Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

En guidad Materials Screening strategi för utvecklingen av kvantitativa Sol-gel protein från Microarrays

Published: August 26, 2013 doi: 10.3791/50689
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University

Summary

En guidad material screening metod för att utveckla sol-gel härledda protein dopade mikromatriser med en framväxande pin-utskrift tillverkningsmetod beskrivs. Denna metod demonstreras genom utveckling av acetylkolinesteras och multikinashämmare microarrays, som används för kostnadseffektiv små molekyler screening.

Abstract

Microarrays har funnit användning i utvecklingen av high-throughput analyser för nya material och upptäckt av små-molekyldrogkandidater leads. Häri beskriver vi en guidad tillvägagångssätt material screening för att identifiera sol-gel-baserade material som är lämpliga för framställning av tredimensionella protein microarrays. Tillvägagångssättet identifierar först material som kan skrivas som microarrays, smalnar ner antalet material genom att identifiera de som är kompatibla med en viss enzymanalys, och sedan hones i den optimala material baserade på bibehållande av maximal enzymaktivitet. Detta tillämpas för att utveckla microarrays lämpliga för två olika enzymanalyser, en som använder acetylkolinesteras och den andra med en uppsättning av fyra viktiga kinaser är involverade i cancer. I varje fall var det möjligt att tillverka mikroarrayer som kan användas för kvantitativa små molekyler screeninganalyser och produktion av dosberoende kurvor hämmare svar. Viktigt är, förmågan att screena många matematerial produceras information om de typer av material som är bäst lämpade för både microarray produktion och bevarande av enzymaktivitet. De material data ger insikt i grundläggande materiella krav som är nödvändiga för att skräddarsy optimala, high-density sol-gel härledda mikromatriser.

Introduction

Microarrays har vunnit popularitet inom det vetenskapliga samfundet som en metod för att öka analys genomströmning. Eftersom utvecklingen av microarrayteknologi att bedöma genuttryck 1 i mitten av 1990-talet, har mikromatriser funnit användning i utvecklingen av high-throughput analyser för att identifiera protein-protein och protein-interaktionen mellan små molekyler, samt att finna nya material med unika egenskaper. 2-5 På senare tid har mikromatriser utvecklats vari specifika material används för att immobilisera funktionella proteiner, som producerar ett tredimensionellt microarray element i vilka proteiner är infångade, vilket möjliggör enkel mätning av enzymatisk aktivitet och hämning på microarray själv användning av en lämplig fluorescens analys som är kopplad till substrat omsättningen. 5-10 Viktigt kan sådana mikromatriser utformas för att inkludera alla nödvändiga komponenter för att screena prover och kontroller tillsammans i en mycket parallellt mode. 5,8 </ P>

Tidiga exempel på protein microarrays typiskt framställdes med användning av standardmetoder för proteinimmobilisering på fasta bärare, såsom kovalent bindning, 11 affinitet fånga 3 och fysikalisk adsorption. 12 Även om dessa metoder för bio-immobilisering möjliggöra ökad provkoncentration och påskyndade reaktionskinetik som krävs för assay miniatyrisering, de var lida nackdelar. I allmänhet, alla orsaka en minskning av infödda biomolekyler funktionalitet grund kemisk modifiering av ytan, hindrad tillgång till aktiva platser, eller felaktig orientering på grund av icke-specifik immobilisering. Således, alla metoder resulterar i lägre analyskänslighet trots en ökning av biomolekyler nedfall, ett svar som sannolikt uppstår på grund av behovet att artificiellt binda biomolekyler till en yta.

En framväxande tillvägagångssätt för produktion av funktionella biomolekyl mikromatriser är genom stift-tryckning av protein-dopadkiseldioxidsoler på fasta bärare, som är typiskt antingen funktionaliserade glasskivor eller individuella brunnar i mikrobrunnplattor plattor. Sol-gel-processen i sig äger rum i en vattenhaltig miljö vid rumstemperatur, och det är det flytande förstadiet som är tryckt och sedan geler att fånga biomolekyler inom 3D-matrisen, vilket möjliggör hög proteinhalt lastning 13 samt inneslutning av multipla komponenter inom samma microarray elementet. 13,14 skräddarsy den härledda sol-gel-materialet kan ske genom noggrant urval av olika kiseldioxid prekursorer, samt genom att förändra den vattenbaserade komponenten genom användning av olika buffertar (pH, jonstyrka), och införandet av olika tillsatser (polymerer, små molekyler) för att uppnå ett optimalt material, beror den specifika karaktär som på biomolekyler som är anhållna. 10

En potentiell begränsning i samband med utvecklingen av sol-gel härledda protein microarrays via pin-utskrift ärbehovet av att identifiera sol-gel kompositmaterial som kan skrivas utan gel i stiftet eller visar oönskade egenskaper (reproducerbara plats storlekar, sprickor, dålig vidhäftning, oförenlighet med analyskomponenter, dålig protein aktivitet) en gång tryckt på en yta. 5 Samtidig optimering av alla dessa parametrar utesluter ett tillvägagångssätt vari material kan utformas de novo, eller undersökta långsamt på ett seriellt sätt. Å andra sidan, är slumpmässig screening av många tusen eller tiotusentals material varken tids-eller kostnadseffektivt.

I den här artikeln beskriver vi en riktad screening som möjliggör snabb identifiering av lämpliga material för produktion av protein microarrays utan att behöva slumpmässigt screena ett stort antal material. Med hjälp av en guidad tillvägagångssätt används material lämpliga för microarray utskrift först identifierades, följt av en serie av småskaliga skärmar för att identifiera optimal sol-gel-härlett materialal kombinationer som kan skrivas reproducerbart, utan att spricka och är kompatibel med en given analys. Slutligen är optimala material identifieras baserat på retention av enzymaktivitet och prestanda i en final småmolekylär screeningsanalysen. På detta sätt kan optimala material identifieras från många tusen kandidater med hjälp av endast några hundra analysstegen. Vi visar detta tillvägagångssätt för tillverkning av både hög densitet acetylkolinesteras och mikroarrayer multikinashämmare och användningen av sådana mikroarrayer för småmolekylära screening.

