Summary

Быстрый Micro-ионтофорезом глутамата и ГАМК: полезный инструмент по расследованию Synaptic интеграции

Published: July 31, 2013
doi:

Summary

В этой статье мы представляем быстрая микро-ионофореза нейромедиаторов как метод для исследования интеграции постсинаптических сигналов с высокой пространственной и временной точности.

Abstract

Одним из фундаментальных интересов в области неврологии, чтобы понять интеграции возбуждающих и тормозящих входов по очень сложной структурой дендритных дерева, которое в итоге приводит к выходу нейронов потенциалы действия в аксона. Влияние различных пространственных и временных параметров конкретного синаптических входных нейронов на выход в настоящее время исследуется, например, расстояние-зависимое затухание дендритных входов, расположение-зависимое взаимодействие пространственно отделены входов, влияние GABAergig ингибирование возбуждающих интеграции, линейный и нелинейный режимы интеграции, и многое другое.

С быстрым микро-электрофорез глутамат и ГАМК можно точно исследовать пространственную и временную интеграции глутаматэргическую возбуждения и ГАМК-торможения. Критические технические требования либо срабатывает лампа дневного света, светодиодные (LED), или двухфотонного SCAnning микроскоп для визуализации дендритных ветвей без введения значительных фото-повреждения ткани. Кроме того, очень важно иметь микро-электрофорез усилитель, который обеспечивает быструю компенсацию емкости высокого пипетки сопротивления. Другим важным моментом является то, что ни передатчика не невольно выпущен пипетки во время эксперимента.

Как только установлено, этот метод будет давать надежные и воспроизводимые сигналы с высокой нейротрансмиттера и расположение специфичности. По сравнению с глутамат и ГАМК uncaging, быстро ионофореза позволяет использовать оба передатчика одновременно, но в очень отдаленных местах без ограничений в поле зрения. Есть также преимущества по сравнению с координационным электрической стимуляции аксонов: с микро-электрофорез расположение входной участок точно известно и то, что только нейромедиатора интерес будет отпущена. Однако необходимо учитывать, что с микро-электрофорез толькоpostsynapse активируется и пресинаптических аспекты высвобождения нейротрансмиттеров не решен. В этой статье мы покажем, как создать микро-ионофореза в экспериментах среза мозга.

Introduction

Нейроны в центральной нервной системе получать различные синаптических входов на их тонкими и разветвленной дендритных процессов 1. Там, большинство возбуждающих входов дендритных опосредованы глутаматэргическую синапсов. Эти синапсах может быть активирована в пространственно распределенных способом, в результате чего постсинаптических линейный интеграции возбуждающие постсинаптические потенциалы (ВПСП). Если синапсы активизируются одновременно и в пространственной близости на дендритов, эти возбуждающие входы могут быть интегрированы сверх-линейно и генерировать 2-5 дендритных шипов.

Кроме того, интеграция возбуждающих входов зависит от местоположения входа на дендритных дерева. Сигналы, которые поступают в дистальной области пучок гораздо более ослабленной, чем проксимальных входов из-за кабеля фильтрацию 6. В гиппокампе далеких вклад в дендритов пучки генерируются другой регион мозга, чем те, на проксимальных dendriTES 7. Волнующий вопрос поэтому, что синаптические Ввод обрабатывается различными отсеками дендритных и если дендритных интеграции регулирует влияние этих слоистых входы нейронов по-разному.

Не только функциональные свойства, морфологические характеристики дендрита, расположение и кластеризации входы, влияющих на дендритных интеграции возбуждающих входов, а также дополнительные входы ингибирующее от ГАМКергических терминалов решающей определить эффективность глутаматэргическую синапсов 8,9. Эти различные аспекты синаптической интеграции может быть идеально исследованы с помощью нейромедиатора микро-электрофорез, что позволяет пространственно определенных применение различных нейротрансмиттеров в дендритных доменов. Мы демонстрируем здесь, как успешно установить микро-ионофореза глутамата и ГАМК расследовать интеграции сигнала в нейронах.

Для этого приложения, с острым концомвысокого сопротивления пипетки заполнены концентрированных растворов нейромедиатора используются. Эти пипетки расположены близко к наружной мембране клетки, где рецепторы нейротрансмиттеров расположены. Хорошим визуализации дендритных ветвей не требуется. Это лучше всего достигается с использованием флуоресцентных красителей, которые вводятся через патч пипетки. Затем очень короткий (<1 мс) импульса тока (в диапазоне 10 – 100 нА) используется для извлечения заряженных молекул нейромедиаторов. С помощью этих коротких импульсов и эффективной компенсации емкости, постсинаптические потенциалы или токи могут быть вызваны с высокой временной и пространственной точностью, что означает, что расположение возбуждающих входных точно известно. Глутамат микро-ионтофореза может активировать синапсов в определенный радиус, который меньше, чем 6 мкм, как показано ниже (рис. 1 9), но также можно достичь одним разрешение синапс 10-12.

