Au सतहों पर एनपी-Au नमूनों और सेल संस्कृतियों की छवियों का मोल
    1. छवि एनपी-Au माध्यमिक इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर का उपयोग करते हुए 10 केवी इलेक्ट्रॉन ऊर्जा में 50,000 एक्स बढ़ाई साथ इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) स्कैनिंग के साथ सतहों.
    2. उपयुक्त फिल्टर घन के साथ 10X बढ़ाई पर एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग नमूनों पर विभिन्न स्थानों पर संयुक्त सेल छवियों पर कब्जा.
  3. प्रक्रिया छवियों ताकना और सेल आकारिकी निर्धारित करने के लिए
    1. ImageJ में और यदि लागू व्यक्तिगत चैनल में विभाजित ओपन छवियों. 8 बिट के लिए छवियों कन्वर्ट, पृष्ठभूमि घटाना, और मंझला filteri द्वारा उन्हें चिकनीएनजी. या तो स्वयं या pores (रिक्तियों) और सेल निकायों / नाभिक को उजागर करने के लिए एल्गोरिदम thresholding में निर्मित द्वारा सीमा समायोजित करें.
    2. विलय pores या कोशिकाओं को अलग करने के लिए वाटरशेड आदेश का उपयोग करें. कण विश्लेषण मापदंडों सेट और कणों द्वारा कणों, औसत क्षेत्र, और प्रतिशत कवरेज की संख्या निकालने के आदेश पर अमल. प्रतिशत सेल कवरेज बढ़ाता के लिए सेल गिनती और phalloidin दाग सेल छवियों के लिए DAPI दाग सेल छवियों का उपयोग करें.
    3. एकाधिक छवियों के बैच विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए शामिल मैक्रो फ़ाइलों को संशोधित करें.

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Representative Results

चित्रा 1, संवर्धन कोशिकाओं एनपी-Au पैटर्न बनाने nanostructure बढ़ाता है, और सेल morphologies निस्र्पक सहित प्रमुख प्रक्रियात्मक कदम की रूपरेखा. चित्रा 2 में दिखाया इलास्टोमेर स्टैंसिल (ऊपर) के नीचे चित्र में दिखाया एनपी-Au के पैटर्न बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है. चित्रा 2b बैच प्रसंस्करण के नमूनों के लिए चीनी मिट्टी के बरतन नाव की एक तस्वीर है. चित्रा 2c जमा धातु पैटर्न का रंग बदलने को प्रदर्शित करता है पहले और dealloying के बाद. चांदी खत्म (dealloying से पहले) चांदी युक्त मिश्र धातु सामग्री की वजह से है. Dealloying पर, फिल्म दिख नारंगी रंग टिंट प्राप्त. चित्रा 2d धातु की photolithographic patterning के द्वारा उत्पादित बेहतर सुविधाओं को दिखाता है. विभिन्न ताकना morphologies के रूप में 3 चित्र में दिखाया एनपी-Au फिल्मों 9, के थर्मल उपचार के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. पार के अनुभागीय छवि (चित्रउरे 3) फिल्मों फिल्म मोटाई के माध्यम से समान रूप से dealloyed कर रहे हैं कि क्या पता चलता है. SEM छवियों रिक्तियों (कोड 1) से आकार और प्रतिशत कवरेज का निर्धारण करने के लिए द्विआधारी छवियों (चित्रा 3 नीचे पंक्ति) में (thresholded) खंडित किया जा सकता है. एक एनपी-Au सतह पर संवर्धित पक्षपाती murine अस्थिकणिका कोशिकाओं का एक प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवि चित्रा 4 में दिखाया गया है. छवि का व्यक्ति चैनलों सेल सामग्री बातचीत का विश्लेषण करने के लिए द्विआधारी छवियों का उत्पादन करने के लिए विभाजन और खंडित किया जा सकता है. खंडों सेलुलर नाभिक छवियों सेल गिनती (कोड 3) के लिए उपयोगी होते हैं, जबकि खंडों cytoskeleton छवियों, सेल क्षेत्र और सतह कवरेज (कोड 2) बढ़ाता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 5 एनपी-Au संरचनाओं के निर्माण में आम विफलताओं के एक दृश्य सारांश है , गरीब फिल्म आसंजन, porosity के अभाव, और अत्यधिक थर्मल उपचार भी शामिल है.


