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Biology

Gavage adultos de pez cebra

doi: 10.3791/50691 Published: August 11, 2013

Summary

El creciente uso de pez cebra como modelo animal requiere el desarrollo de métodos eficaces para la entrega de cantidades conocidas de compuestos y soluciones. El procedimiento de alimentación forzada se describe a continuación permite la administración oral de volúmenes precisos de la solución de forma fiable, segura y eficiente para adultos de pez cebra.

Abstract

El pez cebra se ha convertido en un importante modelo in vivo en la investigación biomédica. Métodos eficaces deben desarrollarse y utilizarse para suministrar compuestos o agentes en soluciones para la investigación científica. Los métodos actuales para la administración de compuestos por vía oral a adultos de pez cebra son inexactos debido a la variabilidad en el consumo voluntario por los peces. Un procedimiento de alimentación forzada fue desarrollado para suministrar cantidades precisas de agentes infecciosos al pez cebra para el estudio en la investigación biomédica. Pez cebra adulto de más de 6 meses de edad fueron anestesiados con 150 mg / l de buffer MS-222 y alimentadas por sonda con 5 l de solución mediante tubos flexibles implantación del catéter conectado a una corte 22G punta de la aguja. El tubo flexible se redujo en la cavidad oral del pez cebra hasta que la punta de la tubería de extenderse más allá de las branquias (aproximadamente 1 cm). A continuación, la solución se inyecta lentamente en el tracto intestinal. Este método fue eficaz 88% del tiempo, con la recuperación de los peces sin incidentes. Esteprocedimiento también es eficaz como una persona puede alimentación por sonda 20-30 peces en una hora. Este método se puede utilizar para administrar con precisión agentes para estudios de enfermedades infecciosas, o estudios de otros compuestos en adultos de pez cebra.

Introduction

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Los métodos actuales para la administración por vía oral de compuestos pez cebra incluyen compuestos administración superior con recubrimiento en piensos, mezclados en las dietas de gelatina, 1 bioencapsulado en salmuera camarones 2, mezclados con lípidos en dietas encapsuladas 3, cera perlas rociado 4 ya través de las dietas a base de gluten. 5 Limitaciones de estos métodos de administración oral incluyen altas tasas de lixiviación y el consumo incompleto o impredecible compuesto por cada ejemplar. Estas variables son problemáticos debido a que en estudios de enfermedades infecciosas, sabiendo que la dosis infecciosa administrados a los peces puede ser crítico para el éxito del estudio. Además, el trabajo previo ha demostrado que ciertos compuestos administrados en baños de agua causan lesión tóxica al pez cebra branquias antes de que los efectos intestinales que pueden ser objeto de estudio se producen. 6

Alimentación forzada es un método estándar utilizado en otras especies de animales de laboratorio para administrar cantidades precisas de un producto con akconcentración nown de estudio en la investigación biomédica y farmacéutica. Sólo recientemente los métodos para gavage pez cebra ha descrito en la literatura. Una técnica se describe un método de dos persona que utiliza una vaina de catéter 24-G unida a una pipeta de 2-20 para entregar 5 l de solución. 7 El método descrito tenía una tasa de mortalidad del 8,7% y 39% en la primera y segunda ensayo, respectivamente, la mayor parte de la mortalidad se atribuyó a las hembras grávidas. La segunda técnica de alimentación forzada describe jeringas por sonda de punta roma se utilizan para administrar 5 l de solución a medakas (latipes latipes). 8 La información sobre la mortalidad no fue proporcionada y el proceso exacto de la realización de la sonda no se describió. De acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales y el pez cebra de laboratorio, hasta el 1% del peso corporal de los peces puede ser administrado a través de una sonda. 9,10 Nuestro objetivo fue desarrollar un método reproducible, segura y eficaz de entregar los volúmenes precisos de comlibra por vía oral a adultos de pez cebra de ambos sexos y en todas las etapas de la reproducción. Este procedimiento sería aplicable para cualquier estudio en el que se requiere la administración oral precisa de un compuesto.

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Protocol

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1. Preparación de la solución anestésica

  1. Preparar una solución de 150 mg / L de MS-222 en agua sistema, ya sea a partir de una solución madre o de la forma en polvo.
  2. Verificar el pH con un medidor de pH.
  3. Tampón con bicarbonato de sodio, según sea necesario hasta que el pH es de entre 7-7,5.
  4. Prepare un tanque de agua del sistema libre de MS-222 para los peces para recuperar pulg El tiempo de recuperación es generalmente menos de 1 min.

2. Preparación del Aparato de alimentación forzada

  1. Cortar el tubo de implantación clara 22-G a un poco más que la longitud aproximada de la boca a la bombilla intestinal de los peces. Al principio, le sugerimos anestesiar un pez para cada nuevo grupo que se utiliza para obtener la mejor estimación de la longitud necesaria.
  2. Empuje el tubo de corte implantación clara sobre la aguja 22-G ½ pulgadas hasta que es seguro y no hay riesgo de desprendimiento. Si una aguja ½ 22-C no está disponible, cortar una aguja más larga a la aplicaciónroximately que la longitud.
  3. Cuando se completa, el tubo de implantación del catéter se debe extender sobre 1 cm de la punta de la aguja, o más cortas si los peces son más pequeños.
  4. Coloque la base de la aguja 22-G a un luerlok jeringa de 1 cc.

