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Chemistry

मात्रात्मक सोल जेल व्युत्पन्न प्रोटीन के विकास के लिए एक गाइडेड सामग्री स्क्रीनिंग दृष्टिकोण

Published: August 26, 2013 doi: 10.3791/50689
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University

Summary

निर्माण के एक उभरते पिन मुद्रण विधि का उपयोग कर प जेल व्युत्पन्न प्रोटीन डाल दिया गया प्रोटीन विकसित करने के लिए एक निर्देशित सामग्री स्क्रीनिंग दृष्टिकोण वर्णित है. इस पद्धति को लागत प्रभावी छोटे अणु स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जाता है जो एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ और multikinase प्रोटीन के विकास के माध्यम से प्रदर्शन किया है.

Abstract

डीएनए नई सामग्री और छोटे अणु दवा सुराग की खोज के लिए उच्च throughput assays के विकास में उपयोग मिल गया है. इस के साथ साथ हम तीन आयामी प्रोटीन के उत्पादन के लिए उपयुक्त हैं कि प जेल आधारित सामग्री की पहचान करने के लिए एक निर्देशित सामग्री स्क्रीनिंग दृष्टिकोण का वर्णन है. दृष्टिकोण पहले, प्रोटीन के रूप में मुद्रित किया जा सकता है कि सामग्री को दिखाता अधिकतम एंजाइम गतिविधि की अवधारण के आधार पर दिया एंजाइम परख के साथ संगत कर रहे हैं कि उन लोगों के, और फिर इष्टतम सामग्री पर hones पहचान के द्वारा सामग्री की संख्या नीचे संकरी. इस दृष्टिकोण के कैंसर में शामिल चार प्रमुख kinases के एक सेट का उपयोग कर एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ और अन्य का उपयोग करते हुए दो अलग एंजाइम assays के, एक के लिए उपयुक्त प्रोटीन विकसित करने के लिए लागू किया जाता है. प्रत्येक मामले में, यह मात्रात्मक छोटे अणु स्क्रीनिंग assays और खुराक पर निर्भर अवरोध प्रतिक्रिया घटता के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रोटीन का उत्पादन संभव था. महत्वपूर्ण बात है, की क्षमता कई दोस्त की छानबीन के लिएrials सबसे अच्छा एंजाइम गतिविधि का माइक्रोएरे उत्पादन और बनाए रखने के लिए दोनों के लिए अनुकूल है कि सामग्री के प्रकार के बारे में जानकारी का उत्पादन किया. सामग्री डेटा इष्टतम, उच्च घनत्व प जेल व्युत्पन्न प्रोटीन सिलाई के लिए आवश्यक आधारभूत सामग्री आवश्यकताओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं.

Introduction

प्रोटीन परख throughput बढ़ाने के लिए एक विधि के रूप में वैज्ञानिक समुदाय के भीतर लोकप्रियता हासिल की है. माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी का विकास 1990 के दशक में जीन की अभिव्यक्ति 1 का आकलन करने के बाद, प्रोटीन प्रोटीन, प्रोटीन और प्रोटीन छोटे अणु बातचीत की पहचान करने के लिए, और विशिष्ट गुणों के साथ नई सामग्री खोजने के लिए उच्च throughput assays के विकास में उपयोग मिल गया है. 2-5 अभी हाल ही में डीएनए एक उपयुक्त प्रतिदीप्ति का उपयोग माइक्रोएरे पर ही enzymatic गतिविधि और निषेध के सतही माप के लिए अनुमति देता है, विशिष्ट सामग्री प्रोटीन फँस जाता है, जिसके भीतर एक तीन आयामी माइक्रोएरे तत्व उत्पादन, कार्यात्मक स्थिर प्रोटीन का इस्तेमाल किया जाता है जिसमें विकसित किया गया है सब्सट्रेट कारोबार के लिए युग्मित है कि परख. 5-10 महत्वपूर्ण बात है, इस तरह के प्रोटीन के एक उच्च समानांतर फैशन में एक साथ सभी आवश्यक स्क्रीन नमूने लिए उपकरणों और नियंत्रण शामिल करने के लिए तैयार किया जा सकता है. 5,8 </ P>

प्रोटीन के प्रारंभिक उदाहरण आम तौर पर इस तरह के सहसंयोजक लगाव के रूप में ठोस समर्थन करता है, पर प्रोटीन स्थिरीकरण के लिए मानक विधियों का प्रयोग करके तैयार किए गए, 11 आत्मीयता 3 कब्जा और शारीरिक सोखना. 12 जैव स्थिरीकरण के इन तरीकों के लिए आवश्यक वृद्धि हुई नमूना एकाग्रता और त्वरित प्रतिक्रिया कैनेटीक्स के लिए अनुमति परख miniaturization की, वे हर कमियां पीड़ित हैं. सामान्य में, सब एक सतह की रासायनिक परिवर्तन के कारण देशी बायोमोलिक्यूल कार्यक्षमता में कमी, सक्रिय साइटों के लिए उपयोग रुकावट, या गैर विशिष्ट स्थिरीकरण के कारण अनुचित अभिविन्यास कारण. इस प्रकार, बायोमोलिक्यूल बयान में वृद्धि की संभावना कृत्रिम रूप से एक सतह के लिए biomolecules बाध्य करने की जरूरत की वजह से उठता है कि एक प्रतिक्रिया के बावजूद सभी तरीकों कम परख संवेदनशीलता में परिणाम.

कार्यात्मक बायोमोलिक्यूल प्रोटीन के उत्पादन के लिए एक उभरते दृष्टिकोण प्रोटीन डाल दिया गया की पिन मुद्रण के माध्यम से होता हैआम तौर पर या तो functionalized गिलास स्लाइड या microwell प्लेटों के व्यक्तिगत कुओं हैं जो ठोस समर्थन पर सिलिका SOLS,. प जेल प्रक्रिया ही कमरे के तापमान पर एक जलीय वातावरण में जगह लेता है, और यह के भीतर 13 लोड हो रहा है और साथ ही कई घटकों के फंसाने उच्च प्रोटीन के लिए अनुमति देता है, मुद्रित और फिर 3 डी मैट्रिक्स के भीतर फंसाने biomolecules करने जैल है कि तरल अग्रदूत है एक ही माइक्रोएरे तत्व. प जेल व्युत्पन्न सामग्री की 13,14 सिलाई के साथ ही विभिन्न buffers के उपयोग (पीएच, ईओण ताकत) के माध्यम से जलीय घटक बदलकर, विभिन्न सिलिका व्यापारियों का चयन सावधानी से किया है, और शामिल किए जाने के किया जा सकता है एक इष्टतम सामग्री प्राप्त करने के लिए विभिन्न additives (पॉलिमर, छोटे अणुओं), जो की विशिष्ट प्रकृति फँस जाता है कि बायोमोलिक्यूल पर निर्भर करता है. 10

पिन मुद्रण के माध्यम से प जेल व्युत्पन्न प्रोटीन के विकास के साथ जुड़े एक संभावित सीमा हैपिन के बीच बढ़िया तालमेल के बिना मुद्रित या एक बार एक सतह पर मुद्रित अवांछनीय गुण (irreproducible स्थान आकार, खुर, गरीब आसंजन, परख घटकों के साथ असंगति, गरीब प्रोटीन गतिविधि) दिखा जा सकता है कि प जेल आधारित मिश्रित सामग्री की पहचान करने की जरूरत है. 5 एक साथ इन मानकों के सभी के अनुकूलन के लिए एक दृष्टिकोण है जिसमें सामग्री नए सिरे से तैयार किया जा सकता है precludes, या एक धारावाहिक तरीके से धीरे से जांच की. दूसरी ओर, कई हजार या सामग्री के हजारों के यादृच्छिक स्क्रीनिंग न तो समय और न ही लागत प्रभावी है.

इस अनुच्छेद में, हम बेतरतीब ढंग से माल की बड़ी संख्या स्क्रीन की जरूरत के बिना प्रोटीन के उत्पादन के लिए उपयुक्त सामग्री की तेजी से पहचान की अनुमति देता है कि एक निर्देशित स्क्रीनिंग दृष्टिकोण का वर्णन है. एक निर्देशित दृष्टिकोण का प्रयोग, माइक्रोएरे मुद्रण के लिए उपयुक्त सामग्री पहले की पहचान करने के लिए छोटे पैमाने पर स्क्रीन की एक श्रृंखला के बाद, पहचान कर रहे हैं प जेल materi व्युत्पन्न इष्टतमअल संयोजनों कि खुर के बिना, reproducibly मुद्रित और एक दिया परख के साथ संगत कर रहे हैं किया जा सकता है. अंत में, इष्टतम सामग्री एक अंतिम छोटे अणु स्क्रीनिंग परख में एंजाइम गतिविधि और प्रदर्शन की अवधारण के आधार पर पहचाने जाते हैं. इस तरह, इष्टतम सामग्री केवल कुछ सौ परख चरणों का उपयोग कर कई हजार उम्मीदवारों से पहचाना जा सकता है. हम उच्च घनत्व एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ और multikinase प्रोटीन और छोटे अणु स्क्रीनिंग के लिए इस तरह के प्रोटीन के उपयोग दोनों के निर्माण के लिए इस दृष्टिकोण को प्रदर्शित करता है.