चित्रा 1. प्रमुख प्रसंस्करण कदम की योजनाबद्ध चित्रण. एसिड साफ substrates के या तो एक मैन्युअल में कटौती स्टैंसिल मुखौटा या photolithographically नमूनों परत photoresist साथ मुखौटे हैं. सोने और चांदी लक्ष्य एक साथ मास्क ग्लास substrates पर पैटर्न हस्तांतरण जहां एक चांदी युक्त सोने मिश्र धातु, बनाने के लिए sputtered रहे हैं. मिश्र पैटर्न nanoporous सोना (एनपी-एयू) पैटर्न बनाने के लिए नाइट्रिक एसिड में dealloyed हैं. ब्याज की कोशिकाओं के नमूनों पर संवर्धित कर रहे हैं और वे प्रतिदीप्ति और दोनों जैविक और morphological विशेषताओं निकालने के लिए स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ imaged हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .


चित्रा 2. ऑप्टिकल छवियों के एक (एक) एनपी-Au सरणी (नीचे) जो उत्पादन patterning के अग्रदूत सोने चांदी मिश्र धातु, के लिए इस्तेमाल किया सिलिकॉन स्टैंसिल (शीर्ष);. (ख) बैच प्रसंस्करण के नमूनों के लिए चीनी मिट्टी के बरतन नाव, (ग) ठेठ रंग AuAg sputtered मिश्र धातु (ऊपर) और dealloyed फिल्म (नीचे), और (घ) सोने चांदी बयान के दौरान photolithographic मास्किंग द्वारा उत्पादित उच्च संकल्प एनपी-Au पैटर्न.

चित्रा 3
चित्रा 3. एनपी एयू SEM छवियों (शीर्ष पंक्ति) और निकालने औसत शून्य आकार एक के लिए उपयोग किया जाता है कि इसी खंडों छवियों (नीचे पंक्ति)एन डी प्रतिशत शून्य कवरेज एक cleaved एनपी-Au नमूना की. SEM छवि (ऊपर दाएं) फिल्म मोटाई के माध्यम से सजातीय ताकना संरचना को प्रदर्शित करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
4 चित्रा. एक एफ actin समग्र () हरे और नीले रंग से ग्रीन चैनल और कोशिकाओं की संख्या से प्रतिशत सेल कवरेज निकालने के लिए खंडित है जो नाभिक (नीला) दाग सेल छवि,.

चित्रा 5
चित्रा 5. ठेठ विफलताओं की छवियाँ. (एक) delamination(ख) मिश्र धातु में अपर्याप्त चांदी सामग्री के कारण dealloying बाद porosity के अभाव, थर्मल उपचार तापमान बहुत अधिक होने के कारण और एनपी-Au के (ग) पूरी sintering फिल्म क्रोम की एक अपर्याप्त चिपकने वाली परत के कारण dealloying दौरान.