3. Preparación para Gavage

  1. Corte una ranura en una esponja con una hoja de bisturí.
  2. Sumerja la esponja en agua sistema libre de MS-222.
  3. Colocar la esponja humedecida en una superficie plana.
  4. Elaboración de la solución al 5 l adecuado para una sonda en el tubo del catéter 22-G y una jeringa de 1 cc.

4. Anestesia y Gavage

  1. Rápido el pescado durante al menos 24 horas antes del procedimiento.
  2. Coloque el pescado en la solución de MS-222 hasta que pierde su reflejo de enderezamiento, y no responde a una aleta de pinzamiento del rabo, pero mantiene el movimiento opercular. Esto suele tardar unos 2-3 min.
  3. Retire el pescado de la solución anestésica y colóquelo enla ranura en la esponja con la cabeza ligeramente sobresale de la esponja, pero las branquias cubiertas por la esponja.
  4. Mover la esponja en una posición vertical.
  5. Abra la boca del pez cebra mediante el tubo de catéter 22-G.
  6. Introduzca suavemente el tubo hasta que la punta está más allá de las branquias (aproximadamente 1 cm o la longitud de la tubería). El tubo de implantación no debería necesitar ser forzado. Resistencia sugiere el tubo puede estar golpeando el arco branquial o del corazón.
  7. Si hay resistencia, retirar con cuidado, vuelva a colocar y vuelva a intentarlo.
  8. Inyectar el material lentamente.
  9. Si bien la inyección, asegúrese de que la solución no sale a través de las branquias o la boca.
  10. Retire el pescado de la esponja y el lugar en el depósito de recuperación.
  11. La recuperación se produce normalmente en menos de 1 min y se indica por el pez nadando en posición vertical y mantener el equilibrio.
  12. Supervisar los peces para la regurgitación como se muestra mediante la visualización de los peces expulsa el material de su boca, o ningún movimiento opercular.
  13. El pescado puede ser devuelto a su tanque normal una vez que se han recuperado.

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Representative Results

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Ambos sexos de los peces, incluyendo hembras grávidas fueron alimentadas por sonda con éxito (Figura 1). Un procedimiento exitoso tarda menos de un minuto con el líquido no visto que sale de las branquias o la boca. El tubo entra fácilmente, sin violencia, sin sangre visto después de la retirada del catéter. El procedimiento es rápido, requiere aproximadamente 10 min a la alimentación forzada de 3 a 4 peces, con un promedio de 30-45 seg por pez.

El pez cebra no debe ser alimentadas por sonda con más de 5 l de cualquier solución. Gavage con 10 soluciones l dio lugar a sólo una tasa de éxito del 50% (Figura 2). Gavage de 10 l también era completamente sin éxito en las hembras grávidas. En este estudio, los peces adultos pesaron un promedio de 0,2 g cada una. Uso de la recomendación de la CCAC, esto significaría que 4 l de solución podría ser administrada a cada pez. El uso actual de 5 l estaría en consonancia con estas recomendaciones. Esta técnica tenía aproximadamente un 10% mortality tasa atribuible principalmente a las hembras grávidas que fueron encontrados muertos al día siguiente. Mientras que esta tasa de mortalidad es significativamente menor que otras técnicas reportadas por sonda nasogástrica, idealmente, hembras grávidas groseramente no deben ser alimentadas por sonda a menos que sea necesario para fines de estudio.

Figura 1
Figura 1. Comparativa de éxito por ciento entre los diferentes grupos reproductivos con 5 l de solución. El porcentaje de éxito de todos los grupos combinados fue del 88%. El porcentaje de éxito para las hembras grávidas fue del 100%; para las hembras no grávidas 90% para los varones y 82%.

La figura 2
Figura 2. Comparativa de éxito general ciento utilizando 5 l frente a 10 l. El éxito total de ciento con 5 l fue del 88%. El éxito total de 10 por ciento el uso del fue de 50%.

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Discussion

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Significado

Esta técnica es una mejora y proporciona varias ventajas con respecto a las dos técnicas descritas anteriormente para gavage adultos de pez cebra. En primer lugar, el uso de una esponja para contener los peces permite a una persona para llevar a cabo el procedimiento, en lugar de una técnica descrita anteriormente requiere dos personas. 7 En segundo lugar, la tubería implantación del catéter es más flexible que los catéteres IV, que puede ayudar a minimizar el trauma secundario debido a la perforación de manera similar al uso de jeringas de punta roma. 7,8 En tercer lugar, mediante el uso de un tubo transparente, la solución se puede visualizar fácilmente entrar en el pescado. Y, por último, el aparato de alimentación forzada es estable, lo que le permite ser reutilizada de forma rápida y eficiente cuando necesitan muchos peces para ser alimentadas por sonda. La técnica de alimentación forzada, en general, reduce la variación en el consumo y la concentración visto en otros métodos de administración oral de compuesto a pez cebra, y como tal, también puede reducir la cantidad de pescado necesaria para perform un experimento. 1-5