Protocol

1. यौगिक समाधान की तैयारी

  1. 25 और 50 मिमी Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris आधार, एम आर 121.14 छ / mol) और HEPES में पीएच 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0 और 8.2 पर (एम आर 238.3 छ / mol) 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र तैयार ट्यूबों. क्रमशः 1 एन एचसीएल और NaOH, का उपयोग कर पीएच को समायोजित करें. कमरे के तापमान पर स्टोर और 3 महीने के बाद जगह.
  2. पाली (vinyl शराब) (PVA) 24% (w / वी) तैयार: PVA (एम डब्ल्यू 9000 - 10,000, 80% हाइड्रोलाइज्ड) की 2.4 ग्राम वजन और विआयनीकृत-आसुत जल (DDH 2 हे) के 10 मिलीलीटर जोड़ने, भंग vortexing द्वारा बहुलक छर्रों. 16% के बराबर मात्रा (w / वी), 12% (w / v) और 8% (w / v) PVA समाधान तैयार करने के लिए 24% (w / v) समाधान का प्रयोग करें. उपयोग करने से पहले sonication द्वारा देगास समाधान. 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  3. 24% (w / v) पॉलीथीन imine (पी) तैयार: DDH 2 ओ के 5.2 मिलीलीटर के लिए पी (एम डब्ल्यू 1300, एच 2 ओ में 50% (डब्ल्यू / डब्ल्यू)) की 4.8 मिलीलीटर जोड़ें बराबर मात्रा में तैयार करने के लिए 24% (w / v) समाधान का प्रयोग करें16% की (w / वी), 12% (w / v) और 8% (w / v) पी समाधान. उपयोग करने से पहले sonication द्वारा देगास समाधान. 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  4. (W / वी) polyethylene glycol (खूंटी) 60% तैयार: खूंटी (एम डब्ल्यू 600) की 6 ग्राम वजन और DDH 2 हे की 10 मिलीलीटर जोड़ने, vortexing द्वारा बहुलक छर्रों भंग. 30% के एक बराबर मात्रा (w / वी) खूंटी समाधान तैयार करने के लिए धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रयोग करें. उपयोग करने से पहले sonication द्वारा देगास समाधान. 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  5. - करने के लिए जी एल एस के 480 μl (शेयर जी एल एस क्रिस्टलीय अगर समाधान गर्म और भंग करने के लिए एक पानी के स्नान के उपयोग की आवश्यकता हो सकती इथेनॉल में 50%) जोड़ें: (v / v) एन (3 triethoxysilylpropyl) gluconamide (जी एल एस) 24% तैयार करें sonication द्वारा 20 मिनट के लिए 95% की 520 μl (v / v) और इथेनॉल मिश्रण. 16% के एक बराबर मात्रा (v / v) जी एल एस समाधान बनाने के लिए 24% (v / v) समाधान का प्रयोग करें. प्रति दिन उपयोग के लिए नए सिरे से समाधान करें.
  6. (V / v) 24% तैयार methyltrimethoxysilane (MTMS): मौजूदा acidified DDH 2 ओ (के 760 μl को MTMS के 240 μl जोड़नेपीएच 2.0, 1 एन एचसीएल) और sonification से 20 मिनट के लिए मिश्रण. 16% के एक बराबर मात्रा (v / v) MTMS समाधान बनाने के लिए 24% (v / v) समाधान का प्रयोग करें. प्रति दिन उपयोग के लिए नए सिरे से समाधान करें.
  7. के लिए मौजूदा acidified DDH 2 ओ (पीएच 2.0, 1 एन एचसीएल) और मिश्रण के 760 μl को MDSPPO के 240 μl जोड़ने के 20 मिनट: (v / v) बीआईएस [(3 methyldimethoxylsilyl) propyl] पॉलीप्रोपाइलीन ऑक्साइड (MDSPPO) 24% तैयार करें sonification द्वारा. 16% के एक बराबर मात्रा (v / v) MDSPPO समाधान बनाने के लिए 24% (v / v) समाधान का प्रयोग करें. प्रति दिन उपयोग के लिए नए सिरे से समाधान करें.
  8. 24% (v / v) 3 तैयार - (aminopropyl) triethoxysilane (APTES): मौजूदा acidified DDH 2 ओ (पीएच 2.0, 1 एन एचसीएल) और sonification से 20 मिनट के लिए मिश्रण के 760 μl को APTES के 240 μl जोड़ें. 16% के एक बराबर मात्रा बनाने के लिए 24% (v / v) समाधान का उपयोग करें (v / v) समाधान APTES. प्रति दिन उपयोग के लिए नए सिरे से समाधान करें.
  9. 24% तैयार (v / v) बीआईएस (triethoxysily) एटैन (बीआईएस TEOS): मौजूदा acidified DDH 2 ओ (पीएच 2.0, 1 एन एचसीएल के 760 μl के लिए बीआईएस TEOS के 240 μl जोड़ने) और sonification से 20 मिनट के लिए मिश्रण. 16% के एक बराबर मात्रा (v / v) बीआईएस TEOS समाधान बनाने के लिए 24% (v / v) समाधान का प्रयोग करें. प्रति दिन उपयोग के लिए नए सिरे से समाधान करें.
  10. Carboxyethylsilanetriol (सी-COOH) 24% (v / v) तैयार: 40 मौजूदा acidified DDH 2 ओ (पीएच 2.0, 1 एन एचसीएल) की μl और के लिए मिश्रण करने के लिए सी-COOH (DDH 2 हे में 25%) के 960 μl जोड़ने sonification से 20 मिनट. 16% के एक बराबर मात्रा (v / v) सी-COOH समाधान बनाने के लिए 24% (v / v) समाधान का प्रयोग करें. प्रति दिन उपयोग के लिए नए सिरे से समाधान करें.
  11. उधर 3 मिमी एन ε तैयार - एसिटाइल एल lysine, डी sorbitol, α-α-trehalose (एम आर 188.22 छ ​​/ mol, 182.17 छ / mol, और 378.33 क्रमशः छ / mol,) और 1.5 मिमी ट्राइटन X-100 (औसत एम डब्ल्यू 625 छ / mol) DDH 2 ओ में वॉल्यूम की आवश्यकता है कितना आधार पर भिन्न हो सकते हैं, प्रति दिन उपयोग के लिए नए सिरे से समाधान कर सकते हैं.
  12. 60% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) ग्लिसरॉल तैयार: DDH 2 हे, भंवर से मिश्रण की 1.6 ग्राम तक निर्जल ग्लिसरॉल के 2.4 ग्राम जोड़ें. देगास समाधानउपयोग करने से पहले sonication द्वारा. 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  13. 30% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) ग्लिसरॉल तैयार: DDH 2 हे, भंवर से मिश्रण की 2.4 ग्राम तक निर्जल ग्लिसरॉल के 1.6 ग्राम जोड़ें. उपयोग करने से पहले sonication द्वारा देगास समाधान. 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.

2. सिलिका SOLS की तैयारी

नीचे प्रक्रियाओं के बाद, संबंधित SOLS, बर्फ पर रखा है, जब पानी के अलावा के बाद 1 घंटे तक इस्तेमाल किया जा सकता है. कमी आई / असंगत सामग्री जमाना बार में 1 घंटा परिणाम परे इस्तेमाल किया SOLS.