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Discussion

हम माइक्रोसिस्टम्स और जैविक अध्ययन में इन फिल्मों के उपयोग के विस्तार के लिए micropattern एनपी-Au फिल्मों के लिए दो विभिन्न तकनीकों का प्रदर्शन. धूम कोटिंग सोने और चांदी sputtering के पारंपरिक प्रक्रियाओं microfabrication और मिश्र धातु संरचना और मोटाई आसानी से व्यक्तिगत sputtering बंदूक शक्तियां अलग नियंत्रित (सोने और चांदी के लक्ष्यों के लिए) और किया जा सकता है के साथ संगत है, एनपी-Au के पैटर्न बनाने के लिए एक बहुमुखी विधि है क्रमशः बयान समय. ठेठ एनपी-Au फिल्म 200 एनएम से 2 माइक्रोन के लिए सीमा मोटाई. बायोप्सी घूंसे और स्केलपेल का उपयोग स्टैंसिल विधि (विधि 1, चित्रा 2) फोटोलिथोग्राफी के लिए जरूरत circumventing मिलीमीटर पैमाने पैटर्न बनाने के लिए अनुमति देता है. अधिक जटिल पैटर्न एक प्रोग्राम लेजर कटर द्वारा उत्पादित किया जा सकता है. शिकायत सिलिकॉन elastomer स्टैंसिल गिलास सतहों पर आत्म - पालन करता है, जिससे मुखौटा और बढ़ती पैटर्न संकल्प के नीचे धातु जमाव को रोकने. हालांकि, छोटे चस्टैंसिल की मोटाई नकाब में खुलने के माध्यम से वर्दी धातु बयान रोकता eatures (<1 मिमी), आम तौर पर इस विधि के साथ उत्पादन के लिए मुश्किल हैं. उच्च सुविधा के संकल्प की आवश्यकता होती है अनुप्रयोगों photolithographic patterning (विधि 2, चित्रा 2) के साथ प्राप्त किया जा सकता है. फोटोलिथोग्राफी माध्यम पैटर्न हस्तांतरण पारदर्शिता मास्क कई कंपनियों (जैसे आउटपुट सिटी, Bandon, या) से प्राप्त की है और न्यूनतम वांछित सुविधा आकार ~ 20 माइक्रोन से अधिक कर रहे हैं जब क्रोम गिलास मास्क को किफायती विकल्प हैं किया जा सकता है. शिकायत स्टैंसिल पर धातु बयान कभी कभी गैर वर्दी तनाव पीढ़ी के कारण सब्सट्रेट से स्टैंसिल की टुकड़ी की ओर जाता है. आम तौर पर हम किनारों पर एक polyimide टेप का उपयोग करके अंतर्निहित सब्सट्रेट करने के लिए स्टैंसिल प्राप्त करके इस मुद्दे को कम.

ऐसे परिपत्र coverslips के रूप में छोटे नमूने, (12 मिमी व्यास) आम तौर पर हमारे अध्ययन में इस्तेमाल करते हैं, चीनी मिट्टी के बरतन नावों में दिखाया (जैसे स्वच्छ, dealloy) कई छोटे नमूने के लिए एक सुविधाजनक और किफायती साधन प्रदान करते हैं. नमूने के बैच संसाधन अलग नमूने भर में उत्पादित nanostructure के एकरूपता बढ़ जाती है. छोटे नमूने हवा में संग्रहीत जब वे हाइड्रोफोबिक हो, पिरान्हा में डुबो या समाधान dealloying जब नाव के लिए करते हैं. आवश्यकता के किसी भी कदम के नमूने तरल में डूबे होने के लिए पहले, प्लाज्मा कांच की सतह हाइड्रोफिलिक renders और अस्थायी मुद्दे को कम करने में मदद करता है (30 सेकंड के लिए 10 डब्ल्यू) उन्हें इलाज. एनपी-Au फिल्मों के निर्माण में सबसे आम समस्या dealloying कदम दौरान delamination है. यह आमतौर पर 21 dealloying दौरान मात्रा के दबाव की वजह से तन्यता तनाव संचय के लिए जिम्मेदार ठहराया है. Delamination को रोकने के क्रम में, यह एनपी-Au फिल्म और सब्सट्रेट के बीच मजबूत आसंजन होना बहुत जरूरी है. यह एक पर्याप्त मोटी क्रोम (~ 150 एनएम) और मध्यवर्ती जी द्वारा हासिल की हैपुरानी परत (~ 200 एनएम). एक पारदर्शी सब्सट्रेट के पीछे की ओर से देखने पर जमा फिल्मों गहरे भूरे रंग के लिए प्रकाश दिखाई देनी चाहिए. चित्रा 5a में प्रदर्शित खुली फिल्म फिल्म की पीठ की तरह नहीं देखना चाहिए कि कैसे एक अच्छा उदाहरण है - सोने खत्म क्रोम परत मजबूत आसंजन सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त रूप से मोटी नहीं है कि इंगित करता है. Delamination के लिए एक अन्य कारण अशुद्ध नमूना सतह है, इसलिए यह धातु बयान से पहले पिरान्हा साफ सतहों के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, यह किसी भी अवशिष्ट photoresist के कांच की सतह पर जमा धातु की मजबूत आसंजन रोकता photoresist, फिल्म जमा करने से पहले पूरी तरह से विकसित की है कि यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है.