Protocol

Ett. Beredning av tillsatsmedel Solutions

  1. Förbered 25 och 50 mM Tris (hydroximetyl) aminometan (Tris-bas, M ^ 121,14 g / mol) och HEPES (M ^ 238,3 g / mol) vid pH 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0 och 8,2 i 50 ml centrifug rör. Justera pH med användning av 1 N HCl och NaOH, respektive. Förvara i rumstemperatur och byt efter 3 månader.
  2. Bered 24% (vikt / vol) poly (vinylalkohol) (PVA): väg upp 2,4 g PVA (Mw 9000 - 10.000, 80% hydrolyserad) och tillsätt till 10 ml avjoniserat-destillerat vatten (DDH 2 O), lös polymerpartiklarna pellets genom virvling. Använd 24% (vikt / volym)-lösning för framställning av lika stora volymer av 16% (vikt / volym), 12% (vikt / volym) och 8% (vikt / volym) PVA-lösningar. Degas lösningar genom sonikering före användning. Förvara vid 4 ° C i upp till en månad.
  3. Bered 24% (vikt / volym) polyetylenimin (PEI): tillsätt 4,8 ml PEI (Mw 1300, 50% (vikt / vikt) i H2O) till 5,2 ml ddHaO 2 O. Använd 24% (vikt / volym)-lösning för framställning av lika volymerav 16% (vikt / volym), 12% (vikt / volym) och 8% (vikt / volym) PEI-lösningar. Degas lösningar genom sonikering före användning. Förvara vid 4 ° C i upp till en månad.
  4. Bered 60% (vikt / volym) polyetylenglykol (PEG): Väg ​​6 g PEG (Mw 600) och tillsätt till 10 ml DDH 2 O och lös därefter polymerpellets genom virvling. Använd serieutspädning för framställning av en lika stor volym av 30% (vikt / volym) PEG-lösning. Degas lösningar genom sonikering före användning. Förvara vid 4 ° C i upp till en månad.
  5. Förbered 24% (v / v) N-(3-trietoxisilylpropyl) glukonamid (GLS): tillsätt 480 pl GLS (50% i etanol - lager GLS kan kräva användning av ett vattenbad för att värma och upplösa lösning om kristallint) till 520 pl av 95% (volym / volym) etanol och blanda under 20 min genom sonikering. Använd 24% (volym / volym) lösning för att göra en lika volym av 16% (volym / volym) GLS-lösning. Gör nya lösningar för användning per dag.
  6. Bered 24% (volym / volym) metyltrimetoxisilan (MTMS): tillsätt 240 pl av MTMS till 760 | il av befintliga surgjordes DDH 2 O (pH 2,0, 1 N HCl) och blanda i 20 minuter genom ultraljudsbehandling. Använd 24% (volym / volym) lösning för att göra en lika volym av 16% (volym / volym) MTMS lösning. Gör nya lösningar för användning per dag.
  7. Bered 24% (volym / volym) bis [(3-methyldimethoxylsilyl) propyl] polypropylenoxid (MDSPPO): tillsätt 240 pl av MDSPPO till 760 | il av befintliga surgjordes ddHaO 2 O (pH 2,0, 1 N HCl) och blanda under 20 min genom sonikering. Använd 24% (volym / volym) lösning för att göra en lika volym av 16% (volym / volym) MDSPPO lösning. Gör nya lösningar för användning per dag.
  8. Bered 24% (v / v) 3 - (aminopropyl)-trietoxisilan (APTES): tillsätt 240 pl av APTES till 760 | il av befintliga surgjordes ddHaO 2 O (pH 2,0, 1 N HCl) och blanda under 20 min genom sonikering. Använd 24% (volym / volym) lösning för att göra en lika volym av 16% (volym / volym) APTES lösning. Gör nya lösningar för användning per dag.
  9. Bered 24% (volym / volym) bis (triethoxysily) etan (bis-TEOS): tillsätt 240 | il av bis-TEOS till 760 | il av befintlig surgjord ddHaO 2 O (pH 2,0, 1 N HCl) Och blanda i 20 minuter genom ultraljudsbehandling. Använd 24% (volym / volym) lösning för att göra en lika volym av 16% (volym / volym) bis-TEOS-lösning. Gör nya lösningar för användning per dag.
  10. Bered 24% (volym / volym) carboxyethylsilanetriol (Si-COOH): tillsätt 960 pl av Si-COOH (25% i DDH 2 O) till 40 | il av befintliga surgjordes ddHaO 2 O (pH 2,0, 1 N HCl) och blanda i 20 min med ultraljudsbehandling. Använd 24% (volym / volym) lösning för att göra en lika volym av 16% (v / v) Si-COOH-lösning. Gör nya lösningar för användning per dag.
  11. Bered separat 3 mM N ε - acetyl-L-lysin, D-sorbitol, α-α-trehalos (M ^ 188,22 g / mol, 182,17 g / mol, och 378,33 g / mol, respektive) och 1,5 mM Triton X-100 (genomsnittlig Mw 625 g / mol) i DDH 2 O. Volymerna kan variera beroende på hur mycket som krävs, gör nya lösningar för användning per dag.
  12. Bered 60% (vikt / vikt) glycerol: tillsätt 2,4 g vattenfri glycerol till 1,6 g DDH 2 O, blanda genom virvel. Degas lösninggenom sonikering före användning. Förvara vid 4 ° C i upp till en månad.
  13. Bered 30% (vikt / vikt) glycerol: tillsätt 1,6 g vattenfri glycerol till 2,4 g DDH 2 O, blanda genom virvel. Degas lösning genom sonikering före användning. Förvara vid 4 ° C i upp till en månad.

2. Framställning av kiseldioxidsoler

Efter procedurerna nedan, respektive soler när den förvaras på is, kan användas upp till 1 timme efter tillsats av vatten. Sols används utöver 1 timme resulterar i minskade / inkonsekventa gånger materiella gelning.