  1. एक सोडियम सिलिकेट (एसएस) आधारित प की तैयारी
    1. एक 500 मिलीलीटर की प्लास्टिक बीकर में आयन एक्सचेंज राल के 120 ग्राम वजन.
    2. 0.1 एन एचसीएल के 150 मिलीलीटर जोड़ें और एक 2 इंच चुंबकीय हलचल पट्टी का उपयोग करते हुए 1 घंटे के लिए हलचल.
    3. वैक्यूम से जुड़े एक Buchner चिमनी का उपयोग कर समाधान फ़िल्टर.
    4. धीरे धीरे परिणामस्वरूप छानना स्पष्ट है जब तक फ़िल्टर्ड राल धोने के लिए DDH 2 हे जोड़ें. यह लगभग 100 लेता हैDDH 2 ओ की मिलीलीटर
    5. 1 महीने के लिए कमरे के तापमान पर एक प्लास्टिक कंटेनर में तैयार राल लीजिए और दुकान.
    6. एक 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक बीकर में सोडियम सिलिकेट (एसएस, 27% ​​(डब्ल्यू / डब्ल्यू) SiO 2, 10% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) NaOH) की 2.59 ग्राम वजन.
    7. एसएस को DDH 2 हे के 10 मिलीलीटर जोड़ें. समाधान मिश्रण को हाथ से धीरे भंवर.
    8. एक अलग 50 मिलीलीटर की प्लास्टिक बीकर में तैयार राल की 5.60 ग्राम वजन. एक एक इंच चुंबकीय हलचल पट्टी का उपयोग कर 2 मिनट के लिए सोडियम सिलिकेट समाधान और मिश्रण में जोड़ें.
    9. एक पानी के नल से जुड़ी एक Aspirator से जुड़े एक Buchner कीप के साथ मिश्रण समाधान फ़िल्टर.
    10. प समाधान फिल्टर करने के लिए फिल्टर एक 0.2 माइक्रोन झिल्ली से लैस एक 10 मिलीलीटर की प्लास्टिक सिरिंज का प्रयोग करें. यह 5.6% के साथ एक प (डब्ल्यू / डब्ल्यू) सिलिका आगे पाठ में एस एस के रूप में भेजा पैदावार. जब उपयोग में बर्फ पर प रखें.
    11. साढ़े एस एस: DDH 2 हे, भंवर से मिश्रण का 1 मिलीलीटर के लिए तैयार एसएस प के 1 मिलीलीटर जोड़ें. जब नहीं में बर्फ पर प रखेंउपयोग.
  2. एक diglycerylsilane (डीजीएस) के आधार प की तैयारी
    1. 6 महीने के लिए कमरे के तापमान पर एक desiccator में. 15,16 स्टोर क्रिस्टलीय महानिदेशकों कहीं वर्णित के रूप महानिदेशकों synthesize.
    2. क्रिस्टलीय महानिदेशकों के लगभग 1 ग्राम वजन.
    3. एक मोर्टार का उपयोग करें और एक ठीक पाउडर के लिए डीजीएस पीसने मूसल. हवा से नमी अवशोषण को रोकने के लिए जल्दी से जल्दी इस चरण को पूरा करें.
    4. एक खाली 20 मिलीलीटर जगमगाहट शीशी को सूक्ष्मता जमीन महानिदेशकों ध्यान से हस्तांतरण, द्रव्यमान (एक ग्राम की एक हज़ारवां के लिए) रिकॉर्ड है.
    5. एक 0.5 ग्राम / एमएल महानिदेशकों को उपज DDH 2 हे जोड़ें.
    6. 5 सेकंड हर 5 मिनट के लिए भंवर से मिश्रण, 20 मिनट के लिए बर्फ पर हाइड्रोलाइज्ड महानिदेशकों Sonicate. उमस भरे दिन के दौरान डीजीएस का पूरा विघटन 1 एन एचसीएल के 10 μl जोड़ने की आवश्यकता हो सकती. इस sonication के पहले समाधान के लिए जोड़ा जाना चाहिए.
    7. ठीक कणों को हटाने, प समाधान फिल्टर करने के लिए फिल्टर एक 0.2 माइक्रोन झिल्ली से लैस एक 3 मिलीलीटर की प्लास्टिक सिरिंज का प्रयोग करें. इस सिलिका आगे पाठ में महानिदेशकों के रूप में भेजा 5.0% (डब्ल्यू / डब्ल्यू) के साथ एक प पैदावार. जब उपयोग में बर्फ पर प रखें.
    8. साढ़े महानिदेशकों: DDH 2 हे, भंवर से मिश्रण का 1 मिलीलीटर के लिए तैयार महानिदेशकों प के 1 मिलीलीटर जोड़ें. जब उपयोग में बर्फ पर प रखें.

3. पूर्व स्क्रीनिंग मुद्रण योग्य सामग्री की पहचान के लिए

प्रिंट करने योग्य सामग्री की पहचान करने के लिए इस्तेमाल निर्देशित कारक विश्लेषण के विभिन्न चरणों दिखा सामान्यीकृत योजना चित्र 1 में दिखाया गया है. 100 μl की एक न्यूनतम कुल सामग्री की मात्रा की सिफारिश की है. छोटे संस्करणों का प्रयोग सामग्री जमाना मुश्किल visualizing बनाता है.

  1. चरण 1: बफर और silane
    1. एक 2 मिलीलीटर कांच जगमगाहट शीशी के लिए बफर के 50 μl (7.0 पीएच में 25 और 50 मिमी Tris या HEPES, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2) जोड़ें.
    2. से 10 सेकंड के लिए एक पर और बंद फैशन में 50 उचित प (डीजीएस, साढ़े महानिदेशकों, एस एस, साढ़े एस एस) की μl और भंवर मिश्रण जोड़ेंभंवर मिक्सर पर और बंद शीशी घूम रहा है.
    3. सामग्री जमाना के समय निगरानी, ​​कमरे के तापमान पर आराम करने के लिए सामग्री निर्धारित करें. जमाना समय सामग्री एक 45 डिग्री कोण तक शीशी घूर्णन पर स्वतंत्र रूप से बहने बंद हो जाता है, जिस पर बिंदु के रूप में परिभाषित किया गया है.
    4. बाद में सामग्री स्क्रीनिंग चरणों से 2.5 घंटे से जमाना गुना कम के साथ सामग्री संयोजन को शामिल न करें.
  2. चरण 2: बफर, silane और बहुलक
    1. एक 2 मिलीलीटर कांच जगमगाहट शीशी में, या तो 16% (w / v) या 8% (w / v) PVA / पी समाधान या 30% की 6.3 μl (w / वी) या 60% (w / 3.13 μl जोड़ने v) के खूंटी समाधान.
    2. , 50 μl के लिए संयुक्त मात्रा लाने के भंवर से समाधान मिश्रण करने के लिए 50 मिमी HEPES (पीएच 8.0) जोड़ें.
    3. उपयुक्त प (डीजीएस, साढ़े महानिदेशकों, एस एस, साढ़े एस एस), कदम 3.1.2 में वर्णित फैशन में मिश्रण के 50 μl जोड़ें.
    4. जमाना बार (के रूप में कदम 3.1.3 में परिभाषित) के बाद सामग्री स्क्रीनिंग चरणों में से कम से कम 2.5 घंटा के साथ सामग्री संयोजन को शामिल न करें.
  3. चरण 3: बफर, silane, बहुलक और organosilane
    1. एक 2 मिलीलीटर कांच जगमगाहट शीशी में, या तो 16% (w / v) या 8% (w / v) PVA के समाधान या 30% (w / v) या 60% (w / वी) के 6.3 μl के 3.13 μl जोड़ने खूंटी समाधान.
    2. 16% से 3.13 μl जोड़ें (w / वी) organosilane (जी एल एस, MTMS, MDSPPO, बीआईएस TEOS, सी-COOH या APTES).
    3. , 50 μl के लिए संयुक्त मात्रा लाने के भंवर से समाधान मिश्रण करने के लिए 50 मिमी HEPES (पीएच 8.0) जोड़ें.
    4. उपयुक्त प (डीजीएस, साढ़े महानिदेशकों, एस एस, साढ़े एस एस) के 50 μl जोड़ें और कदम 3.1.2 में वर्णित फैशन में मिश्रण. जमाना बार (के रूप में कदम 3.1.3 में परिभाषित) के बाद सामग्री स्क्रीनिंग चरणों में से कम से कम 2.5 घंटा के साथ सामग्री संयोजन को शामिल न करें.
  4. स्टेज 4: बफर, silane, बहुलक organosilane और छोटे अणु है additive
    1. एक 2 मिलीलीटर कांच जगमगाहट शीशी में, या तो 24% (w / v) या 12% (w / v) PVA के समाधान या 30% (w / v) या 60% (w / वी) के 6.3 μl के 2.08 μl जोड़ने खूंटी समाधान.
    2. जोड़ना24% से 2.08 μl (w / वी) organosilane (जी एल एस, सी-COOH).
    3. या 1.5 मिमी (ट्राइटन X-100) - 3 मिमी छोटे अणु समाधान (एसिटाइल एल lysine, डी sorbitol, α-α-trehalose एन ε) की 2.08 μl जोड़ें.
    4. , 50 μl के लिए संयुक्त मात्रा लाने के भंवर से समाधान मिश्रण करने के लिए 50 मिमी HEPES (पीएच 8.0) जोड़ें.
    5. उपयुक्त प (डीजीएस, साढ़े महानिदेशकों, एस एस, साढ़े एस एस) के 50 μl जोड़ें और कदम 3.1.2 में वर्णित फैशन में मिश्रण.
    6. जमाना बार (के रूप में कदम 3.1.3 में परिभाषित) के बाद सामग्री मुद्रण चरणों में से कम से कम 2.5 घंटा के साथ सामग्री संयोजन को शामिल न करें.