एनपी-Au फिल्मों के थर्मल उपचार ताकना आकारिकी (चित्रा 3) को संशोधित करने के लिए एक सुविधाजनक और चलाया विधि है. एक तेजी से थर्मल annealing साधन थर्मल उपचार के लिए वांछनीय है, भट्टियां और हॉट प्लेट भी स्वीकार्य परिणाम. टीवह थर्मल खुराक और तापमान एनपी-Au और सरंध्रता (चित्रा 5c) के लापता होने के sintering पूरा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं उच्च तापमान (> 500 डिग्री सेल्सियस) के रूप में, ध्यान से निगरानी की जानी चाहिए. जमा मिश्र धातु (कम से कम 60% चांदी,.% से कम) में अपर्याप्त चांदी सामग्री भी porosity के गठन (चित्रा 5 ब) से बचाता है.

ऊपर उल्लिखित एनपी-Au लेपित सतहों पर व्यवहार्य सेल संस्कृतियों की स्थापना के लिए आदेश में, यह पूरी तरह झरझरा नेटवर्क से नाइट्रिक एसिड अवशेषों को हटाने के लिए कई पानी में परिवर्तन के साथ डि पानी के नमूनों में सोख करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह कोशिकाओं को बोने से पहले विशिष्ट बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन के साथ सतहों के इलाज के लिए आवश्यक नहीं किया गया है, वहीं हम प्लाज्मा उपचार और पूर्व कोशिकाओं को बोने के लिए सेल संस्कृति माध्यम में नमूने भिगोने काफी कोशिका आसंजन और व्यवहार्यता कि सुधार मनाया. इस सुधार CE में सीरम से सबसे अधिक संभावना आसंजन प्रोटीन की गैर विशिष्ट सोखना की वजह से हैएनपी-Au सतह पर करूँगा संस्कृति मीडिया. सीरम मुक्त माध्यम की आवश्यकता होती है कि सेल संस्कृति की स्थिति के लिए, यह ईसीएम अणु (जैसे फ़ाइब्रोनेक्टिन) के साथ पहले से इलाज एनपी-Au सतह के लिए आवश्यक हो सकता है.

ताकना / शून्य आकार और कवरेज, साथ ही सेल गिनती और सेल कवरेज का निर्धारण करने के लिए छवियों (आंकड़े 3 और 4 देखें) द्विआधारी काले और सफेद छवियों को परिवर्तित करने की आवश्यकता - प्रक्रिया भी विभाजन के रूप में जाना जाता है. इस उपयोगकर्ता के पूर्वाग्रह से ग्रस्त है कि एक सीमा से ग्रे मूल्य चुनने की आवश्यकता है. इसलिए, छवि प्रसंस्करण द्वारा निर्धारित निरपेक्ष मूल्यों को सावधानी के साथ सूचित किया जाना चाहिए. हाल के अध्ययनों से कोशिकाओं और nanostructure के अलग morphologies की तुलना की आवश्यकता होती है, इसलिए, के रूप में लंबे समय के विश्लेषण मापदंडों (जैसे सीमा, कण आकार खिड़की) नमूने भर के अनुरूप रखा जाता है, के रूप में सांख्यिकीय महत्व के नमूने की एक अपेक्षाकृत छोटी संख्या के साथ प्राप्त किया जा सकता है. छवि विभाजन से पहले, यह भी सहायक हैछवियों चिकनी और ImageJ में निर्मित में आदेश (या एक और विशेष संस्करण, फिजी) का उपयोग पृष्ठभूमि घटाना. हम बैच प्रक्रिया एकाधिक छवियों को शामिल मैक्रो (पूरक कोड फ़ाइलें 1-3) में मापदंडों को समायोजित.