  1. Framställning av en natrium-silikat (SS) baserad sol
    1. Väg upp 120 g av jonbytarharts i en 500 ml plastbägare.
    2. Tillsätt 150 ml 0,1 N HCl och rör om under 1 timme med användning av en 2 tum magnetisk omrörarstav.
    3. Filtrera lösningen med användning av en Biichner-tratt ansluten till vakuum.
    4. Tillsätt långsamt DDH 2 O att tvätta den filtrerade hartsen tills det erhållna filtratet är klar. Det tar ungefär 100ml DDH 2 O.
    5. Samla och lagra det beredda hartset i en plastbehållare vid rumstemperatur i upp till en månad.
    6. Väg upp 2,59 g natriumsilikat (SS, 27% ​​(vikt / vikt) SiO 2, 10% (vikt / vikt) NaOH) i en 50 ml plastbägare.
    7. Tillsätt 10 ml DDH 2 O till SS. Snurra försiktigt för hand för att blanda lösningen.
    8. Väg upp 5,60 g behandlat harts i en separat 50 ml plastbägare. Lägg till natriumsilikatlösningen och blanda i 2 minuter med användning av en en-tums magnetisk omrörarstav.
    9. Filtrera blandningen lösning med en Biichner-tratt ansluten till en aspirator fäst till en vattenkran.
    10. Använd en 10 ml plastspruta utrustad med en 0,2 ^ m membranfilter för att filtrera sol lösningen. Detta ger en sol med 5,6% (vikt / vikt) kiseldioxid kallad SS i ytterligare text. Håll sol på is när den inte används.
    11. ½ SS: tillsätt 1 ml beredd SS sol till 1 ml DDH 2 O, blanda med vortex. Håll sol på is när den inteanvända.
  2. Framställning av en diglycerylsilane (DGS) baserad sol
    1. Synthesize DGS som beskrivs på annat håll. 15,16 Store kristallina DGS i exsickator vid rumstemperatur i upp till 6 månader.
    2. Väg upp ca 1 g av kristallina DGS.
    3. Använd en mortel och mortelstöt för att slipa insättningsgarantisystemet till ett fint pulver. Fyll i detta steg så snabbt som möjligt för att förhindra fuktabsorption från luften.
    4. Försiktigt överföra de finmalda DGS till en tom 20-ml scintillationsflaska, registrera massan (en tusendels gram).
    5. Lägg DDH 2 O för att ge en 0,5 g / ml DGS.
    6. Sonikera hydrolyserade DGS på is i 20 minuter, blanda med vortex under 5 sekunder var 5 min. Under fuktiga dagar, kan fullständig upplösning av DGS kräver tillsats av 10 pl 1 N HCl. Detta bör sättas till lösningen före sonikering.
    7. Använd en 3-ml plastspruta utrustad med en 0,2 ^ m membranfilter för att filtrera sol lösningen, ta bort fina partiklar. Detta ger en sol med 5,0% (vikt / vikt) kiseldioxid kallas sådana system i ytterligare text. Håll sol på is när den inte används.
    8. ½ DGS: Tillsätt 1 ml av beredd DGS sol till 1 ml DDH 2 O, blanda genom vortex. Håll sol på is när den inte används.

Tre. Pre-screening för att identifiera utskrivbara material

En generaliserad schema som visar de olika stegen i den guidade faktoranalys används för att identifiera utskrivbara material visas i figur 1. En minsta totala materialet volym av 100 ^ rekommenderas. Användning av mindre volymer gör att visualisera material gelation svårt.

  1. Steg 1: buffert och silan
    1. Lägg 50 ul buffert (25 och 50 mM Tris eller HEPES vid pH 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2) till en 2 ml glasscintillationsbehållare.
    2. Tillsätt 50 l av lämplig sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) och skaka blandningen i en on-and-off mode för 10 sekunder genomflytta flaskan på och av virvelblandaren.
    3. Ställ material att vila i rumstemperatur, övervaka tiden för materialet gel. Gelningstiden definieras som den punkt vid vilken materialet slutar flöda fritt när rotera flaskan till en 45 ° vinkel.
    4. Uteslut materialkombinationer med gelbildningstider gånger mindre än 2,5 tim från efterföljande stegen material screening.
  2. Steg 2: buffert, silan och polymer
    1. I en 2-ml glasscintillationsflaska, tillsätt 3,13 ul av antingen 16% (vikt / volym) eller 8% (vikt / volym) PVA / PEI lösning eller 6,3 | il av 30% (vikt / volym) eller 60% (vikt / v) PEG-lösning.
    2. Lägg 50 mM HEPES (pH 8,0) för att bringa den kombinerade volymen till 50 | il, blanda lösningen genom virvling.
    3. Tillsätt 50 l av lämplig sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS), blanda i det sätt som beskrivs i steg 3.1.2.
    4. Uteslut materialkombinationer med gelbildningstider gånger (enligt definition i steg 3.1.3) mindre än 2,5 tim från efterföljande stegen material screening.
  3. Steg 3: buffert, silan, polymer och organosilanen
    1. I en 2-ml glasscintillationsflaska, tillsätt 3,13 ul av antingen 16% (vikt / volym) eller 8% (vikt / volym) PVA-lösning eller 6,3 | il av 30% (vikt / volym) eller 60% (vikt / volym) PEG-lösningen.
    2. Lägg 3,13 pl av 16% (vikt / volym) organosilan (GLS, MTMS, MDSPPO, bis-TEOS, Si-COOH eller APTES).
    3. Lägg 50 mM HEPES (pH 8,0) för att bringa den kombinerade volymen till 50 | il, blanda lösningen genom virvling.
    4. Tillsätt 50 l av lämplig sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) och blanda i det sätt som beskrivs i steg 3.1.2. Uteslut materialkombinationer med gelbildningstider gånger (enligt definition i steg 3.1.3) mindre än 2,5 tim från efterföljande stegen material screening.
  4. Steg 4: buffert, silan, polymer, organosilan och små-molekyl tillsatsmedel
    1. I en 2-ml glasscintillationsflaska, tillsätt 2,08 ul av antingen 24% (vikt / volym) eller 12% (vikt / volym) PVA-lösning eller 6,3 | il av 30% (vikt / volym) eller 60% (vikt / volym) PEG-lösningen.
    2. Lägg2,08 pl av 24% (vikt / volym) organosilan (GLS, Si-COOH).
    3. Lägg 2,08 il av 3 mM småmolekylära lösning (N ε - acetyl-L-lysin, D-sorbitol, α-α-trehalos) eller 1,5 mM (Triton X-100).
    4. Lägg 50 mM HEPES (pH 8,0) för att bringa den kombinerade volymen till 50 | il, blanda lösningen genom virvling.
    5. Tillsätt 50 l av lämplig sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) och blanda i det sätt som beskrivs i steg 3.1.2.
    6. Uteslut materialkombinationer med gelbildningstider gånger (enligt definition i steg 3.1.3) mindre än 2,5 tim från efterföljande stegen material utskrift.

4. Framställning av Printable Protein-dopade material

De material som identifierats vid slutet av steg 3.4.6 balanseras i tryckbarhet studier, med det lämpliga enzymet som nu ingår i solen. I samtliga fall som beskrivs nedan, vattenhaltig lösning innehållande alla komponenter utom för silanenframställs i en mikrobrunn, följt av tillsats av solen precis före utskrift. För att tillgodose användningen av en 384-mikrotiterplatta, är en total lösning volym av 50 pl användes i stället för 100 ul.