4. मुद्रण योग्य प्रोटीन डाल दिया गया माल की तैयारी

कदम 3.4.6 के अंत में पहचान की सामग्री अब प में शामिल किया जा रहा उचित एंजाइम के साथ, printability पढ़ाई में आगे बढ़ाया जाता है. Silane के लिए छोड़कर सभी घटकों से युक्त सभी मामलों में नीचे दिये, जलीय घोलमुद्रण के लिए सिर्फ पूर्व प के अलावा द्वारा पीछा किया, एक microwell में तैयार किया जाता है. एक 384 microtiter प्लेट के उपयोग को समायोजित करने के लिए, 50 μl की कुल समाधान मात्रा 100 μl के बजाय प्रयोग किया जाता है.

  1. एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ (दर्द) माइक्रोएरे
    1. बहुत विशिष्ट एंजाइम गतिविधि (मिलीग्राम प्रति गतिविधि की इकाइयों) निर्माता द्वारा उपलब्ध कराई गई जानकारी के बाद 50 मिमी HEPES (8.0 पीएच) में दर्द की एक 2 के यू / एमएल समाधान तैयार है.
    2. -20 डिग्री सेल्सियस पर 500 μl microcentrifuge ट्यूबों और दुकान का उपयोग 5 μl भागों में विभाज्य 2 कू / एमएल एंजाइम शेयर समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत जब 2 कू / मिलीलीटर में दर्द स्टॉक समाधान 4 महीने के लिए स्थिर रहेगा
    3. इसी पॉलिमर, organosilanes और एक 384 अच्छी तरह से microtiter प्लेट में कदम 3.4.6 के माध्यम से पहचान छोटे अणु additives के आधा संस्करणों के संयोजन से सामग्री के आधार पर तैयार करते हैं.
    4. 50 मिमी HEPES (8.0 पीएच) में 2 कू / मिलीलीटर में दर्द के 5 μl जोड़ें.
    5. 50 मिमी HEPES (8.0 पीएच) का उपयोग करना, संयुक्त लानाकई बार नीचे समाधान pipetting और से 25 μl मिश्रण को अच्छी तरह से मात्रा.
  2. Multikinase माइक्रोएरे
    1. निर्माता द्वारा प्रदान की गई गतिविधि (यू / एमएल या यू / मिलीग्राम) और मात्रा जानकारी निम्नलिखित DDH 2 हे में 100 μl / एनजी काइनेज समाधान (p38α, MAPK2, EGFR, जीएसके 3β) तैयार करें. -80 में 2 μl की aliquots में काइनेज समाधान स्टोर डिग्री सेल्सियस
    2. निर्माता द्वारा प्रदान की मात्रा जानकारी के बाद 5 मिलीग्राम / एमएल, DDH 2 हे में 50 मिलीग्राम / एमएल या 300 माइक्रोन से कम काइनेज substrates (MBP, पी (ई 4 वाई), जीएसएम) तैयार करें. -80 में 2.5 μl की aliquots में स्टोर substrates के डिग्री सेल्सियस
    3. इसी पॉलिमर, organosilanes और एक 384 अच्छी तरह से microtiter प्लेट में कदम 3.4.6 के माध्यम से पहचान छोटे अणु additives के आधा संस्करणों के संयोजन से सामग्री के आधार पर तैयार करते हैं.
    4. अच्छी तरह से आधार सामग्री युक्त करने के लिए, 2.5 μl kinase और अपने संबंधित सब्सट्रेट के 2 μl (p38α और MBP, MAPK2 और MBP, EGF जोड़आर पी (ई 4 वाई), जीएसके 3β और जीएसएम) के रूप में क्रमश: कदम 4.2.1 और 4.2.2 में तैयार किया.
    5. 50 मिमी HEPES (7.4 पीएच) का उपयोग करना, 25 μl के लिए संयुक्त अच्छी तरह मात्रा लाने. Pipetting द्वारा मिक्स.

5. माइक्रोएरे गठन

यह खंड एक एकल स्लाइड सतह पर सामग्री मुद्रण के लिए विस्तृत प्रक्रिया बताते हैं. कई संशोधित स्लाइड सतहों पर मुद्रित (अमाइन, epoxy, एल्डिहाइड और PMMA) के लिए, इस प्रक्रिया में 4 बार दोहराया है.

  1. एक xyz के मंच से लैस एक संपर्क पिन मुद्रण रोबोट का उपयोग करके प्रोटीन के रूप में. प्रोटीन डाल दिया गया SOLS जमा करने के लिए 100 माइक्रोन व्यास की slotted म्यान पिंस का प्रयोग करें.
  2. 80-90% करने के लिए मुद्रण कक्ष के भीतर नमी निर्धारित करें. नमी <80% छोटे बयान संस्करणों के कारण छपाई में नमूना वाष्पीकरण और विसंगतियों, में हो सकता है.
  3. नाइट्रोजन की एक धारा के तहत मुद्रण से पहले और शुष्क 15 मिनट के लिए DDH 2 हे में पिन Sonicate. एक पाइप Cleane का प्रयोग करेंआर पिन धारक भीतर से अवशिष्ट नमी को हटा दें और ध्यान से प्रिंट सिर में पिन के लिए जगह. अवशिष्ट नमी को दूर करने में विफलता चूक स्थानों में जिसके परिणामस्वरूप, धारक के साथ स्वतंत्र रूप से बढ़ने से पिन बाधा हो सकती है.
  4. नियंत्रण सरणी चिप लेखक प्रो (CWP) कार्यक्रम के माध्यम से पैटर्न. अच्छी तरह से 384 अच्छी तरह से स्रोत प्लेट के भीतर प्रत्येक नमूने लिए, 200 धब्बे (SMP3 म्यान पिन का उपयोग तेज प्रति स्पॉट की अधिकतम संख्या) एक सतह संशोधित गिलास स्लाइड पर मुद्रित कर रहे हैं.
  5. सॉफ्टवेयर के माध्यम से छपाई की प्रक्रिया शुरू. 10 मिमी / s और नमूना दृष्टिकोण गति (जेड दिशा) से 2 मिमी / 2.5 सेकंड नमूना लोड समय के साथ एस के लिए XY दिशा में यात्रा निर्धारित करें.
  6. CWP के माध्यम से रन रोकें. नमूने में पिन के निचले हिस्से और पिपेट द्वारा अच्छी तरह से करने के लिए संबंधित प (डीजीएस, साढ़े महानिदेशकों, एस एस, साढ़े एस एस) के 25 μl जोड़ें. 50x दोहराया एक ऊपर और नीचे pipetting गति का उपयोग कर समाधान मिश्रण. Pipetting द्वारा मिश्रण करते हैं, समाधान में शामिल हवा की मात्रा को कम. एयर बुलबुले prevenटी पिन भीतर नमूना की लोडिंग को पूरा करें.
  7. CWP के माध्यम से मुद्रण प्रक्रिया शुरू, और एक स्लाइड सतह पर नमूना मुद्रित. अच्छी तरह से बाद के स्रोत थाली से नमूना लोड करने से पहले मुद्रण प्रक्रिया रोक दें.
  8. एक चुंबक का उपयोग कर मुद्रण पिन निकालें और प्रिंट सिर में नमी buildup को रोकने के लिए प्रिंट सिर में एक पाइप क्लीनर जगह है.
  9. DDH 2 हे के साथ मुद्रण पिन कुल्ला, और 30 सेकंड के लिए स्वच्छ DDH 2 हे में sonicate.
  10. नाइट्रोजन की एक धारा के तहत मुद्रण पिन सूखी और प्रिंट सिर में वापस पिन रखकर, पाइप क्लीनर को हटा दें.
  11. स्रोत प्लेट के भीतर शेष सभी नमूनों के लिए, 5.10 - कदम 5.6 का पालन करके छपाई शुरू. ऊपर 100 माइक्रोन व्यास के 12,000 स्थानों के लिए एक एकल स्लाइड पर जमा किया जा सकता है.
  12. इस विधि को भी एक 96 अच्छी तरह से microplate भीतर कुएं के तल पर मुद्रण सामग्री के लिए लागू किया जा सकता है. CWP अंशांकन फ़ाइल के बाद, distan सुनिश्चित करने के लिए मुद्रण पिन recalibrateCE है microwell प्लेट की ऊंचाई से ऊपर स्थान बयान के बीच यात्रा की. यह पिन पिन को नुकसान पहुँचाए बिना एक रैखिक फैशन में अच्छी तरह से करने के लिए अच्छी तरह से लगातार मुद्रित करने की अनुमति देता है.
  13. पूरे मुद्रण प्रयोग के पूरा होने के बाद 80-90% नमी से कम 30 मिनट और मुद्रण कक्ष के भीतर अप करने के लिए 24 घंटे की एक न्यूनतम के लिए आयु सरणी.