Pasos críticos

También es importante ayunar a los peces durante al menos 24 horas ya que con un 12 hr rápido no todos pez cebra tiene una bombilla intestinal vacío. El ayuno de 24 horas será evitar la regurgitación y pérdida de la solución a través de la boca y las branquias debido a un tracto intestinal parcialmente lleno 13. El problema más común es salir de líquido a través de la boca o en las branquias, lo que indica que el tubo no se inserta lo suficientemente lejos en el tracto intestinal. El líquido que sale a través de la boca o las branquias se puede evitar mediante la observación de la correcta colocación de la tubería, así como el uso de un tubo de longitud suficiente para pasar por alto las branquias. Las complicaciones más graves pueden incluir trauma Gill, hemorragia interna, perforación intestinal, regurgitación y muerte súbita. Estas complicaciones pueden o pueden no ser observados inmediatamente. Típicamente, la muerte súbita se produce horas después de que se ha completado el procedimiento, mientras que el pescado no parecíarmal durante la recuperación inicial.

Las esponjas se empaparon en lejía y luego en una solución de tiosulfato de sodio antes de entrar en contacto con el pescado. Esto elimina cualquier agente o productos químicos que pueden haber sido perjudicial para los peces. El MS-222 solución madre debe ser almacenado en un contenedor oscuro, lejos de la luz y de un máximo de 5 días en el refrigerador. Si se observa un tinte marrón la solución debe ser desechada, como se reduce la eficacia 11,12.

Limitaciones

Este protocolo requiere anestesia del pez cebra para asegurar el éxito. Esto puede ser desventajoso en ciertas circunstancias en las que el agente anestésico puede tener un efecto adverso sobre los resultados de las investigaciones que se están midiendo. 12 En la actualidad, no existe un protocolo por sonda nasogástrica para pez cebra que no requiere anestesia. 7,8 Si MS-222 anestesia se sabe que afectar a las variables medidas, otros anestésicos pueden ser utilizados, o uno de los previamente mencionados métodos de métodos de consumo voluntarias pueden ser utilizados. 1-5

Esta técnica, al igual que con las técnicas descritas anteriormente es difícil cuando se realiza en las hembras grávidas. 7 Una posible causa de la alta tasa de mortalidad en este grupo puede ser perforación intestinal que conduce a sepsis por el tracto intestinal ser desplazados por los huevos en el celoma. Del mismo modo, si los huevos así como intestino están perforadas, a continuación, puede también producirse un celomitis asociada con los huevos aguda. Tales eventos pueden ser minimizados por desove las hembras grávidas antes de gavage. Alternativamente, un catéter de calibre más pequeño puede ser utilizado para llevar a cabo el procedimiento.

Si se utiliza el pez cebra de un tamaño más pequeño se debe tener cuidado para ajustar el tamaño de la tubería y la aguja de modo que el diámetro y la longitud se ajusta a la boca y el tracto intestinal.

La eficacia del procedimiento se puede aumentar aún más si un segundo individual era para monitorear la anestesia y garantizar un suministro constante de pescado anestesiado a la persona que realiza la sonda. Esta técnica es relativamente fácil de dominar y no requiere de mucha práctica para ganar competencia. Además, el procedimiento no requiere equipos o instalaciones especializados.

Solución de problemas

Si el pez cebra no se conviertan anestesiado dentro de 2-3 min, cambie la solución anestésica o utilizar una solución madre recién preparada. Si el tubo no se deslice fácilmente por el tracto intestinal del pez cebra, se debe utilizar tubería de diámetro más pequeño. Puede ser beneficioso para practicar el uso de un pequeño número de peces de tamaño similar con el fin de garantizar el correcto diámetro y la longitud de la tubería, así como para evaluar si el volumen administrado es apropiada para el tamaño del pez cebra. El tubo también puede estar marcado para señalar la profundidad de penetración ideales para el tamaño de los peces que se utilice.

Una vez que esta técnica se domina, que puede ser utilizado para suministrar una cantidad precisa de varios compuestos o agentes infecciosos para adultos de pez cebra eficiente y consistente, por lo que es útil para diversos protocolos de investigación. Esta técnica también puede minimizar el número de pescado necesario para llevar a cabo experimentos, y permitir mediciones precisas de tiempo de los efectos de diversos compuestos sobre los peces.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

La Universidad Rockefeller Center Bioscience comparativo proporcionó apoyo para este proyecto. Agradecemos Monnas Janelle de asistencia técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
A sponge
1-cc luer lock syringe Becton Dickinson Co
22-G Micro-Renathane Implantation tubing (cut) Braintree Scientific, Inc.
1 22-G needle (cut, if needed) Becton Dickinson Co
pH meter Hanna probe
1 scalpel blade
Name Company Catalog Number Comments
Reagent/Material
MS-222 (Finquel) Argent Laboratories

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Cite this Article

Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (78), e50691, doi:10.3791/50691 (2013).More

Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (78), e50691, doi:10.3791/50691 (2013).

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