  1. Acetylkolinesteras (AChE) microarray
    1. Bered en 2 kU / ml lösning av AChE i 50 mM HEPES (pH 8,0) till följd av mycket specifik enzymaktivitet (verksamhetsenheter per mg) informationen från tillverkaren.
    2. Alikvot 2 kU / ml enzym stamlösning i 5 | il fraktioner med användning av 500-il mikrocentrifugrör och förvara vid -20 ° C. 2 KU / ml AChE stamlösningar förblir stabila i upp till 4 månader vid förvaring vid -20 ° C.
    3. Förbered basmaterial genom att kombinera halva volymen av motsvarande polymerer, organosilanes och små molekyler tillsatser identifierats genom steg 3.4.6 i en 384-brunnsmikrotiterplatta.
    4. Tillsätt 5 pl av 2 kU / ml AChE i 50 mM HEPES (pH 8,0).
    5. Använda 50 mM HEPES (pH 8,0), föra den kombineradeväl volymen till 25 | il blanda genom att pipettera lösningen upp och ned flera gånger.
  2. Multikinashämmare microarray
    1. Bered 100 ng / l kinas lösningar (p38a, MAPK2, EGFR, GSK-3β) i DDH 2 O efter aktiviteten (U / ml eller U / mg) och kvantitet information från tillverkaren. Förvara kinas lösningar i alikvoter om 2 | il vid -80 ° C.
    2. Förbered kinas substrat (MBP, p (E 4 Y), GSM) vid 5 mg / ml, 50 mg / ml eller 300 iM i DDH 2 O, efter den mängd information som tillhandahålls av tillverkaren. Förvara substrat i portioner av 2,5 pl vid -80 ° C.
    3. Förbered basmaterial genom att kombinera halva volymen av motsvarande polymerer, organosilanes och små molekyler tillsatser identifierats genom steg 3.4.6 i en 384-brunnsmikrotiterplatta.
    4. Till varje brunn innehållande basmaterialen, tillsätt 2,5 | il kinas och 2 | il av dess respektive substrat (p38a och MBP, MAPK2 och MBP, EGFR och p (E 4 Y), GSK-3β och GSM) framställd som i steg 4.2.1 och 4.2.2, respektive.
    5. Använda 50 mM HEPES (pH 7,4), föra den kombinerade väl volymen till 25 | il. Blanda genom att pipettera.

Fem. Microarray Formation

Detta avsnitt beskriver detaljerat hur du skriver ut material på en enda glidyta. Skriva ut på flera modifierade glidytorna (amin, epoxi, aldehyd och PMMA), är denna procedur upprepas 4 gånger.

  1. Form microarrays genom att använda ett kontaktstift-printing robot utrustad med en XYZ-objektbordet. Använd slitsade manteln stift av 100 iM diameter att deponera protein-dopade soler.
  2. Ställ fuktigheten inom tryckeribranschen kammaren till 80-90%. Fuktighet <80% kan resultera i provavdunstning och inkonsekvenser i tryck, på grund av de små nedfall volymer.
  3. Låt ligga stift i DDH 2 O i 15 min före utskrift och torrt under en ström av kväve. Använd ett rör cleaner för att avlägsna kvarvarande fukt inifrån stifthållaren och försiktigt placera stiftet i skrivhuvudet. Underlåtenhet att avlägsna kvarvarande fukt kan hindra stiftet från att röra sig fritt med hållare, vilket resulterar i missade fläckar.
  4. Kontroll array mönster genom Chip Writer Pro (CWP) program. För varje prov väl inom 384-väl källplattan är 200 punkter (max antal platser per upptag använder SMP3 slida stift) tryckt på en yta modifierad glasskiva.
  5. Påbörja utskriften via programvaran. Ställ resor i XY-riktning till 10 mm / s och prov ingångshastighet (Z-riktning) till 2 mm / s med en 2,5 sek provladdning tid.
  6. Pausa körningen genom CWP. Sänk stiftet i provet och tillsätt 25 ìl av respektive sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ ß) till brunnen med pipett. Blanda lösningen med hjälp av en upp-och-ned pipettering rörelse upprepades 50x. När blandning genom pipettering, minimera mängden luft införlivas i lösningen. Air bubbles förebygt komplett laddning av prov inom stiftet.
  7. Påbörja utskriften genom CWP, och skriva ut provet på en glidyta. Pausa utskriften innan du laddar prov från den efterföljande källplattan väl.
  8. Ta utskriften stiftet med hjälp av en magnet och placera en piprensare i skrivhuvudet för att förhindra att fukt byggs upp i skrivhuvudet.
  9. Skölj utskrift pin med DDH 2 O och låt ligga i rent DDH 2 O under 30 sek.
  10. Torka den grafiska stift under en ström av kväve och avlägsna röret renare, placera stiftet tillbaka in i skrivhuvudet.
  11. Påbörja utskrift genom att följa stegen 5,6-5,10, för alla prov kvar inom källplattan. Upp till 12.000 platser i 100 ìm diameter kan avsättas på en enda bild.
  12. Denna metod kan också tillämpas på tryckning material på botten av brunnarna i en 96-brunnars mikroplatta. Efter CWP kalibreringsfil, kalibrera om utskrift pin för att säkerställa distance reste upp mellan spot nedfall är ovanför höjden för mikrobrunnsplattan. Detta tillåter tappen att skriva ut konsekvent från brunn till brunn i ett linjärt sätt utan att skada pin.
  13. Ålder arrayen i minst 30 minuter och upp till 24 timmar i utskrift kammaren vid 80-90% luftfuktighet efter slutförandet av hela tryckeriet experimentet.

6. Acetylkolinesteras aktivitetsanalysen

  1. Förbereda positiv kontroll (PC) prover
    1. Bered en jodid mM acetyltiokolin (ATCH: M ^ 289,18 g / mol) i 4% glycerol, 25 mM Tris (pH 7,0) i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. ATCH måste beredas på nytt före varje användning och användning av en buffert vid pH 7,0 som högre pH-buffertar orsaka snabb autohydrolysis, producerar falska positiva. Den slutliga volymen kan varieras beroende på antalet prover (25 | il per prov).
    2. Lägg 0,14 pl av 5 mM BODIPY-Fl-L-cystin till 25 pl av 1 mM ATCH i brunnen av en 384-mikrotiter PLAte.
    3. Lägg 24,86 | il 4% glycerol, 25 mM Tris (pH 7,0), blanda genom att pipettera noggrant för att undvika bubbelbildning i lösningen. Potentiella hämmare kan införlivas i PC lösningen innan föra volymen till 50 pl med buffert.
  2. Förbereda negativ kontroll (NC) prover
    1. Lägg 0,14 pl av 5 mM BODIPY-Fl-L-cystin till 49,86 | il 4% glycerol, 25 mM Tris (pH 6,5) i brunnen av en 384-mikrotiterplatta. Blanda genom att pipettera.
  3. Övertryck PC och NC-lösningar
    1. Överexponerar åldrade mikromatriser följande steg 5,1-5,10 (ignorera steg 5.6) i protokollet. Använd slitsade manteln stift av 235 iM diameter att deponera PC och NC-lösningar övertryck. Detta säkerställer att lösningen täcker tidigare deponerade fläcken helt.
    2. Ålder arrayer vid 80-90% luftfuktighet under 1 timme i rumstemperatur. På grund av autohydrolysis av ATCH kan längre inkubationstiderna resultera i falskt positiva eller ökat svzyme aktivitet.