Heine, М., и др. </eт> показали, что пространственное разрешение быстрого микро-электрофорез даже может быть настроен на месте размером менее 0,5 мкм, что меньше, чем размеры пятна регулярно достигнуто с двухфотонной uncaging глутамата 13. С быстрым микро-ионофореза это легко можно использовать два или более ионтофоретическая пипетки и разместить их на разных, даже далеких пятна на дендритных дерева. Таким образом, интеграция возбуждающих событий, в том числе из различных путей, могут быть исследованы. Кроме того, можно использовать глутамат и ГАМК заполненные ионтофоретическая пипетки в то же время. Таким образом, эффект ингибирования ГАМК в разных местах по отношению к возбуждающим входа (на пути, вне пути ингибирования) могут быть изучены. Кроме того, влияние ингибирования интернейроны ориентированные на конкретные нейронные доменов, как и дистальных дендритов, сомы или аксонов 14, можно исследовать с помощью ГАМК ионофореза. В культивируемых нейронах, быстрый микро-электрофорез дает возможность INVEstigate одного синапса и распределения элементарных аспектов синаптические связи нейронов в гораздо более подробно 10,11.

В данной статье мы опишем подробно, как установить глутамата и ГАМК ионтофорезом для применения в острых кусочков мозга, который позволяет исследовать синаптической интеграции возбуждающих и тормозящих входов в зависимости от расположения входа, входные сильные стороны, и сроки, самостоятельно или во взаимодействии. Мы выделим преимущества и недостатки этой методики и способы устранения успешно.

Protocol

1. Системные требования Микроскоп система: хорошей визуализации дендритов имеет решающее значение. Если возможно, используйте двухфотонного лазерного сканирующего микроскопа системы. В наших экспериментах мы использовали TRIM Сфера II, LaVision Биотек, Билефельд, Германия или Ultima IV си?…

Representative Results

Простой подход для определения пространственного распространения ионофореза втягивается ионтофоретической пипетки ступенчато от дендрита, сохраняя при этом выбрасывается глутамата постоянной. Мы обнаружили, что пространственные масштабы микро-ионтофоретическая стимуляции имели …

Discussion

Здесь объясняется, как применять быстрые микро-ионофореза нейромедиаторов расследовать синаптической интеграции на дендритов. Этот метод был успешно использован для исследования и глутаматергические ГАМКергическими синаптической передачи в различных регионах мозга в пробирке</e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Ханс Райнер Polder, Мартин Fuhrmann и Уокер Джексона за внимательное прочтение рукописи. Авторы получили финансирование, которое было предоставлено Министерством исследований MIWF государства Северный Рейн-Вестфалия (SR), BMBF Projekträger DLR-американо-германского сотрудничества в вычислительной неврологии (CRCNS; SR), центрами передового опыта при нейродегенеративных заболеваниях (COEN; SR) и Боннского университета очной программы финансирования (Бонфор; SR).

Materials

      Material
Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) LaVision Biotec, Bielefeld, Germany    
Two-photon laser scanning microscope Ultima IV Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA    
Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser Chameleon Ultra II, Coherent    
60X Objective, NA 0.9 Olympus    
Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany    
Monochromator TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany    
Micro-iontophoresis system MVCS-02 NPI Electronics, Tamm, Germany    
Sutter puller P-97 Sutter Instrument Company, Novato, CA    
Glass filaments (150 GB F 8P) Science Products, Hofheim, Germany    
      Reagent
Alexa Fluor 488 hydrazide Molecular Probes life technologies A-10436  
Alexa Fluor 594 Molecular Probes life technologies A-10438  
NaCl Sigma Aldrich S7653  
KCl Sigma Aldrich P9333  
NaH2PO4 Sigma Aldrich S8282  
NaHCO3 Sigma Aldrich S6297  
Sucrose Sigma Aldrich S7903  
CaCl2 Sigma Aldrich C5080  
MgCl2 Sigma Aldrich M2670  
Glucose Sigma Aldrich G7528  
K-Gluconate Sigma Aldrich G4500  
HEPES-acid Sigma Aldrich H4034  
Phosphocreatin Sigma Aldrich P7936  
EGTA Sigma Aldrich E3889  
Glutamic acid Sigma Aldrich G8415  
GABA Sigma Aldrich A5835  
NaOH Merck 1.09137.1000  
HCl Merck 1.09108.1000  

References

  1. Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
  2. Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
  3. Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
  4. Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
  5. Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
  6. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
  7. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
  8. Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
  9. Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
  10. Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
  11. Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
  12. Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
  13. Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
  14. Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
  15. Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
  16. Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
  17. Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
  18. . . Single-Channel Recording. , (2009).
  19. Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
  20. Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
  21. Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
  22. Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
  23. Hahnel, C., Kettenmann, H., Grantyn, R. . Practical Electrophysiological methods. , (1992).
  24. Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
  25. Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
  26. Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
  27. Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
  28. Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).

Play Video

Cite This Article
Müller, C., Remy, S. Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration. J. Vis. Exp. (77), e50701, doi:10.3791/50701 (2013).

View Video