6. एसिटाइलकोलिनेस्टरेज़ गतिविधि परख

  1. सकारात्मक नियंत्रण (पीसी) के नमूने की तैयारी
    1. 1 मिमी acetylthiocholine आयोडाइड तैयार (atch: एम आर 289.18 छ / mol) 4% ग्लिसरॉल, एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 25 मिमी Tris (7.0 पीएच) में. प्रत्येक का उपयोग करने से पहले नए सिरे से तैयार किया है और उच्च पीएच बफ़र्स झूठी सकारात्मक उत्पादन, तेजी autohydrolysis कारण के रूप में पीएच 7.0 से कम एक बफर का उपयोग करने की आवश्यकता है atch. अंतिम मात्रा नमूने (नमूना प्रति 25 μl) की संख्या के आधार पर अलग किया जा सकता है.
    2. 1 मिमी की 25 μl के लिए 5 मिमी से 0.14 μl BODIPY-लचीला एल cystine मे 384 से microtiter पीएलए के कुएं में atchते.
    3. समाधान में बुलबुला गठन से बचने के लिए सावधानी से pipetting द्वारा मिश्रण, 24.86 μl 4% ग्लिसरॉल, 25 मिमी Tris (7.0 पीएच) जोड़ें. संभावित एंजाइम inhibitors बफर के 50 μl के लिए मात्रा में लाने से पहले पीसी समाधान में शामिल किया जा सकता है.
  2. नकारात्मक नियंत्रण (नेकां) के नमूने की तैयारी
    1. 4% ग्लिसरॉल, एक 384 microtiter प्लेट के कुएं में 25 मिमी Tris (पीएच 6.5) की 49.86 μl के लिए 5 मिमी से 0.14 μl BODIPY-लचीला एल cystine जोड़ें. Pipetting द्वारा मिक्स.
  3. पीसी और नेकां समाधान अधिमुद्रण
    1. 5.10 (कदम 5.6 अनदेखी) प्रोटोकॉल का - कदम 5.1 निम्नलिखित वृद्ध प्रोटीन Overprint. पीसी और नेकां overprinting समाधान जमा करने के लिए 235 माइक्रोन व्यास की slotted म्यान पिंस का प्रयोग करें. यह समाधान पूरी तरह से पहले से जमा जगह शामिल किया गया है यह सुनिश्चित करता है.
    2. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 80-90% नमी में आयु सरणियों. Atch की autohydrolysis के कारण, अब ऊष्मायन बार झूठी सकारात्मक परिणाम में या एन वृद्धि हुई है हो सकता हैगतिविधि Zyme.

7. Kinase गतिविधि परख

  1. -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत शेयर एटीपी (100 मिमी) का उपयोग एडेनोसाइन 5'-triphosphate (एटीपी) समाधान 500 माइक्रोन तैयार एक प्रयोग के लिए ताजा समाधान करें और प्रयोगात्मक जरूरत के लिए मात्रा समायोजित: प्रत्येक मुद्रण समाधान 5 μl की आवश्यकता है.
  2. DDH 2 ओ में शेयर समाधान: एक 100 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड (एम आर 95.21 छ / mol 2 MgCl) तैयार करें
  3. सकारात्मक नियंत्रण (पीसी)
    1. 100 मिमी 2 MgCl और एक 384 microtiter प्लेट की अच्छी तरह से करने के लिए एटीपी 5 μl 500 माइक्रोन के 2.5 μl जोड़ें.
    2. Pipetting द्वारा मिश्रण, 50 मिमी HEPES (7.4 पीएच) के साथ 50 μl के लिए कुल अच्छी तरह से मात्रा लाओ. संभावित एंजाइम inhibitors बफर के 50 μl के लिए मात्रा में लाने से पहले पीसी समाधान में शामिल किया जा सकता है.
  4. नकारात्मक नियंत्रण (नेकां)
    1. एक 384 मीटर की अच्छी तरह से करने के लिए 100 मिमी 2 MgCl और 5 μl DDH 2 हे के 2.5 μl जोड़ेंicrotiter थाली.
    2. 50 मिमी HEPES (7.4 पीएच) और pipetting द्वारा मिश्रण के साथ 50 μl के लिए कुल अच्छी तरह से मात्रा लाओ.
  5. अधिमुद्रण पीसी और नेकां परख सहकारकों
    1. प्रोटोकॉल के 6.3.1 कदम का पालन करें.
    2. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 80-90% नमी में आयु सरणियों.
  6. स्लाइड धुंधला
    1. प्लेस मुद्रित माइक्रोएरे पूरे स्लाइड कवर करने के लिए पर्याप्त डाई (किट) के साथ एक पेट्री डिश में व्यक्तिगत रूप से स्लाइड. एक थाली प्रकार के बरतन का उपयोग करते हुए 45 मिनट के लिए मध्यम (~ 200 आरपीएम) हिलाएँ.
    2. धोने बफर के साथ एक साफ पेट्री डिश (किट) में संदंश और जगह का उपयोग कर स्लाइड निकालें. एक थाली प्रकार के बरतन का उपयोग करते हुए 45 मिनट के लिए मध्यम (~ 200 आरपीएम) हिलाएँ.
    3. संदंश का उपयोग स्लाइड निकालें और एक स्लाइड धारक से लैस एक परंपरागत डेस्कटॉप माइक्रोएरे microcentrifuge का उपयोग कर शुष्क स्पिन.

8. माइक्रोएरे इमेजिंग और विश्लेषण

  1. इमेजिंग

    इमेजिंग विधि का हो जाएगा कि नोटउपलब्ध सरणी पाठक के प्रकार के pecific. इन अध्ययनों के लिए, एक सफेद प्रकाश स्रोत और सीसीडी का पता लगाने प्रणाली के साथ एक अल्फा Innotech NovaRay इमेजर एक 478 ± 17 एनएम उत्तेजना और 538 ± में दर्द प्रोटीन, और 530 के लिए 21 एनएम उत्सर्जन फिल्टर ± 40 एनएम उत्तेजना और 614 ± 62 एनएम उत्सर्जन से लैस काइनेज डीएनए इस्तेमाल किया गया था के लिए फिल्टर. लेजर confocal स्कैनिंग सिस्टम भी सेटिंग साधन के लिए विशिष्ट हो जाएगा, हालांकि सरणियों पढ़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

    1. ऊपर का सामना करना पड़ धब्बों के साथ स्लाइड धारक में स्लाइड रखें.
    2. इमेजिंग सॉफ्टवेयर के भीतर पूर्वावलोकन वर्गों की संख्या (2 की एक न्यूनतम सिफारिश की है, माइक्रोस्कोप स्लाइड के दोनों छोर पर एक), संकल्प (4 माइक्रोन की एक न्यूनतम सिफारिश की है) और प्रदर्शन (ऑटो की सिफारिश की है) निर्धारित करें.
    3. स्लाइड छवि के अधिग्रहण और एक ". झगड़ा" फ़ाइल के रूप में बचाने के लिए.
  2. विश्लेषण
    1. ImageJ64 में अधिग्रहीत स्लाइड छवि खोलें.
    2. अंडाकार चयन उपकरण क्लिक करें और उपायविश्लेषण टैब के तहत उपाय के विकल्प का उपयोग हर जगह की तीव्रता का संकेत. मापने के लिए क्षेत्र का चयन, मनाया मौके से और ImageJ आत्मीयता कम करने के लिए स्पॉट के बीच अनुरूप आकार के थोड़ा बड़ा एक क्षेत्र का चयन करें.
    3. व्यक्तिगत सामग्री रचनाओं के लिए पीसी / नेकां अनुपात प्राप्त करने के लिए 25 समान नेकां धब्बे की औसत तीव्रता से विभाजित 25 समान पीसी स्पॉट, से औसत तीव्रता.