7. Kinasaktivitet Analys

  1. Bered 500 iM adenosin-5'-trifosfat (ATP)-lösning med hjälp av lager ATP (100 mM) lagrades vid -20 ° C. Gör ny lösning för varje experiment och justera volymen till experimentella behov: varje utskriftslösning kräver 5 pl.
  2. Bered en 100 mM magnesiumklorid (MgCl2: M ^ 95,21 g / mol) stamlösning i DDH 2 O.
  3. Positiv kontroll (PC)
    1. Tillsätt 2,5 | il av 100 mM MgCl2 och 5 | il 500 pM ATP till brunnen av en 384-mikrotiterplatta.
    2. Ta den totala väl volymen till 50 | il med 50 mM HEPES (pH 7,4), blanda genom pipettering. Potentiella hämmare kan införlivas i PC lösningen innan föra volymen till 50 pl med buffert.
  4. Negativ kontroll (NC)
    1. Tillsätt 2,5 | il av 100 mM MgCl2 och 5 | il ddHaO 2 O till brunnen av en 384-microtiter plattan.
    2. Ta den totala väl volymen till 50 | il med 50 mM HEPES (pH 7,4) och blanda genom pipettering.
  5. Övertryck PC och NC cofaktorer assay
    1. Följ steg 6.3.1 i protokollet.
    2. Ålder arrayer vid 80-90% luftfuktighet under 2 timmar vid rumstemperatur.
  6. Slide färgning
    1. Placera tryckt microarray glider individuellt i en petriskål med tillräckligt färgämne (från kit) för att täcka hela bilden. Skaka måttligt (~ 200 rpm) under 45 minuter på en platta shaker.
    2. Ta bilden med hjälp av pincett och placera i en ren petriskål med tvättbuffert (från kit). Skaka måttligt (~ 200 rpm) under 45 minuter på en platta shaker.
    3. Ta bilden med hjälp av pincett och centrifugera med en konventionell mikrocentrifug stationär microarray utrustad med en hållare.

8. Microarray Imaging och analys

  1. Imaging

    Observera att avbilda metoden kommer att vara specifika till den typ av array reader tillgängliga. För dessa studier en Alpha Innotech NovaRay imager med en vit ljuskälla och CCD detektionssystem utrustad med en 478 ± 17 nm excitation och 538 ± 21 nm emissionsfilter för AChE-mikroarrayer och 530 ± 40 nm excitation och 614 ± 62 nm emission filtrera efter kinas microarrays användes. Konfokala laser scanning system kan också användas för att läsa av matriser, även om inställningarna kommer att vara specifik för instrumentet.

    1. Placera objektglaset i diapositivhållaren med fläckar uppåt.
    2. Ange antalet förhandsgranska sektioner (minst 2 rekommenderas, en på vardera änden av objektglaset), upplösning (minst 4 pm rekommenderas) och exponering (Auto rekommenderas) i bildbehandlingsprogram.
    3. Förvärva slide bilden och spara som ett ". Tiff" filen.
  2. Analys
    1. Öppna förvärvade diabilden i ImageJ64.
    2. Klicka på ovala markeringsverktyget och mätsignal intensiteten för varje plats med hjälp av åtgärden alternativ under fliken Analysera. Vid val av område för att mäta, markera ett område något större än den observerade fläcken och konsekvent storlek bland platser för att minska ImageJ subjektivitet.
    3. Genomsnittlig intensiteten från 25 liknande PC fläckar, dividerat med genomsnittligt intensiteten av 25 liknande NC fläckar att få PC / NC nyckeltal för de enskilda materialkompositionerna.

Representative Results

Genom att utföra en guidad faktoranalys för materialet skärmen, kunde vi minimera antalet material som testats från ~ 20.000 till några hundra som hade gelbildningstider gånger lämpar sig för utskrift. Genom att tillämpa en strikt riktlinje kräver tid material gelning av 2,5 h eller högre, var material som kan täppa till tryckerier stift eller producera reproducerbara arrayer aldrig ut. De utskrivbara material som identifierats ha tillräckliga (> 2,5 h) gelbildningstider gånger trycktes på 4 olika funktionaliserade ytor glasskiva. För att betraktas som "tryckbart", hade det maximala antalet fläckar per upptag volym av tappen som skall tryckas (SMP3 = 200). Ställen bedömdes också för spot morfologi att säkerställa att ingen sprickbildning eller oönskad fasseparation hade inträffat med hjälp av enkla brightfield mikroskopi såsom visas i figur 2.

Från detta skede av identifierade utskrivbara material, var mikromatriser produceras med magen ochkinaser införlivas i den buffrade vattenhaltiga komponenten. Material som var förenliga med analysförfarandet (inklusive eventuella övertryck och tvättning eller färgning steg) identifierades genom att observera kvarhållande av microarray fläckar (ingen sprickbildning, förlust av fläckar eller ovanliga fluorescens mönster) och en positiv kontroll (PC) till negativ kontroll (NC ) kvot större än 1 som observeras genom bilden. Eftersom detta var ungefär 50% av materialet, en större PC / NC-förhållande av 3 användes för att definiera optimala material med bibehållen proteinaktivitet. Genom denna metod, 26 sol-gel-härledda material innehållande magen och två material innehållande kinaser uppfyllde> 3 PC / NC kriterier. Figur 3 och Figur 4 visar en grafisk uppdelning av de fem guidade steg materiella skärmen för identifiering av optimal magen och kinas microarrays, respektive.