हम यहाँ दिखा तकनीक कई इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए सरणी, biosensors, और लघु ऊर्जा भंडारण योजनाओं सहित माइक्रोसिस्टम्स, में एनपी-Au के एकीकरण में वैज्ञानिक समुदाय की सहायता करेंगे कि उम्मीद है. इसके अलावा, हम अर्द्ध मात्रात्मक छवि प्रसंस्करण विधियों सामग्री और पक्षपाती कोशिकाओं की बातचीत पर अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए मूल्यवान हो जाएगा.

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Disclosures

लेखक कोई परस्पर विरोधी वित्तीय हित है.

Acknowledgments

ओ Kurtulus और डी. Dimlioglu एक कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला शुल्क रिसर्च प्रोग्राम पुरस्कार 12 एलआर-237197 द्वारा समर्थित हैं. पी. Daggumati विज्ञान एवं इंजीनियरिंग (वृद्धि) पुरस्कार में कैलिफोर्निया डेविस रिसर्च निवेश के एक विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित है. सीए फेरीवाला राष्ट्रीय आवश्यकता फैलोशिप की शिक्षा ग्रेजुएट सहायता क्षेत्रों के एक विभाग के द्वारा समर्थित है. इस काम यूसी लैब शुल्क रिसर्च प्रोग्राम, यूसी डेविस वृद्धि, और इंजीनियरिंग शुरू हुआ धन की यूसी डेविस कॉलेज द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold target Lesker EJTAUXX403A2 Precursor to alloy for producing np-Au
Chrome target Lesker EJTCRXX353A2 Adhesive layer
Silver target Lesker EJTAGXX403A2 Precursor to alloy for producing np-Au
Porcelain boat Thomas Scientific 8542E40 Used for processing small samples
Nitric acid Sigma-Aldrich 43873 Used at 70% for dealloying
Sulfuric acid J.T Baker 7664-93-9 Used at 96% for piranha cleaning
Hydrogen peroxide J.T Baker 7722-84-1 Used at 30% for piranha cleaning
Biopsy punches Ted Pella 150xx Available in several sizes
Silicone elastomer sheets Rogers Corporation HT 6240 Available in several thicknesses
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich 440191-100ML Used as adhesion promoter for positive resist
Microposit MF CD26 Shipley 38490 Positive photoresist developer
PRS 3000 J.T Baker JT6403-5 Positive photoresist stripper
Circular glass coverslips (12 mm) Ted Pella 26023 Used as substrate for metal patterns and cell culture
Glass slides (1 x 3 inch) Ted Pella 26007 Used as substrate for metal patterns
Kapton polyimide tape VWR 82030-950 Used for securing elastomer
Transparency masks Output City Used in photolithography http://www.outputcity.com/
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G Used for activating glass surfaces
Sputtering machine Kurt J. Lesker LAB18 Used for depositing metals

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References

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सेल सामग्री बातचीत के अध्ययन के लिए Nanoporous गोल्ड पैटर्न के microfabrication
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Daggumati, P., Kurtulus, O., Chapman, C. A. R., Dimlioglu, D., Seker, E. Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies. J. Vis. Exp. (77), e50678, doi:10.3791/50678 (2013).More

Daggumati, P., Kurtulus, O., Chapman, C. A. R., Dimlioglu, D., Seker, E. Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies. J. Vis. Exp. (77), e50678, doi:10.3791/50678 (2013).

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