Representative Results

सामग्री स्क्रीन के लिए एक निर्देशित कारक विश्लेषण करके, हम ~ 20,000 से मुद्रण के लिए उपयुक्त जमाना बार किया था कि कुछ सौ करने के लिए परीक्षण सामग्री की संख्या को कम करने में सक्षम थे. की एक सख्त दिशानिर्देश की आवश्यकता सामग्री जमाना समय लागू करके 2.5 घंटा या अधिक से अधिक, मुद्रण पिंस रोकना या irreproducible सरणियों उत्पादन होने की संभावना सामग्री मुद्रित नहीं थे. पर्याप्त (> 2.5 घंटे) जमाना बार प्राप्त करने के लिए पहचान करने योग्य सामग्री 4 अलग functionalized गिलास स्लाइड सतहों पर मुद्रित किया गया. आदेश "प्रिंट करने योग्य" पर विचार किया जाएगा में, पिन तेज की मात्रा प्रति स्पॉट की अधिकतम संख्या (SMP3 = 200) मुद्रित किया जा सकता था. स्पॉट भी नहीं टूटेंगे या अवांछनीय चरण जुदाई चित्रा 2 में दिखाया गया के रूप में सरल brightfield माइक्रोस्कोपी का उपयोग हुआ था सुनिश्चित करने के लिए हाजिर आकारिकी लिए मूल्यांकन किया गया.

पहचान करने योग्य सामग्री के इस स्तर से, प्रोटीन दर्द के साथ उत्पादन किया है और कर रहे थेkinases बफर जलीय घटक में शामिल किया. परख प्रक्रिया (संभावित overprinting सहित और कदम धोने या धुंधला) के साथ संगत कर रहे थे कि माल (नेकां नकारात्मक नियंत्रण के लिए माइक्रोएरे धब्बे की अवधारण (नहीं टूटेंगे, धब्बे या असामान्य प्रतिदीप्ति पैटर्न के नुकसान) और एक सकारात्मक नियंत्रण (पीसी) को देख कर पहचान की गई ) छवि के माध्यम से मनाया के रूप में 1 से अनुपात ज्यादा है. इस सामग्री का लगभग 50%, प्रोटीन गतिविधि की अवधारण के साथ इष्टतम सामग्री को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था 3 का अधिक से अधिक पीसी / नेकां अनुपात के रूप में था. इस विधि के माध्यम से,> 3 पीसी / नेकां मापदंड संतुष्ट kinases युक्त दर्द और 2 सामग्री युक्त 26 प जेल व्युत्पन्न सामग्री. चित्रा 3 और 4 चित्र इष्टतम दर्द और काइनेज की पहचान के लिए 5 निर्देशित सामग्री स्क्रीन कदम की एक ग्राफिकल टूटने दिखाने प्रोटीन, क्रमशः.

assays के भी एक जेड 'स्कोर की पीढ़ी के माध्यम से मान्य किया जा सकता है. 17 चित्रा 5 जेड 'साजिश 200 धब्बे, 100 और पीसी में दर्द सरणी पर सूचक डाई और सब्सट्रेट अधिमुद्रण के बाद 100 नेकां से उत्पन्न संकेत तुलना करके प्राप्त से पता चलता है. दर्द और काइनेज सरणियों एक उत्कृष्ट परख का संकेत 0.60 और 0.67 के संबंधित जेड 'स्कोर, में हुई. हालांकि, यह परख सत्यापन से पहले, पर सरणी एंजाइम, डाई, सब्सट्रेट और cofactor के सांद्रता कहीं और विस्तार में वर्णित के रूप में, प्रत्येक घटक की सांद्रता का एक सीमा अधिमुद्रण और उच्चतम संकेत है कि उत्पादन एकाग्रता का चयन करके अनुकूलित किया जा सकता था कि ध्यान दिया जाना चाहिए 5.

Assays के मान्य करने के लिए, मात्रात्मक निषेध डेटा डुप्लिकेट में प्रदर्शन किया और डुप्लिकेट भूखंडों (चित्रा 6A) और निषेध घटता (आंकड़े 6B और 6C) का उत्पादन किया जाता परिणामों के साथ, ज्ञात और अज्ञात में दर्द inhibitors का उपयोग कर प्राप्त किया गया. <मजबूत> स्पॉट पहले डाई और सब्सट्रेट के साथ तो ज्ञात जैविक रूप से सक्रिय छोटे अणु inhibitors के मिश्रण के साथ overprinted थे, और जाना जाता inhibitors या कोई अवरोध या तो युक्त नियंत्रण मिश्रण शामिल थे. डुप्लिकेट भूखंडों एंजाइम गतिविधि का आकलन करने के लिए उत्पन्न किया गया है, और कम से कम 25% एंजाइम गतिविधि में हुई कि किसी भी मिश्रण निषेध के लिए सकारात्मक विचार किया गया. इस तरह के मिश्रण से व्यक्तिगत यौगिकों तो निषेध के लिए जिम्मेदार विशिष्ट छोटे अणु (ओं) की पहचान करने के लिए दो प्रतियों में परीक्षण किया गया. एक बार की पहचान की इन छोटे अणुओं आईसी 50 मूल्यों और निषेध स्थिरांक निर्धारित करने के लिए मात्रात्मक निषेध घटता उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया.

इसी तरह के गुणात्मक परिणाम एक आम kinase अवरोध, staurosporine साथ multikinase सरणी का उपयोग कर प्राप्त किया गया. चित्रा 7A और 7B माइक्रोएरे छवि दिखाने के लिए और संकेत मिलता है कि अधिमुद्रण और multikinase धुंधला के बाद संकेत तीव्रता(- एटीपी), सकारात्मक नियंत्रण (+ एटीपी) और ज्ञात अवरोध (+ एटीपी + INH) सरणी के रूप में एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए उम्मीद कर रहे हैं. प्रोटीन से मात्रात्मक निषेध डेटा प्राप्त करने की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, एक एकाग्रता निर्भर निषेध परख एक भी kinase के लिए किया गया था. आंकड़े 8A और 8B में दिखाया गया है, संकेत तीव्रता अवरोध एकाग्रता बढ़ जाती है के रूप में कम हो जाती है, और प्रतिक्रिया p38α/MBP काइनेज / सब्सट्रेट प्रणाली के लिए उम्मीद की एकाग्रता निर्भर निषेध वक्र निम्नानुसार है.

चित्रा 1
चित्रा 1. निर्देशित सामग्री स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के लिए जनरल योजनाबद्ध. प्रत्येक ब्लॉक अनुक्रमिक क्रम में स्क्रीन के एक कदम का प्रतिनिधित्व करता है. बाईं तरफ संख्या के विश्लेषण के लिए तैयार माल की कुल संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं. अधिक से अधिक से अधिक 2.5 घंटे (जमाना समय के साथ सामग्री कम से कम 2.5 घंटे की गिरफ्तारी एक जमाना समय का उपयोगई) लिखकरकाटें ने संकेत दिया है, प्रत्येक चरण बीत चुके हैं और सामग्री स्क्रीन के दौरान आगे बढ़ाया कि सामग्री की संख्या सही पर संख्या से संकेत कर रहे हैं. * इष्टतम चरण जुदाई से भी कम समय के साथ सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. स्क्रीन की printability कदम पर सामग्री के विभिन्न विफलता मोड दिखा ऑप्टिकल छवियों. एक "अच्छा" सामग्री (दूसरी पंक्ति, तीसरे स्तंभ) की एक छवि भी तुलना के लिए दिखाया गया है. संदर्भ 8, कॉपीराइट 2013 अमेरिकन केमिकल सोसायटी की ओर से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित.

चित्रा 3
चित्रा 3. प जेल व्युत्पन्न में दर्द प्रोटीन fabricating के लिए इष्टतम सामग्री की पहचान के लिए एक निर्देशित सामग्री स्क्रीनिंग दृष्टिकोण. पर्म के साथ पुनर्प्रकाशितसंदर्भ 5, कॉपीराइट 2013 अमेरिकन केमिकल सोसायटी की ओर से ission.

चित्रा 4
4 चित्रा. प जेल व्युत्पन्न काइनेज प्रोटीन fabricating के लिए इष्टतम सामग्री की पहचान के लिए एक निर्देशित सामग्री स्क्रीनिंग दृष्टिकोण. संदर्भ 8, कॉपीराइट 2013 अमेरिकन केमिकल सोसायटी की ओर से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित.