Analyserna kan också utvärderas genom generering av en Z 'poäng. 17 Figur 5. Värken och arrayer kinas resulterade i respektive Z-poäng på 0,60 och 0,67, vilket tyder på en utmärkt analys. Emellertid bör det noteras att före analys validering, hade på-array enzym, färgämne, substrat och kofaktör koncentrationer kan optimeras genom övertryckning ett intervall av koncentrationer av varje komponent och välja den koncentration som producerade den högsta signalen, såsom beskrivs i detalj på annat ställe . fem

Att validera analyserna, var kvantitativa inhiberingsdata erhållits med kända och okända AChE-inhibitorer, med resultat som utförs i två exemplar och används för att producera dubbla tomter (Figur 6A) och kurvor inhibering (figur 6B och 6C). <strong> Spots först överexponeras med blandningar av kända biologiskt aktiva små molekylinhibitors sedan med färg och substrat, och kontroll blandningar innehållande antingen kända hämmare eller ingen inhibitor ingick. Duplicate tomter genererades att bedöma enzymaktivitet, och eventuella blandningar som ger mindre än 25% enzymaktivitet betraktades som positiva med avseende på inhibering. Individuella föreningar från sådana blandningar testades sedan i duplikat för att identifiera de specifika liten molekyl (er) som ansvarar för inhibering. När detta har skett, är dessa små molekyler användes för att generera kvantitativa hämningskurvor för att bestämma IC50-värden och konstanter hämning.

Liknande kvalitativa resultat erhölls med användning av multikinashämmare array med en gemensam kinasinhibitor, staurosporin. Figur 7A och 7B visar microarray bilden och indikerar att signalintensiteterna efter övertryckning och färgning av multikinashämmarearray är som väntat för en negativ kontroll (- ATP), positiv kontroll (+ ATP) och känd hämmare (+ ATP + inv). Visa förmåga att erhålla kvantitativa inhiberingsdata från microarrays, var en koncentrationsberoende hämning analysen görs för en enda kinas. Såsom visas i figurerna 8A och 8B, minskar signalintensitet som ökar inhibitorkoncentration, och svaret följer det förväntade koncentrationsberoende hämning kurvan för p38α/MBP kinas / substrat-system.

Figur 1
Figur 1. Allmänt schema för den guidade material screening. Varje block representerar ett steg av skärmen i sekventiell ordning. Siffrorna på vänster representerar det totala antalet material framställda för analys. Använda en gelningstid större än 2,5 tim (material med gelbildningstider gånger mindre än 2,5 timmar are indikeras av utslagning), är antalet material som passerade varje steg och överförs under den aktuella skärmen visas med numret till höger. * Representerar material med mindre än optimal fas separation.

Figur 2
Figur 2. Optiska bilder som visar olika felsituationer material på tryckbarhet steg på skärmen. En bild av ett "bra" material (andra raden, tredje kolumnen) visas också som jämförelse. Omtryckt med tillåtelse från referens 8, copyright 2013 American Chemical Society.

Figur 3
Figur 3. En riktad material screening för identifiering av optimala material för tillverkning av sol-gel-härledda AChE mikromatriser. Omtryckt med permissionen från referens 5, copyright 2013 American Chemical Society.

Figur 4
Figur 4. En riktad material screening för identifiering av optimala material för att tillverka sol-gel-härledda kinas microarrays. Omtryckt med tillåtelse från referens 8, copyright 2013 American Chemical Society.

Figur 5
Figur 5. (A) En del av AChE microarray visar HC (ljust grön) och LC (ljusgrön) fläckar (en svart-grön palett applicerades som pseudofärger för tydlighet presentation), (B) en förstorad bild av den inramade området för att markera plats morfologi och anpassningen;. och (C) en Z 'tomt Heldragna linjer indikerar medelvärdet av replikat, medan streckade linjerna motsvarar 3SD. Omtryckt med tillåtelse från referens 5, copyright 2013 American Chemical Society.

Figur 6
Figur 6. (A) Duplicera plot för på-array screening av syntetiska analoger av Amaryllidaceae alkaloider, (B) IC 50 tomter av identifierade potentiella inhibitorer markerade som föreningar 1 och (C) förening 2, med felstaplar representerar en standardavvikelse av medelvärdet från 25 replikat. Representativa fläckar visas för att illustrera skillnader i signal proportionell mot inhibitorkoncentrationer. Omtryckt med tillåtelse från referens 5, copyright 2013 American Chemical Society. Klicka här för att visa en större bild .

nt "fo: keep-together.within-sida =" alltid "> Figur 7
Figur 7. On-array-analys av fyra kinaser använder 1.4SS/1.0PVA för infångning och trycks på en amin-derivatiserade slide. (A) En bild av en del av microarray där fläckarna med kinaser co-inneslutna med sina respektive substrat övertryckas med buffert (NC, översta raden), eller lösningar innehållande ATP (PC, mellersta raden) eller ATP + staurosporine (nedersta raden). (B) Stapeldiagram jämför signalintensiteter mellan hämmade och ohämmade reaktioner, efter subtraktion av bakgrunden signaler och felstaplar representerar en standardavvikelse av medelvärdet från 25 replikat. Omtryckt med tillåtelse från referens 8, copyright 2013 American Chemical Society.

Figur 8
Figur 8. Inhibiti. på analys på en p38a/MBP microarray (A) Delar av microarrays visar representativa fläckar overspotted med varierande koncentrationer av staurosporin, såsom anges (bilderna erhölls genom en scan av samma bild, sammansatt bild visas för tydlighetens skull). (B) IC 50 kurva som genereras från de analyserade array bilderna. Intensiteten erhölls vid 100 mM subtraherades från alla bilder; alla andra intensiteter normaliserades genom att ställa in intensiteten erhålls vid 10 nM till ett värde på 100% aktivitet. Omtryckt med tillåtelse från referens 8, copyright 2013 American Chemical Society.

Figur 9
Figur 9. Bilder av mikroskopiska stealth stift används för kontaktstift-utskrift som visar olika brister: (A) igensatt, (B) böjd.