चित्रा 5
चित्रा 5. (ए) एचसी (चमकीले हरे रंग का) और नियंत्रण रेखा (प्रकाश) हरे धब्बे (एक काले हरे रंग पैलेट प्रस्तुति की स्पष्टता के लिए pseudocolor के रूप में लागू किया गया था) दिखाने में दर्द माइक्रोएरे का एक वर्ग, (बी) बॉक्सिंग क्षेत्र के एक बढ़ाया देखने मौके उजागर करने के लिए आकृति विज्ञान और संरेखण;. और (सी) एक जेड 'साजिश ठोस लाइनों के मतलब का संकेत धराशायी लाइनों 3SD के अनुरूप है, जबकि replicates. संदर्भ 5, कॉपीराइट 2013 अमेरिकन केमिकल सोसायटी की ओर से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित.

चित्रा 6
6 चित्रा. (ए) Amaryllidaceae alkaloids की सिंथेटिक analogs के पर सरणी स्क्रीनिंग के लिए साजिश डुप्लिकेट, (बी) की पहचान की संभावित inhibitors के आईसी 50 भूखंडों यौगिकों 1 और 25 से मतलब है की एक मानक विचलन का प्रतिनिधित्व त्रुटि सलाखों के साथ (सी) परिसर 2, के रूप में चिह्नित replicates. प्रतिनिधि स्पॉट अवरोध सांद्रता के लिए आनुपातिक संकेत में मतभेदों को वर्णन करने के लिए दिखाए जाते हैं. संदर्भ 5 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित, कॉपीराइट 2013 अमेरिकन केमिकल सोसायटी. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 7. पर सरणी फंसाने के लिए 1.4SS/1.0PVA का उपयोग कर चार kinases की परख और एक अमाइन-derivatized स्लाइड पर मुद्रित. (ए) kinases उनके संबंधित substrates के साथ सह फँस साथ स्पॉट बफर के साथ overprinted गया जिसमें माइक्रोएरे के एक वर्ग की एक छवि (नेकां, शीर्ष पंक्ति), या एटीपी (पीसी, मध्य पंक्ति) या एटीपी + staurosporine (नीचे पंक्ति) युक्त समाधान. (बी) के बीच संकेत तीव्रता की तुलना बार रेखांकन हिचकते हैं और 25 से मतलब है की एक मानक विचलन का प्रतिनिधित्व पृष्ठभूमि संकेत और त्रुटि सलाखों के घटाव के बाद बेहिचक प्रतिक्रियाओं, replicates. संदर्भ 8, कॉपीराइट 2013 अमेरिकन केमिकल सोसायटी की ओर से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित.

8 चित्रा
चित्रा 8. Inhibiti. एक p38a/MBP माइक्रोएरे पर परख पर (ए) staurosporine की सांद्रता के साथ अलग overspotted प्रतिनिधि स्पॉट दिखा प्रोटीन की धारा, के रूप में (; समग्र छवि स्पष्टता के लिए दिखाया गया है छवियों को एक ही स्लाइड का एक भी स्कैन द्वारा प्राप्त किया गया) संकेत दिया. (बी) के आईसी 50 वक्र विश्लेषण सरणी छवियों से उत्पन्न. 100 मिमी पर प्राप्त तीव्रता सभी छवियों से घटाया गया था, अन्य सभी तीव्रता 100% गतिविधि का एक मूल्य के लिए 10 एनएम पर प्राप्त तीव्रता निर्धारित करके सामान्यीकृत थे. संदर्भ 8, कॉपीराइट 2013 अमेरिकन केमिकल सोसायटी की ओर से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित.

9 चित्रा
9 चित्रा. संपर्क विभिन्न खामियों दिखा पिन छपाई के लिए इस्तेमाल सूक्ष्म चुपके पिन की छवियाँ: (ए) भरा, (बी) तुला.

Discussion

यहाँ वर्णित पद्धति तेजी से माल की बड़ी संख्या स्क्रीन करने के लिए बिना इष्टतम सामग्री की पहचान करने के लिए एक समय और लागत प्रभावी प्रक्रिया के उत्पादन, संपर्क प्रिंटर से प्रिंट करने योग्य प जेल निकाली गई सामग्री की पहचान करने के लिए सबसे उपयुक्त के रूप में चयनित किया गया था. ~ 20,000 संभावित माल की कुल से, यह अकेले जमाना समय के आधार पर मुद्रण के लिए उपयुक्त थे कि ~ 200 सामग्री की पहचान करने के लिए संभव था. यह काफी बाद मुद्रण परीक्षण के लिए तैयार होने के लिए आवश्यक सामग्री की संख्या कम हो. ये प्रिंट करने योग्य सामग्री तो 768 सामग्री स्लाइड संयोजनों की कुल के लिए 4 स्लाइड सतहों पर मुद्रित किया गया. औसत पर, एक सामग्री के 50 स्पॉट / replicates नमूना लोड, मौके बयान और पिन सफाई सहित ~ 3 मिनट, में मुद्रित किया जा सकता है. उन में से, 155 सामग्री, या लगभग 20%, समाधान तेज प्रति स्पॉट की अधिकतम संख्या मुद्रित करने के लिए अनुमति दी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्थान आकार का उत्पादन किया. यह ध्यान दिया जाना चाहिए 4 SL की किआईडीई सतहों परीक्षण, सामग्री क्रम में बेहतर मुद्रित: अमाइन> epoxy> एल्डिहाइड> PMMA, PMMA स्लाइड किसी भी सामग्री के लिए उपयोगी सरणियों का उत्पादन नहीं किया. यह संभावना सतह कोटिंग के polarity के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था. ऊपर उल्लिखित स्लाइड सतहों के मुकाबले अधिक ध्रुवीय अमाइन और epoxy बेहतर PMMA स्लाइड्स की तुलना में जलीय SOLS के लिए उपयुक्त थे. इसके अलावा, परीक्षण सतहों, अमाइन लेपित स्लाइड बंधन को ऋणात्मक प जमा के लिए एक संभावित सकारात्मक आरोप लगाया सतह प्रदान करते हैं. हमें संदेह है, सिलिका स्लाइड और प सतह के साथ बातचीत के बीच इंटरफेस में नैनोकणों. Epoxy और एल्डिहाइड स्लाइड सतहों दोनों ही प्रारंभिक शुल्क के आधार पर बातचीत की कमी है. इष्टतम स्थान बयान सुनिश्चित करने के लिए यह अत्यधिक ऐसे Arrayit के रूप में एक सप्लायर से पूर्व लेपित स्लाइड्स का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. घर में कोटिंग गरीब हाजिर reproducibility के 13 और नेतृत्व करने के लिए कि असंगत सतहों पैदा करता है, कुछ मामलों में, मात्रा का ठहराव समस्या पैदा हो सकती हैlems. समान महत्व की 18, तापमान और नमी सामग्री के "printability" प्रभावित करते हैं. तापमान से संबंधित प्रभाव के बारे में कोई विस्तृत अध्ययन किए थे, छपाई हमेशा कमरे के तापमान पर बाहर किया (23 ± 3 डिग्री सेल्सियस). था आर्द्रता (80% से अधिक) भी छोटा सा बयान मात्रा (0.7-2.3 nl) और वाष्पीकरण के कारण अनियमित आकार के जमाव को रोकने के लिए प्रिंट कक्ष के भीतर नियंत्रित किया गया था.

सामग्री स्क्रीन में दर्द और kinases है, प्रोटीन के दोनों प्रकार के लिए काम किया है कि सामग्री का एक छोटा सा सेट की पहचान की गई के मुद्रण के लिए विशेष रूप से इष्टतम प जेल निकाली गई सामग्री की पहचान करने की दिशा में निर्देशित किया गया है. दरअसल, काइनेज माइक्रोएरे निर्माण के लिए पहचान की गई है कि सामग्री के दोनों एसएस + PVA + ग्लिसरॉल पर आधारित थे, और दोनों सामग्री भी में दर्द प्रोटीन के लिए चयनित 26 माल में पहचाना गया. ये "इष्टतम" सामग्री आगे prote के विकास के लिए एक सामान्य प्रारंभिक बिंदु प्रदान कर सकता हैइन रचनाओं के आसपास केंद्रित में डाल दिया गया प जेल आधारित प्रोटीन, और छोटे परदे माइक्रोएरे निर्माण के लिए भी बेहतर सामग्री की पहचान कर सकते हैं. नोट करने के लिए एक दूसरा मुद्दा इस्तेमाल किया एंजाइम का महत्व है. में दर्द (एक नहीं बल्कि मजबूत एंजाइम) के मामले में, परख संगत के रूप में पहचान की मूल 66 सामग्री के 26 (या लगभग 40%) फँस में दर्द की गतिविधि को बनाए रखा. हालाँकि, और अधिक नाजुक kinases के लिए, 69 परख संगत रचनाओं, या सामग्री का लगभग 3%, की केवल 2 सभी kinases की गतिविधि को बनाए रखने में सक्षम थे. विभिन्न एंजाइमों की पर्याप्त संख्या निर्णायक बयान करने के लिए अध्ययन नहीं किया गया है, यह अपेक्षाकृत अस्थिर एंजाइमों के साथ कि अनुकूलन सरणी निर्माण mutliplexed माइक्रोएरे निर्माण की अनुमति के लिए प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला फंसाने कर सकते हैं कि सामग्री की पहचान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं प्रकट होता है.

चुना प्रोटीन की स्वतंत्र, प्रिंट करने योग्य सामग्री की पहचान करने के लिए प्रमुख कट ऑफ कारक एक लंबे समय के लिए की जरूरत थीसामग्री जमाना बार (> 2.5 घंटे). एसएस आधारित प जेल सामग्री के विकास है, यह आयन एक्सचेंज और छानने के बाद प पीएच 4 के बारे में है, यह सुनिश्चित करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. एक कम प्रारंभिक पीएच साथ SOLS एंजाइम की गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं. 19 समायोजन एसएस को Dowex (आयन एक्सचेंज राल) की राशि प के अंतिम पीएच बदल सकते हैं एक कम से भी तटस्थ पीएच, के साथ सामग्री में हो सकता है. राल का एक नया बैच तैयार किया जाता है जब एसएस को राल का अनुपात प्रोटोकॉल की धारा 2 में प्रक्रिया का पालन के बारे में पीएच 4 बजे SOLS निर्माण करने के लिए इतनी के रूप में समायोजित करने की आवश्यकता है.

इसी प्रकार, स्फटिक महानिदेशकों की तैयारी अक्सर बायोमोलिक्यूल फंसाने के लिए डीजीएस आधारित SOLS का उपयोग करते समय सामग्री की विफलता के साथ जुड़े त्रुटि का एक स्रोत है. विस्तार में यहाँ की सूचना नहीं है, महान देखभाल polyglycerated सिलिका उत्पादन कर सकते हैं, जो विशेष रूप से क्रिस्टलीय महानिदेशकों के संश्लेषण, संश्लेषण के दौरान पानी की उपस्थिति से बचने के लिए की जरूरत है, के दौरान उठाए जाने की जरूरत हैबल्कि मोनोमेरिक महानिदेशकों से tes है. इसके अलावा, जी एस की हीड्रोस्कोपिक प्रकृति के कारण, स्फटिक नमूना सूखा और संश्लेषण के बाद 6 महीने के भीतर इस्तेमाल किया संग्रहीत करने की आवश्यकता है. 6 महीने से अधिक पुराने क्रिस्टलीय महानिदेशकों भी एक अम्लीय वातावरण में sonication के साथ (कारण आंशिक रूप से संघनित polyglyceryl सिलिकेट सामग्री के लिए) पूरी तरह से भंग नहीं हो सकता है. अधूरा महानिदेशकों विघटन अज्ञात और बेकाबू सिलिका सामग्री और इस प्रकार, कम मजबूत सामग्री के साथ SOLS पैदा करता है.

संपर्क मुद्रण के साथ नोट करने के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा पिनों की गुणवत्ता है. खराब अथवा mishandled पिंस (चित्रा 9) मुद्रित की जा रही सामग्री की स्वतंत्र प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सरणियों उत्पादन कभी नहीं होगा. यह टूट गया है या भरा पिंस इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग पिन गुणवत्ता की जांच की सिफारिश की है. सावधान से निपटने पिन के लिए लंबे जीवन को सुनिश्चित करता है. पिन की मुक्त आवाजाही भी महत्वपूर्ण है. नमी सिर और पिन के बीच प्रिंट सिर, पिन में फंस गया है जहां मामलों मेंसही ढंग से सीट है और इस तरह की सामग्री के बयान की कमी है, जिसके परिणामस्वरूप सतह के साथ उचित संपर्क नहीं कर देगा नहीं होगा.

अंत में, हम उच्च घनत्व प्रोटीन डाल दिया गया पिन मुद्रित प्रोटीन के विकास के लिए एक विस्तृत, multistep स्क्रीनिंग दृष्टिकोण प्रदान की है. स्क्रीनिंग और अधिक ध्यान केंद्रित स्क्रीनिंग द्वारा पीछा सामग्री के मुद्रण, एक दिया परख के साथ संगत और एंजाइम गतिविधि को बनाए रखने में सक्षम हैं कि सामग्री की पहचान करने के लिए अनुमति देने के लिए गुण सामग्री के अनुकूलन (जमाना समय और printability) शामिल है. यह निर्देशित सामग्री स्क्रीनिंग दृष्टिकोण समय और कुशल उच्च घनत्व प्रोटीन के उत्पादन के साथ जुड़े लागत को कम करने के लिए अतिरिक्त माइक्रोएरे प्रारूपों के लिए लागू किया जा सकता है.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकों प्रोटीन के विकास में सहायता के लिए मारिया Monton, जूली Lebert, Jessamyn लिटिल, जिन जीई और लौरा Lautens धन्यवाद. लेखकों को भी इस काम के वित्त पोषण के लिए प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल () NSERC धन्यवाद. लेखकों को भी इस काम के समर्थन के लिए अभिनव और ओंटारियो अभिनव ट्रस्ट के लिए कनाडा फाउंडेशन धन्यवाद. JDB Bioanalytical कैमिस्ट्री और Biointerfaces में कनाडा अनुसंधान चेयर रखती है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagent/Material
Poly(vinyl alcohol) (PVA) Sigma-Alderich 360627 80% hydrolozyed, Mw 600
Polyethylene glycol 600 (PEG) Sigma-Alderich 87333  
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Alderich 482595 50 wt% solution in water
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH) Gelest, Inc. SIC2263.0 25% in water
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS) Gelest, Inc. SIT8189.0 50% in ethanol
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO) Gelest, Inc. SIB1660.0  
Methyltrimethoxysilane (MTMS) Gelest, Inc. SIM6560.1  
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS) Gelest, Inc. SIB1817.0  
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) Gelest, Inc. SIA0610.0  
Glycerol Sigma-Alderich 49767  
D-Sorbitol Sigma-Alderich 240850  
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma-Alderich T9531  
Triton X-100 Sigma-Alderich X-100  
Nε-Acetyl-L-lysine Sigma-Alderich A4021  
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Alderich 154563  
HEPES Sigma-Alderich H3375  
Sodium hydroxide, 1.0 N LabChem Inc. LC24350-2  
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N LabChem Inc. LC15300-2/LC152220-2  
Magnesium chloride Sigma-Alderich M8266  
Diglycerolsilane (DGS) Prepared in laboratory
Sodium silicate solution Fisher Scientific SS338-1  
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin Sigma-Alderich 217492  
Acetylthiocholine iodide Sigma-Alderich 1480  
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel) Sigma-Alderich C2888  
BODIPY FL L-Cystine Invitrogen B-20340  
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit Invitrogen P33706  
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution Sigma-Alderich A6559  
MAP Kinase 2 (MAPK2) EMD Millipore 454850  
p38α/SAPK2a (T106M), active EMD Millipore 14-687M  
Epidermal growth factor (EGFR) EMD Millipore Donated by Millipore
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) EMD Millipore 14-306  
Myelin basic protein (MBP) EMD Millipore Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore
GSM EMD Millipore 12-533 Substrate for GSK-3β
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y) EMD Millipore 12-440 Substrate for EGFR
Stealth pin ArrayIt SMP3  
Stealth pin ArrayIt SMP7  
Amine coated slides ArrayIt SMM2  
Aldehyde coated slides ArrayIt SMA2  
Exposy coated slides ArrayIt SME2  
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides Exakt Technologies Inc. 41500  
0.2-μm syringe filter PALL Life Sciences 4612  
  Equipment
Virtek Contact Printer BioRad  
Novaray Fluorescence Slide Imager Alpha Innotech Corporation  
Desktop microarray centrifuge ArrayIt MHC110V  
MilliQ Synthesis A10 Millipore Used to filter all water required for experiments

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References

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मात्रात्मक सोल जेल व्युत्पन्न प्रोटीन के विकास के लिए एक गाइडेड सामग्री स्क्रीनिंग दृष्टिकोण
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Helka, B. J., Brennan, J. D. A… More

Helka, B. J., Brennan, J. D. A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays. J. Vis. Exp. (78), e50689, doi:10.3791/50689 (2013).

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