Discussion

Den metod som beskrivs här valdes som den mest lämpade för att identifiera skrivbara sol-gel erhållet material med en kontakt skrivare, som producerar en tid-och kostnadseffektivt förfarande för att snabbt identifiera optimala material utan att screena ett stort antal material. Av totalt ~ 20.000 potentiella material, var det möjligt att identifiera ~ 200 material som var lämpliga för utskrift på grundval av gelningstiden ensam. Detta minskade signifikant antalet material som behövs för att vara förberedd för senare utskrift prövningar. Dessa utskrivbara material sedan tryckt på 4 glidytor för totalt 768 material-slide kombinationer. I genomsnitt kan 50 platser / replikat av ett material tryckas i ~ 3 min, inklusive provladdning, spot nedfall och pin rengöring. Av de 155 ämnen, eller ungefär 20%, tillåten för utskrift det maximala antalet punkter per lösning upptag och producerade reproducerbara spot storlekar. Det bör noteras att av de 4 slide ytor testas, tryckt material bättre i ordning: amin> epoxy> aldehyd> PMMA, PMMA glider inte producera användbara matriser för något material. Detta var troligen hänföras till polariteten hos ytbeläggningen. Jämföra ovannämnda glidytorna, var den mer polära amin och epoxi bättre lämpade för de vattenhaltiga soler jämfört med PMMA diabilder. Dessutom, av de testade ytor, amin belagda bilderna ger en potentiell positivt laddad yta för den avsatta anjoniska sol till förbindelsen. Vi misstänker, nanopartiklar kiseldioxiden vid gränsytan mellan objektglaset och solen interagera längs ytan. Både epoxi och aldehyden ytor glider saknar samma initiala laddningen-baserad interaktion. För att säkerställa optimal plats nedfall är det starkt rekommenderat att använda pre-belagda diabilder från en leverantör som Arrayit. In-house beläggning producerar inkonsekventa ytor som leder till dålig reproducerbarhet fläck 13 och i vissa fall kan leda till kvantifiering probblem. 18 Av lika stor vikt, temperatur och luftfuktighet påverkar "tryckbarhet" av materialen. Även om detaljerade studier av effekterna relaterade till temperatur utfördes, var utskrifter alltid utföras vid rumstemperatur (23 ± 3 ° C). Fuktighet (större än 80%) har också kontrolleras inom tryckets kammaren för att förhindra oregelbunden form nedfall på grund av små nedfall volymer (0,7-2,3 nl) och indunstning.

Medan materialet skärmen styrdes mot att identifiera optimala sol-gel erhållet material speciellt för tryckning av magen och kinaser, en liten uppsättning av material identifierades som arbetade för båda typerna av proteiner. I själva verket var de båda materialen som identifierades för kinas microarray tillverkning baserad på SS + PVA + glycerol, och båda materialen identifierades även inom de 26 material valda för AChE mikromatriser. Dessa "optimala" material kan erbjuda en generisk utgångspunkt för att utveckla ytterligare protein-dopade sol-gel baserad mikroarray och små skärmar centrerade kring dessa kompositioner kan identifiera ännu bättre material för microarray tillverkning. En andra punkt att notera är vikten av det använda enzymet. I fallet med AChE (en ganska robust enzym), behöll 26 (eller ca 40%) av de ursprungliga 66 material som identifieras som analys-kompatibel aktiviteten av innesluten värker. Men för de mer känsliga kinaser, var endast 2 av de 69 assay-kompatibla kompositioner, eller ungefär 3% av de material, kunna behålla aktiviteten hos alla kinaser. Medan tillräckligt många olika enzymer inte har studerats för att göra entydiga uttalanden, verkar det som optimerande array tillverkning med relativt instabila enzymer kan leda till identifiering av material som kan innesluta en mängd olika proteiner för att tillåta mutliplexed microarray tillverkning.

Oberoende av det valda proteinet, var den främsta cut-off faktor för identifiering utskrivbara material behovet av en långmaterial gelbildningstider gånger (> 2,5 h). När man utvecklar SS baserade sol-gel-material, är det mycket viktigt att säkerställa att, efter jonbyte och filtrering, är solen vid ca pH 4. Soler med ett lägre initialt pH kan resultera i material med ett lägre-än-neutralt pH, vilket kan påverka enzymaktiviteten. 19 justering av mängden av Dowex (jonbytarharts) till SS kan förändra det slutliga pH hos solen. När en ny sats av hartset framställs förhållandet harts till SS måste anpassas så att de ger soler vid ca pH 4 enligt förfarandet i avsnitt 2 i protokollet.

Likaså är framställningen av kristallina DGS ofta en källa till fel i samband med materialbrott vid användning DGS soler för biomolekylen infångning. Även om det inte redovisas här i detalj, måste stor försiktighet iakttas under syntesen av kristallina DGS, i synnerhet behovet av att undvika förekomsten av vatten under syntesen, vilket kan producera polyglycerated kiseldioxidtes snarare än monomera DGS. Också, på grund av den hygroskopiska naturen av DGS, måste den kristallina provet som skall förvarades med torkmedel och användas inom 6 månader efter syntes. Kristallina DGS äldre än 6 månader får inte lösas upp helt (på grund av partiellt kondenserat polyglyceryl silikatmaterial) även med sonikering i en sur miljö. Ofullständig DGS upplösning ger soler med okända och okontrollerbara kiseldioxidinnehåll och därmed mindre robust material.

En viktig punkt att notera med kontakt utskrift är kvaliteten på stiften. Skadade eller felaktig hantering stift (figur 9) kommer aldrig att ge reproducerbara arrayer oberoende av det material som skrivs ut. Det rekommenderas att kontrollera pin kvalitet med hjälp av en dissektion mikroskop för att se trasiga eller igensatta stift inte används. Noggrann hantering säkerställer lång livslängd för stiften. Fri rörelse av stiftet är också viktigt. I de fall där fukten är fångad i skrivarhuvudet mellan huvudet och tappen, tappeninte sittplats korrekt och därmed inte gör ordentlig kontakt med ytan, vilket resulterar i en brist på avsättning av material.

Sammanfattningsvis har vi en detaljerad, flerfassilanordning strategi för utvecklingen av high-density protein dopade pin-tryckta mikromatriser. Screeningen omfattar optimering av materialegenskaper (gelningstid och tryckbarhet) för att tillåta tryckning av material, följt av mer fokuserade screening för att identifiera material som är kompatibla med en given analys och kunna behålla enzymaktivitet. Denna guidade material screening metod kan tillämpas på ytterligare microarray format för att minska tid och kostnader förknippade med att producera effektiva hög densitet mikromatriser.

Disclosures

Vi har inget att lämna ut.

Acknowledgments

Författarna tackar Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Little, Xin Ge och Laura Lautens för hjälp i utvecklingen av protein microarrays. Författarna tackar också för naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC) för att finansiera detta arbete. Författarna tackar också Canada Foundation for Innovation och Ontario Innovation Trust för att stödja detta arbete. JDB innehar Kanada forskning ordförande i Bioanalytiska kemi och Biointerfaces.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagent/Material
Poly(vinyl alcohol) (PVA) Sigma-Alderich 360627 80% hydrolozyed, Mw 600
Polyethylene glycol 600 (PEG) Sigma-Alderich 87333  
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Alderich 482595 50 wt% solution in water
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH) Gelest, Inc. SIC2263.0 25% in water
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS) Gelest, Inc. SIT8189.0 50% in ethanol
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO) Gelest, Inc. SIB1660.0  
Methyltrimethoxysilane (MTMS) Gelest, Inc. SIM6560.1  
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS) Gelest, Inc. SIB1817.0  
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) Gelest, Inc. SIA0610.0  
Glycerol Sigma-Alderich 49767  
D-Sorbitol Sigma-Alderich 240850  
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma-Alderich T9531  
Triton X-100 Sigma-Alderich X-100  
Nε-Acetyl-L-lysine Sigma-Alderich A4021  
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Alderich 154563  
HEPES Sigma-Alderich H3375  
Sodium hydroxide, 1.0 N LabChem Inc. LC24350-2  
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N LabChem Inc. LC15300-2/LC152220-2  
Magnesium chloride Sigma-Alderich M8266  
Diglycerolsilane (DGS) Prepared in laboratory
Sodium silicate solution Fisher Scientific SS338-1  
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin Sigma-Alderich 217492  
Acetylthiocholine iodide Sigma-Alderich 1480  
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel) Sigma-Alderich C2888  
BODIPY FL L-Cystine Invitrogen B-20340  
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit Invitrogen P33706  
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution Sigma-Alderich A6559  
MAP Kinase 2 (MAPK2) EMD Millipore 454850  
p38α/SAPK2a (T106M), active EMD Millipore 14-687M  
Epidermal growth factor (EGFR) EMD Millipore Donated by Millipore
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) EMD Millipore 14-306  
Myelin basic protein (MBP) EMD Millipore Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore
GSM EMD Millipore 12-533 Substrate for GSK-3β
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y) EMD Millipore 12-440 Substrate for EGFR
Stealth pin ArrayIt SMP3  
Stealth pin ArrayIt SMP7  
Amine coated slides ArrayIt SMM2  
Aldehyde coated slides ArrayIt SMA2  
Exposy coated slides ArrayIt SME2  
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides Exakt Technologies Inc. 41500  
0.2-μm syringe filter PALL Life Sciences 4612  
  Equipment
Virtek Contact Printer BioRad  
Novaray Fluorescence Slide Imager Alpha Innotech Corporation  
Desktop microarray centrifuge ArrayIt MHC110V  
MilliQ Synthesis A10 Millipore Used to filter all water required for experiments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schena, M. M., Shalon, D. D., Davis, R. W. R., Brown, P. O. P. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science (New York, N.Y.). 270 (5235), 467-470 (1995).
  2. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).
  3. Zhu, H. H., Bilgin, M. M., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science (New York, N.Y.). 293 (5537), 2101-2105 (2001).
  4. Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment. Nature Biotechnology. , (2012).
  5. Monton, M. R. N., Lebert, J. M., Little, J. R. L., Nair, J. J., McNulty, J., Brennan, J. D. A Sol-Gel-Derived Acetylcholinesterase Microarray for Nanovolume Small-Molecule Screening. Analytical Chemistry. 82 (22), 9365-9373 (2010).
  6. Cho, E. J., Tao, Z., Tehan, E. C., Bright, F. V. Multianalyte pin-printed biosensor arrays based on protein-doped xerogels. Analytical Chemistry. 74 (24), 6177-6184 (2002).
  7. Cho, E. J., Tao, Z., et al. Tools to Rapidly Produce and Screen Biodegradable Polymer and Sol-Gel-Derived Xerogel Formulations. Applied Spectroscopy. Society for Applied Spectroscopy. 56 (11), 1385-1389 (2002).
  8. Ge, X., Lebert, J. M., Monton, M. R. N., Lautens, L. L., Brennan, J. D. Materials Screening for Sol-Gel-Derived High-Density Multi-Kinase Microarrays. Chemistry of Materials. 23 (16), 3685-3691 (2011).
  9. Rupcich, N., Green, J. R. A., Brennan, J. D. Nanovolume Kinase Inhibition Assay Using a Sol-Gel-Derived Multicomponent Microarray. Analytical Chemistry. 77 (24), 8013-8019 (2005).
  10. Rupcich, N. Coupled enzyme reaction microarrays based on pin-printing of sol-gel derived biomaterials. Analytica Chimica Acta. 500 (1-2), 3-12 (2003).
  11. MacBeath, G. G., Schreiber, S. L. S. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).
  12. Stillman, B. A. B., Tonkinson, J. L. J. FAST slides: a novel surface for microarrays. BioTechniques. 29 (3), 630-635 (2000).
  13. Rupcich, N., Goldstein, A., Brennan, J. D. Optimization of sol-gel formulations and surface treatments for the development of pin-printed protein microarrays. Chemistry of Materials. 15 (9), 1803-1811 (2003).
  14. Gill, I., Ballesteros, A. Encapsulation of biologicals within silicate, siloxane, and hybrid sol-gel polymers: An efficient and generic approach. Journal of the American Chemical Society. 120 (34), 8587-8598 (1998).
  15. Brook, M. A., Chen, Y., et al. Proteins entrapped in silica monoliths prepared from glyceroxysilanes. Journal of Sol-gel Science and Technology. 31 (1), 343-348 (2004).
  16. Brook, M. A., Chen, Y., Guo, K., Zhang, Z., Brennan, J. D. Sugar-modified silanes: precursors for silica monoliths. Journal of Materials Chemistry. 14 (9), 1469 (2004).
  17. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  18. Next generation of protein microarray support materials: Evaluation for protein and antibody microarray applications. Journal of Chromatography A. , 1-8 (2013).
  19. Bhatia, R. B., Brinker, C. J., Gupta, A. K., Singh, A. K. Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation. Chemistry of Materials. 12 (8), 2434-2441 (2000).

Tags

Kemi Biochemistry Chemical Engineering molekylärbiologi genetik bioteknik medicinsk teknik biokompatibla material Siloxaner enzymer Immobilized kemiska analystekniker kemi (allmänt) material (allmänt) spektroskopisk analys (kemi) polymer matris kompositer provning av material (kompositmaterial) Sol-gel microarray high-throughput screening acetylkolinesteras kinas läkemedelsutveckling analys
En guidad Materials Screening strategi för utvecklingen av kvantitativa Sol-gel protein från Microarrays
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Helka, B. J., Brennan, J. D. A… More

Helka, B. J., Brennan, J. D. A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays. J. Vis. Exp. (78), e50689, doi:10.3791/50689 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter