Summary
In dit artikel zullen we snel micro-iontoforese van neurotransmitters als een techniek om de integratie van postsynaptische signalen met een hoge ruimtelijke en temporele precisie onderzoeken.
Abstract
Een fundamenteel belang in neurologie is de integratie van prikkelende en remmende inputs langs het complexe structuur van de dendritische structuur, die uiteindelijk leidt tot neuronale productie van actiepotentialen in de axon begrijpen. De invloed van verschillende ruimtelijke en temporele parameters van specifieke synaptische invoer op neuronale uitgang wordt momenteel onderzocht, bijvoorbeeld de afstand verzwakking van dendritische inputs, de locatie-afhankelijke interactie van ruimtelijk gescheiden ingangen, de invloed van GABAergig remming van prikkelende integratie lineaire en niet-lineaire integratiemodi, en veel meer.
Met snelle micro-iontoforese van glutamaat en GABA is het mogelijk om de ruimtelijke en temporele integratie van glutamaat en GABA-erge remming excitatie nauwkeurig onderzoeken. Kritische technische eisen zijn ofwel een triggered fluorescentielamp, light-emitting diode (LED), of een twee-foton scanning microscoop om dendritische takken visualiseren zonder de invoering van belangrijke foto-beschadiging van het weefsel. Voorts is het zeer belangrijk om een micro-iontoforese versterker die zorgt voor een snelle capaciteit compensatie hoge weerstand pipetten. Een ander belangrijk punt is dat er geen zender onvrijwillig wordt vrijgegeven door de pipet tijdens het experiment.
Eenmaal ingesteld, zal deze techniek betrouwbare en reproduceerbare signalen met een hoge neurotransmitter en locatie specificiteit. Vergeleken met glutamaat en GABA uncaging, snel iontoforese kan met beide zenders tegelijk maar bij zeer lange afstanden zonder beperking van het gezichtsveld. Er zijn ook voordelen tegenover focale elektrische stimulatie van axonen: met micro-iontoforese de plaats van de input site is precies bekend en het is zeker dat alleen de neurotransmitter plaats wordt losgelaten. Nochtans moet dat alleen het micro-iontoforese worden beschouwdpostsynapse wordt geactiveerd en presynaptische aspecten van neurotransmitters zijn niet opgelost. In dit artikel laten we zien hoe het opzetten van micro-iontoforese in de hersenen slice experimenten.
Introduction
Neuronen in het centrale zenuwstelsel ontvangt verschillende synaptische inputs op hun dunne vertakte dendritische uitlopers 1. Daar de meerderheid van de exciterende dendritische ingangen worden gemedieerd door glutamaat synapsen. Deze synapsen kan worden geactiveerd in een ruimtelijk verdeelde manier, wat resulteert in postsynaptische lineaire integratie van excitatoire postsynaptische potentialen (EPSPS). Als de synapsen gelijktijdig en in ruimtelijke nabijheid op de dendriet zijn geactiveerd, kunnen deze prikkelende input supra-lineair worden geïntegreerd en het genereren van dendritische spikes 2-5.
Bovendien is de integratie van excitatoire ingangen afhankelijk van de locatie van de ingang van de dendritische structuur. Signalen die aankomen op de distale tuft regio zijn veel meer verzwakt dan proximale ingangen vanwege kabel filtering 6. In de hippocampus, zijn verre input voor de apicale dendrieten plukje gegenereerd door een ander hersengebied dan die op proximale dendrites 7. Een interessante vraag is daarom wordt hoe synaptische ingang verwerkt dendritische verschillende compartimenten en als dendritische integratie regelt de invloed van deze gelaagde ingangen neuronale op verschillende manieren.
Niet alleen de functionele eigenschappen, morfologische kenmerken van de dendriet, de plaats en clustering van de ingangen die de dendritische integratie van prikkelende inputs, ook extra remmende inputs van GABAerge terminals cruciaal bepalen de doeltreffendheid van de glutamaat synapsen 8,9. Deze verschillende aspecten van synaptische integratie kan ideaal worden onderzocht met behulp neurotransmitter micro-iontoforese, die ruimtelijk gedefinieerde toepassing van verschillende neurotransmitters kunnen dendritische domeinen. We zien hier hoe de micro-iontoforese van glutamaat en GABA succes vast te signaalintegratie onderzoeken in neuronen.
Voor deze toepassing, fijne punthoge weerstand pipetten gevuld met geconcentreerde neurotransmitter oplossingen worden gebruikt. Deze pipetten dichtbij de buitenste membraan van de cel, waarbij de neurotransmitter receptoren zich bevinden geplaatst. Een goede visualisatie van de dendritische takken vereist. Dit wordt het beste bereikt met fluorescerende kleurstoffen die worden ingevoerd via de patch pipet. Vervolgens een zeer korte (<1 msec) stroompuls (in het bereik van 10-100 nA) wordt gebruikt om de geladen neurotransmittermoleculen werpen. Met deze korte pulsen en de effectieve capaciteit compensatie kunnen postsynaptische potentialen en stromen worden opgewekt met een hoge temporele en ruimtelijke nauwkeurigheid, waardoor de plaats van de exciterende ingang precies bekend. Glutamaat micro-iontoforese kan synapsen activeren in een bepaalde straal, die kleiner is dan 6 micrometer zoals hier getoond (Figuur 1 9), maar het is ook mogelijk om enkele oplossing synaps 10-12 bereiken.
Heine, M., et al. 13 zien. Met snelle micro-iontoforese is het eenvoudig mogelijk om twee of meer iontoforetische pipetten gebruiken en plaats ze op verschillende, zelfs verre vlekken op de dendritische structuur. Op deze wijze kan de integratie van prikkelende gebeurtenissen, met inbegrip van verschillende paden worden onderzocht. Het is ook mogelijk om een glutamaat en GABA gevulde pipet iontoforetische tegelijkertijd gebruikt. Op deze manier wordt de werking van GABA-erge remming op verschillende locaties ten opzichte van de prikkelende ingang (on-pad, off-path remming) kan worden onderzocht. Ook het effect van remming door interneuronen richten op specifieke neuronale domeinen, zoals distale dendrieten, axonen soma of 14, te onderzoeken met behulp GABA iontoforese. In gekweekte neuronen, fast micro-iontoforese biedt de mogelijkheid om INVEstigate enkele synaps distributie en de elementaire aspecten van synaptische communicatie in neuronen in veel meer detail 10,11.
In dit artikel laten we zien in detail hoe glutamaat en GABA iontoforese voor het gebruik bij acute hersenen plakjes, die het mogelijk maakt te onderzoeken synaptische integratie van prikkelende en remmende input in afhankelijkheid van invoer plaats, ingang sterke punten, en de timing, alleen of in samenspel vestigen. We zullen wijzen op de voordelen en beperkingen van deze techniek en hoe succesvol oplossen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Systeemvereisten
- Microscoopsysteem: Goede visualisatie van de dendriet is cruciaal. Indien beschikbaar, gebruik maken van een twee-foton laser scanning microscoop systeem. In onze experimenten gebruikten we een TRIM Scope II, LaVision Biotec, Bielefeld, Duitsland of een Ultima IV systeem Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin voorzien van een Ti: saffier ultrasnelle gepulste laser (Chameleon Ultra II, Coherent) en hoge NA doelstelling (60X, 0.9 NA, Olympus) naar de dendrieten, die we hadden gevuld met een fluorescerende kleurstof via de patch pipet visualiseren. Hoewel foto-schade wordt beschouwd minder ernstig met 2-foton scannen, verminderen laservermogen (hierna 8 mW op weefsel) en verblijftijden (minder dan 1 usec) of zoveel mogelijk.
- Een tweede mogelijkheid is om een wide-field fluorescentie lichtbron (LED of een fluorescentielamp) synchroon triggeren met acquisitie om de blootstelling te verminderen zoveel mogelijk. We hebben gebruik gemaakt van een monochromator met een geïntegreerde lichtbron (TILLPhotonics, Gräfelfing, Duitsland) op een Zeiss Axioskop 2 FS rechtopstaande microscoop, die was uitgerust met Dodt-contrast infrarood verlichting (TILLPhotonics, Gräfelfing, Duitsland). In onze experimenten blootstellingstijden varieerde meestal van 10 msec tot max.. 30 msec.
- Gebruik een snelle micro-iontoforese versterker, bijvoorbeeld een twee-kanaals micro-iontoforese systeem MVCs-C-02 (NPI elektronisch, Tamm, Duitsland) met snelle capacitieve compensatie. De fijne punt iontoforese micro-elektroden moeten weerstanden van 25-100 MQ (cruciaal afhankelijk van de punt grootte en de pipet vorm), en de snelle opkomst tijden kan alleen worden bereikt als de capacitieve compensatie van de iontoforese versterker optimaal is afgestemd. Deze snelle compensatie is nodig om de huidige pulsen toe te passen met een korte en snelle aanvang in de sub-milliseconden aan de iontophoretic pipet en aldus de zender met een hoge ruimtelijke resolutie in spotgroottes onder de 1 micrometer 13 uit te werpen. Iontoforese versterkers zijn aldus verkrijgbaar bij diverse andere bedrijven, die wij niet in ons laboratorium hebben getest. Deze apparaten zijn naar ons weten niet met capaciteit compensatieschakelingen.
2. Bereid Solutions
- Bereid kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) en interne oplossing is vereist voor proefopzet. De enige toevoeging aan de interne oplossing die nodig is een rode of groene fluorescente kleurstof (bijvoorbeeld 50 tot 200 uM Alexa Fluor 488 of 594 hydrazide, Invitrogen), afhankelijk van de optische uitrusting. Hier een voorbeeld ACSF sucrose die gebruikt kunnen worden voor dissectie, in mM: NaCl 60, 100 sucrose, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2PO 4, 26 NaHCO3 1 CaCl2, 5 MgCl2, 20 glucose, en normale ACSF oplossing voor patch-clamp experimenten in mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH 2PO 4, 26 NaHCO3, 2,6 CaCl2, 1,3 MgCl2, 15 glucose.
- Carbogenize (95% O 2, 5% CO 2) alle extracellulaire oplossingen continu.
- Bereid interne oplossing, bijvoorbeeld in mM: 140 K-gluconaat, 7 KCl, 5 HEPES-zuur, 0,5 MgCl2, 5 Phosphocreatine, 0,16 EGTA, met 50-200 uM Alexa 488.
- Voor glutamaat micro-iontoforese wordt een oplossing met 150 mM glutaminezuur en de pH op 7,0 met NaOH. Voeg 50 -200 uM Alexa Fluor 488 of 594 hydrazide (Invitrogen) voor visualisatie.
- Bij iontoforese van GABA bereiden een 1 M oplossing GABA en de pH op 5 met HCl 15. Bij deze pH GABA betaalt alleen dan kan worden aangebracht met iontoforese. Let op: de lage pH in de oplossing uitgeworpen naar de extracellulaire ruimte zou GABA transmissie zelf 16,17 bewerkstelligen.
Bescherm de GABA-oplossing tegen licht en vaak te bereiden verse GABA voorraad oplossing, aangezien oudere oplossing kan zijn effectiviteit verliezen. - Als het moeilijk is om GABAergic gebeurtenissen, een hi ziegh Cl - drijvende kracht interne oplossing, bijvoorbeeld door het weglaten van KCl, zou kunnen helpen om te visualiseren de GABA-erge gebeurtenissen om te zien of de GABA iontoforese werkt, maar om synaptische integratie onderzoeken een fysiologische drijvende kracht zou kunnen worden aanbevolen. Voor algemene detectie van kleine GABAergic gebeurtenissen, kan een protocol weergegeven in figuur 8C helpen.
3. Trek en Test de Iontoforese pipetten
- In het algemeen, het trekken van de juiste pipetten is misschien wel de meest cruciale stap om gecontroleerde neurotransmitter iontoforese bereiken. Bij het gebruik van iontoforese in celkweek, is het mogelijk om zeer fijne elektroden vergelijkbaar met scherpe micro-elektroden 10 trekken. In patch-clamp experimenten acute segmenten zijn deze zeer dunne pipetten buigen op de slice oppervlak wanneer ze worden neergelaten in het weefsel met een hoek, waardoor het onmogelijk dieper dendrieten bereiken.
- Daarom trek een pipet met een heel klein puntje, zodat er geen neurotransmitter kan lekken, maar de punt moet toch stijf genoeg te dringen in het weefsel (Figuur 2). Gebruik bijvoorbeeld 150 GB F 8P klasse pipetten (Science Products, Hofheim, Duitsland) en een horizontale trekker (bijvoorbeeld een DMZ-Universal Puller, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Duitsland, of een P-97 Puller, Sutter Instrument Company , Novato, CA) met een aantal trekken stappen om een kleine opening, maar ook een korte aantikker bereiken met een steile hoek (figuur 2 en tabel 2).
- Het is ook mogelijk om kwartsglas pipetten om iontoforetische pipetten trekken 10. Deze worden verondersteld om betere mechanische eigenschappen hebben en meer betrouwbaar te zijn, maar speciale laser pullers zijn vereist. Maar het is ook mogelijk om goede resultaten bij glazen pipetten, die gewoonlijk worden gebruikt voor het trekken patch pipetten bereiken.
- Test de pipet prestaties en weerstand in een kamer zonder weefsel, alvorens ze voor de eerstetijd, aangezien lekkage van glutamaat kunnen schaden het weefsel.
- Stel de iontoforese versterker correct. Vul dan de pipet met de neurotransmitter en kleurstof bevattende oplossing en plaats deze in het bad (ACSF).
- Compenseer de capaciteit (figuur 3). Meestal zeer scherpe pipetten zal een hogere capaciteit dan de botte degenen.
- De weerstand van de pipet: De micro-iontoforese versterker hier gebruikt heeft een ingebouwde functie voor het meten van de pipet weerstand. Het roept korte rechthoekige testpulssignalen, die kunnen worden gecontroleerd met een standaard oscilloscoop of een A / D-board aangesloten op een computer met acquisitie software. Afhankelijk van de vorm en de tip grootte, moet de tip van een weerstand tussen 25 hebben - 90 MQ.
- Focus op het puntje met een 60X of 40X water immersie objectief en overschakelen naar fluorescerende beeldvorming en zo mogelijk vergroten Als fluorescerende kleurstof lekt uit de pipet tip, breng een kleine positieve (in het geval van gluTamate) of negatief (bij GABA, figuur 4) behouden stroom (<0,02 uA). Als dat niet helpt om de lekkage te annuleren, veranderen de pipet.
- Breng een sterke stap stroom of gebruik de handmatige trekker en bewaken van de tip in de fluorescerende afbeelding om te zien of de oplossing kan worden uitgeworpen uit de pipet. Zoals hierboven vermeld, wordt de polariteit van de stroompuls afhankelijk van de lading van het molecuul dat wordt verondersteld te worden uitgeworpen. Uitwerpen glutamaat is een negatieve stroom en GABA een positieve stroom (figuur 4).
- Luchtbellen in de pipet dat blok uitwerpen van kleurstof en zender, kunnen worden gewist door het toepassen van een hoge uitwerpen stroom meerdere keren.
- Samen genomen, indien er geen zichtbare lekkage beproevingsgegevens uitwerpen geslaagd, compenseren de capaciteit en start het experiment.
- Opgelet: Aangezien capaciteit compensatie wordt bereikt door een terugkoppeling, deze schakeling kan doorschieten of oscilleren als het overcompensated. Voorzichtig Gebruik de instelknop voor capacitieve compensatie.
- Afhankelijk van de trekker stabiliteit is het soms noodzakelijk de trekker instellingen van tijd tot tijd aan te passen, aangezien de gloeidraad eigenschappen hebben veranderd. Indien eenmaal een goede pipet is ontworpen, kan worden gebruikt voor meerdere dagen. Daarom, na afloop van de proef slaan de iontoforese pipet in een gesloten container zonder beschadiging van de tip.
- Voor het volgende experiment vul de pipet met de neurotransmitter oplossing, gelden een aantal sterke eject pulsen naar de punt te wissen en dan controleren of de eigenschappen (bv. weerstand) veranderen aanzienlijk. Alsdan de capaciteit en weer gebruik maken van de pipet. Gebruik geen enkele pipet met verschillende neurotransmitter oplossingen.
4. Bereid de Brain Slices
- Als micro-iontoforese wordt gebruikt voor de eerste keer zeker de schijfjes te bereiden na de oprichting van een betrouwbaar werkende trekker programma. <li> Perform anesthesie en onthoofding procedures in overeenstemming met het dier richtlijnen verzorging van uw instelling of plaatselijke instantie.
- Na het verwijderen van de hersenen, overbrengen naar ijskoude ACSF sucrose (zie Protocol 2.1).
- Snijd het interessegebied in plakken van geschikte dikte (bijvoorbeeld 300 um).
- Incubeer de segmenten in ACSF saccharose bij 35 ° C gedurende 30 minuten. Vervolgens overbrengen naar een ondergedompelde deelneming kamer die normaal ACSF bij kamertemperatuur.
- Gedurende de voorbereiding en experiment carbogenize de ACSF rond de schijfjes met 95% O 2, 5% CO 2.
5. Instelling van een Whole-cell opname
- Plaats de iontoforese pipet (s) al in de buurt van de slice oppervlak voordat het patchen van een cel, om langdurige plaatsing te vermijden, na vaststelling van de whole-cell-modus.
- Trek een lage weerstand patch pipet (3 - 5 mQ), vul het met de dgij met interne oplossing en toepassing positieve druk op de pipet (30 - 60 mbar).
- Voer het bad en de aanpak van de cel onder visuele begeleiding (infrarood Dodt contrast of twee afbeelding foton gradiënt contrast).
- Toezicht op de pipet weerstand met een test puls (bijv. -10 mV, 20 msec) in voltage clamp-modus. Bij het aanraken van het weefsel te corrigeren de offset potentieel.
- Benader de cel en duw de pipet tip in het tot een 'kuiltje' is duidelijk te zien. De druk van de pipet onmiddellijk vrij toepassen 40-60 mbar onderdruk en schakel de membraanpotentiaal op -65 mV.
- Wanneer de holding huidige waarden onder 100 pA bereikt, laat de negatieve druk.
- Na invoering van een giga afdichting (weerstand> 1 GQ), breuk van het membraan met een korte, sterke zuigkracht van de pipet of korte overcompensatie van de capacitieve compensatie circuit.
- Afhankelijk van de modus (spanning of stroom klem) is vereistvoor de experimentele opzet, compenseren adequaat.
- Start om de iontoforese pipet op zijn definitieve plaats te brengen. Als een meer gedetailleerde beschrijving van hoe u succesvol patch clamp opnamen uit te voeren nodig is, zijn er verschillende uitstekende richtlijnen beschikbaar 18,19.
6. Plaats de Iontoforetische pipet en het genereren van een Postsynaptische Iontoforetische Potential
- In het algemeen kan iontoforetische gebeurtenissen worden opgeroepen op bepaalde locaties, afhankelijk van de gewenste experiment, bijvoorbeeld bij een stekelige dendriet voor glutamaat micro-iontoforese, op dendritische as, soma of axon eerste segment GABA micro-iontoforese.
- Benader de cel tot ongeveer 1 micrometer afstand zonder het aan te raken. Na het bereiken van het punt van belang is het cruciaal dat er geen neurotransmitter lekt en dat de pipet capaciteit wordt correct gecompenseerd.
- Als het naderen van de cel met een glutamaat gevulde iontoforetisch pipette veroorzaakt detecteerbare depolarisatie van de membraanpotentiaal, passen de huidige te behouden, indien mogelijk, of verander de pipet.
- Solliciteer korte negatieve stroom pulsen, te beginnen vanaf nul en verhoging van het huidige systematisch (bv. 0,1-0,4 msec, 0,01-1 uA pulsen). Dit helpt om uit te vinden in welke range de iontoforese huidige roept de gewenste reacties in de specifieke experimentele set-up.
- Als er geen reactie waarneembaar, til de pipet enkele honderden micrometers en breng een sterke eject stroom (> 0,1 uA) aan de punt te reinigen. Pas de capacitieve compensatie, benaderen de cel, en probeer het opnieuw.
- Als er nog steeds geen reactie, het verminderen van de huidige te behouden. Wees zeer voorzichtig met de instellingen wijzerplaat omdat deze procedure kan ongecontroleerd neurotransmitters veroorzaken. Daarom voortdurend de opname te onderscheiden veranderingen te detecteren in de membraanpotentiaal.
- Als het moeilijk is om GABAergic gebeurtenissen te detecteren, kan het nuttig zijn om een te gebruikenn interne oplossing samenstelling waardoor in een hoge Cl - drijvende kracht. Om dit te bereiken, verkleinen de Cl - concentratie in de pipet oplossing (zie protocol paragraaf 2.6.). Dit resulteert in grotere GABAerge gebeurtenissen in rust membraanpotentiaal door de hogere drijvende kracht.
- Als alternatief injecteren lang lopende stappen resulteert in membraanpotentiaal kansen van -100 mV tot -48 mV (Figuur 8C). Met dit protocol de Cl - drijvende kracht is verhoogd bij hyperpolarized potentials waardoor een depolariserende GABA reactie.
- Het is ook mogelijk om de stap stroominjectie-protocol om de omkering potentieel van de opgewekte gebeurtenissen, die helpt bij het GABAerge aard van de gebeurtenissen bepalen bepalen. Lekkage van GABA is moeilijker te detecteren dan lekkage van glutamaat. In dit geval kan een constante controle van de ingangsweerstand helpen bij het GABA gevulde pipet wordt benaderd. Als de input weerstand afneemt, het behouden huidige kan be verhoogd of een ander pipet worden gebruikt.
- Als controle-experimenten voor glutamaat iontoforese, raden we een Ca 2 + imaging experiment, met behulp van 200 uM OGB-1 en geen EGTA in de pipet oplossing voor lokale calciuminstroom visualiseren die kunnen worden veroorzaakt door lekkende glutamaat.
- In het algemeen een stabiele respons is zeer belangrijk om een mechanisch stabiele pipet drift in de tijd te vermijden. Drift kan worden veroorzaakt door veranderingen in temperatuur, dan is het raadzaam om de computer inschakelt tenminste een half uur voor de meting van thermische drift te voorkomen. Zorg ervoor dat u goede cartridge seals gebruiken in de pipet houder en de tip is echt vast. De houder zelf kan bovendien worden vastgezet met teflon tape, bovendien, er zeker van zijn dat er geen spanning op de kabels van de headstage of manipulator, die ook een potentiële bron van drift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een eenvoudige benadering van de ruimtelijke spreiding van iontoforese te bepalen is om de iontoforese pipet stapsgewijs uit de dendriet trekken, terwijl de uitgeworpen glutamaat constant. We vonden dat de ruimtelijke omvang van een micro-iontoforetische stimulatie had een diameter van ongeveer 12 urn (figuur 1 dat radius). Hoe diep in het weefsel de iontoforese kan worden gebruikt afhankelijk van de stijfheid van de pipet. De iontoforetische pipetten nodig voor experimenten in plakken (figuur 2), die hier worden gebruikt, zijn niet beperkend de indringdiepte. Eerder het optische systeem en de dalende resolutie de diepte van de hersenen slice is de beperkende factor. Voor een goede kwaliteit opname is het cruciaal dat er geen zender lekt uit de pipet. Bij glutamaat kan een lekkage worden geïdentificeerd als er een plotselinge depolarisatie als de dendriet wordt benaderd met de pipetpunt of de basislijn plotselingonstabiel (figuur 5). Na een stabiele opname, is het mogelijk om EPSPS van gedefinieerde amplitudes, dendritische spikes of actiepotentialen roepen met deze techniek op een locatie in de dendritische structuur (figuur 6). Door glutamaat met snelle micro-iontoforese, de eigenschappen van EPSPS, de voortplanting en optelling, gelijktijdig op verschillende nog verre locaties, kunnen worden onderzocht (Figuur 7). GABAerge gebeurtenissen kunnen alleen of bovendien worden opgeroepen om glutamaat met een tweede pipet vullen iontoforetische pipet met een sterk geconcentreerde oplossing GABA (zie: Protocol punt 2) en een positieve eject stroom. Er is een eenvoudig protocol om de GABAergic aard van de gebeurtenissen te bevestigen en GABA-erge gebeurtenissen gemakkelijker op te sporen, zo niet met behulp van een hoge drijvende kracht interne oplossing: Spuit negatieve stromen (ca. 1 sec, de amplitude is afhankelijk van de input weerstand van de cel) resulteert in hyperpolarising vostappen ltage, vanaf ongeveer -100 mV en verhoog 5 mV in stappen (figuur 8). Bij zeer negatieve potentialen het GABAerge gebeurtenissen wordt sneller gedetecteerd, door de hogere drijvende kracht. En als de signalen keren rond de berekende Cl - omkering potentieel voor de oplossingen, is het zeer waarschijnlijk dat ze GABAergic aard (figuur 8). Met een extra GABA micro-pipet iontoforese, is het mogelijk te onderzoeken, bijvoorbeeld het effect van GABA-erge remming van glutamaat gebeurtenissen, zoals dendritische natrium / calcium spikes, door het variëren van de relatieve timing van dendritische spike en IPSP (figuur 9), de relatieve ligging van beide evenementen, of hun amplitudes. (Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Bonn, het Duitse Centrum voor neurodegeneratieve ziekten en de staat Noordrijn-Westfalen.)
Figuur 1. Ruimtelijke omvang van iontoforetisch uitgeworpen glutamaat bepaald pipet terugtrekken. A) Maximale intensiteit projectie van een twee-foton beeld van een CA1 piramidale cel dendriet gevuld met 100 uM Alexa 594 en de iontoforese pipet in de uitgangspositie (schaal bar 8 micrometer). Inlegwerk laten terugtrekken van de iontoforese pipet en de bijbehorende iontoforetisch EPSP opgenomen op de soma. Pijl geeft de positie van de iontoforese pipet tip. B) Afstand afhankelijkheid van EPSP amplitude ten opzichte van de uitgangspositie van de iontoforese pipetpunt (≤ 1 micrometer afstand van dendriet, n = 6 vestigingen). Hiermee kunnen we schatten dat de straal van de glutamaat verspreid door systematisch het terugtrekken van de pipet. Inzet toont representatief voorbeeld sporen. Fout balken gevengemiddelde ± SEM. (Aangepast van Müller et al.. 2012 9, afgedrukt met toestemming van Elsevier).
Figuur 2. Hoe een iontoforetisch pipet eruit moet zien. A) Infrarood CCD beeld van een iontoforese-pipet in vergelijking met een kleine 5,5 MQ patch pipet met behulp van een 60X objectief. B) Iontoforetische pipet met schaal met behulp van een 60X objectief. Kalibratie: kleinste = 10 micrometer.
Figuur 3. Capacitieve compensatie van de iontoforese pipet met behulp van de ingebouwde in de test-puls (10 nA, 10 msec, NPI elektronisch, Tamm,Duitsland). Het is belangrijk om de capaciteit kunnen compenseren rechts pipet weerstand volgen en snel en accuraat neurotransmitter toepassing ervan.
Figuur 4. Beginselen van de micro-iontoforese. A) Schematische tekening van een CA1 piramidale neuron in whole cell patch-clamp configuratie en een iontoforetisch pipet gevuld met glutamaat. Glutamaat is negatief geladen, dus een positieve stroom toegepast op de pipet zal het houden van lekken uit de pipet: Het behouden stroom is positief (linker paneel). Om glutamaat uitwerpen van de pipet, breng dan een negatieve stroom (rechter paneel). Op deze manier glutamaat wordt gedwongen uit de pipet en kan oproepen prikkelende gebeurtenissen in de postsynaptische cel. B) Schematische tekening van CA1 piramidale neuron in whole cell patch-clamp configuratie en een iontoforetisch pipet gevuld met GABA. GABA is positief geladen bij een lage pH. Daarom zal een negatieve stroom te voorkomen dat hij lekt uit de pipet (linker paneel). Om uit te werpen GABA toepassing een positieve stroom (rechter paneel). Op deze manier komt GABA uit de pipet en kan oproepen remmende gebeurtenissen in de postsynaptische cel.
Figuur 5. Goede en slechte iontoforetisch pipetten. A) Representatief voorbeeld van een iontoforetische glutamaat EPSP gegenereerd op een tak van een dendritische CA1 pyramidale neuron. B) representatief voorbeeld van een iontoforetische dendritische piek genereerde een dendritische tak in het gebied van de hippocampus met aanhoudende milde glutamaat lekkage uit de pipetpunt CA1.
Figuur 6. Representatieve resultaten voor alleenstaande glutamaat micro-iontoforese. A) Schematische tekening van een gepatchte CA1 piramidale neuron en een iontoforetisch pipet gevuld met glutamaat. B) EPSP opgeroepen in een CA1 piramidale neuron met glutamaat iontoforese. C) Dendritische Na + / Ca 2 + spike opgeroepen op een proximale dendriet van een CA1 pyramidale neuron, onderste trace geeft de helling van de spanning spoor, piek geeft de piek helling van de dendritische spike. D) Door verhogen van de stroom toegevoerd aan de iontoforese de amplitude van de EPSP te verhogen tot aan het kruispunt van de actiepotentiaal drempel.
"Fo: src =" / files/ftp_upload/50701/50701fig7highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50701/50701fig7.jpg "/>
Figuur 7. Representatieve resultaten voor dubbel glutamaat micro-iontoforese op verschillende locaties op de dendritische boom. A) Schematische tekening van een patched CA1 pyramidale neuronen en twee iontoforetische pipetten gevuld met glutamaat, die zijn geplaatst op een proximaal en een distaal dendriet respectievelijk. B) Iontoforetisch EPSP opgewekt op een proximaal dendriet van CA1 pyramidale neuron (1). C) Iontoforetisch EPSP opgewekt op een distaal dendriet (2).
Figuur 8. Representatieve resultaten voor GABA micro-iontoforese. A) Schematische tekening van een gepatchte CA1 piramidale neuron en een iontoforetisch pipet gevuld met GABA.B) Iontoforetische IPSP opgeroepen op een proximale dendriet van een CA1 piramidale neuron. C) Lange huidige injectie van systematisch veranderende amplitudes een CA1 piramidale neuron via de patch pipet, om de omkering potentieel van de evoked evenement (huidige injecties van -400 pA bepalen tot 0 pA). Artefact geeft tijd-punt van GABA iontoforese. De evoked gebeurtenis geeft een omkering potentieel van ongeveer -70 mV (pijl).
Figuur 9. Representatieve resultaten van gelijktijdige glutamaat en GABA iontoforese om de integratie van inhibitie en excitatie te onderzoeken. A) Schematische tekening van een gepatchte piramidale neuron en een pipet gevuld met glutamaat (groen) en op met GABA (oranje). B) iontoforetisch opgeroependendritische spikes alleen, in de daaropvolgende sweeps, lagere sporen tonen dV / dt, pieken duiden dendritische spikes. C) iontoforetisch alleen opgeroepen IPSP. D) Beiden, glutamaat en GABA-erge gebeurtenissen samen.
| Locatie specificiteit | Zender specificiteit | Toxiciteit / bijwerkingen | Presynaptische stimulatie | Lange termijn experiment | Kosten / complexiteit | |
| Micro-iontoforese | + + | + + + | + + | - | + + | + + |
| 2-foton uncaging | + + + | + + + | + | - | + | + |
| Synaptische stimulatie | - | - | + + + | + + + | + + + | + ++ |
Tabel 1. . Vergelijking van verschillende technieken en nadelen van technieken om neuronen te stimuleren op basis van verschillende criteria (- = slecht, + = niet optimaal, + + = goed, + + + = het beste).
| Patch pipetten | Iontoforetische pipetten | |||
| Pre-trekt P (A) Single pull | Laatste Pull P (B) | Pre-trekt P (A) Single Pull | Laatste Pull P (B) | |
| Warmte H | 700 | 480 | 510 | 600 |
| Force Pre Pull F (TH) | 018 | 035 | 018 | 008 |
| Afstand Threshold s (TH) | 017 | 012 | 025 | 015 |
| Vertraging Heatstop t (H) | 050 | 030 | 050 | 030 |
| Afstand Heatstop s (H) | 030 | 000 | 030 | 000 |
| Vertraging F (F1) | 000 | 136 | 000 | 050 |
| Dwingen Trek 1 F1 | 000 | 065 | 200 | 400 |
| Afstand Pull 2 s (F2) | 000 | 005 | 000 | 001 |
| Dwingen Trek 2 F2 | 000 | 080 | 000 | 095 |
| Aanpassen (AD) | 121 | 000 | 121 | 000 |
Tabel 2. Voorbeeldig puller protocol. Voor een horizontale trekker (DMZ-Universele Puller, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Duitsland), met behulp van GB150F-8P filamenten (Science Products, Hofheim, Duitsland) voor zowel de patch en iontoforetisch pipetten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier leggen we uit hoe u snel micro-iontoforese van neurotransmitters toepassing op synaptische integratie te onderzoeken op de dendrieten. Deze techniek is met succes gebruikt voor Glu en GABA-erge synaptische transmissie onderzocht in verschillende hersengebieden in vitro en in vivo 9,20-22. Micro-iontoforese wordt al meer dan 60 jaar, maar in de vroege jaren werd meestal gebruikt om lokaal neurotransmitters en geneesmiddelen op langzame of tussenproducten tijdschema 23 of micro-injectie van stoffen in cellen 24 toepassen.
Micro-iontoforese werd een bijzonder interessant instrument voor het bestuderen dendritische integratie sinds de invoering van versterkers, die zijn voorzien van een snelle capaciteit compensatie voor hoogohmige elektroden 10,11. Met deze verbetering werd het mogelijk om korte rechthoekige iontoforese stromen resulteert in postsynaptische reacties, die rese toepassingmbled realistischer het tijdsverloop van synaptische gebeurtenissen 10,25.
Wat zijn de technische vereisten en problemen om te gaan met, bij de vaststelling van micro-iontoforese? Een iontophoretic versterker is nodig dat zorgt voor compensatie van de hoge capaciteit van de boete iontoforetische pipetten. De juiste afstemming van de capaciteit van de vergoeding is zeer belangrijk als hoge snelheid in combinatie met een hoge weerstand tegen micro-elektroden vereist. Gecompenseerde strooicapaciteiten betalen uit de iontoforetische stroom die wordt geleverd door het instrument, en vertraagt daarom de toepassing. Goed compenseren van de capaciteit is cruciaal en in detail uitgelegd in de video. Bovendien is het essentieel dat het optische systeem geeft een goed beeld van de fluorescerende dendriet en iontoforese pipet en zonder het foto-beschadiging van het weefsel. Optimaal gebruik maken van een twee-foton-systeem en verminderen laservermogen en verblijftijden zoveel als verenigbaar meteen behoorlijke beeldkwaliteit. Indien een meer conventionele lichtbron wordt gebruikt, zorg ervoor dat de belichtingstijd zo veel mogelijk te beperken, bijvoorbeeld door het gebruik van mechanische luiken of elektrische schakeling. Waarschijnlijk de meest kritische punt is de pipet ontwerp, die zal zorgen voor een welbepaalde en specifieke toepassing van de neurotransmitter gebruikt. Deze stap vergt enige inspanning en tijd om de optimale instellingen te vinden. Hier presenteren we protocollen voor glutamaat en GABA iontoforese, als andere neurotransmitters, antihistaminica of modulatoren worden gebruikt, is het noodzakelijk dat de stof sterk geconcentreerd en nog belangrijker is opgeladen. Bijvoorbeeld, omdat GABA heeft een netto lading van nul op een pH van 0, de pH te worden ingesteld (zie Protocol punt 2), resulterend in een netto positieve lading.
Bij micro-iontoforese is vastgesteld, zal het een uitgebreide toolset bieden aan synaptische integratie in neuronen te bestuderen. Het maakt het mogelijk het stimuleren synapsen van belang selectief meteen bepaalde neurotransmitter. Met behulp van een geselecteerde neurotransmitter op bepaalde locaties, postsynaptische stromingen en potenties en hun voortplanting kan worden onderzocht. Verder is het mogelijk om meerdere iontoforetische elektroden tegelijk om de integratie van diverse glutamaat inputs onderzoeken of systematisch wijzigen van de relatieve timing of de sterkte van gebeurtenissen.
Enkele algemene kritische punten moeten worden overwogen bij het gebruik van micro-iontoforese. Het profiel van de neurotransmitter concentratie na micro-iontoforese is verschillend van endogene release. Murnick en anderen 10 gemeld dat de snelheid van de introductie van de iontoforese tip (ongeveer 1 msec) is waarschijnlijk aanzienlijk langzamer dan synaptische vrijlating uit de blaasjes, die optreedt in een fractie van een milliseconde (0,2 msec) 26. Ook wordt diffusie en naar de synaptische spleet waarschijnlijk vertragen concentratie opkomst en het verval van iontoforetisch toegepast neurotransmitters.Bovendien is het volume van de uitgestoten neurotransmitter waarschijnlijk hoger dan fysiologisch vrijgegeven volumes zijn echter met een hoge weerstand elektroden, enkel glutamaat en GABA-erge postsynapses kunnen worden geactiveerd met behulp van micro-iontoforese 10-12. Een ruimtelijke selectiviteit in het bereik van enkele micrometers is onlangs ook bereikt met twee-foton uncaging van neurotransmitters 3,4,27.
Terwijl aanzienlijk meer kosten intensieve, twee-foton uncaging heeft verschillende voordelen ten opzichte van micro-iontoforese. In het bijzonder kan worden gebruikt om gelijktijdig neurotransmitter vrij op meerdere synaptische plaatsen en een nauwkeurige positionering van een fijne elektrode niet vereist. Het heeft echter ook een aantal belangrijke nadelen voor het selecteren van een werkwijze voor een bepaald experiment. Veel gekooide verbindingen ongewenste neveneffecten zoals de blokkade van neurotransmitterreceptoren 28. Bijvoorbeeld, veel glutamaat en GABA kooiengemeld te belemmeren erge remming. Ook kan de relatief hoge laservermogen nodig voor twee-foton uncaging gevolg foto-beschadiging van de postsynaptische neuron, met name wanneer de stimulatie herhaaldelijk wordt aangebracht over enkele minuten. Bovendien, terwijl micro-iontoforese wordt beperkt in het aantal gestimuleerde sites, hier vrij worden gekozen op de hele vertakte structuur van een neuron, bijvoorbeeld over distale en basale dendrieten te simuleren gelaagde synaptische input van verschillende hersengebieden. Twee-foton uncaging, zoals momenteel wordt gebruikt door de meeste groepen beperkt tot synaptische plaatsen in een bepaalde brandpuntsvlak en het gezichtsveld, die afhangt van het gebruikte objectief (typisch 40X en 60X water onderdompelen). Moet worden aangenomen dat beide technieken altijd leiden tot activering van extrasynaptic receptoren, die de interpretatie van de resultaten bemoeilijken.
Een ander nadeel van micro-iontoforese is dat olleen de postsynapse kan worden geactiveerd. Als presynaptische functie en de rol van vesikel-vrijgegeven neurotransmitter moeten worden ingesteld in de experimentele focus, kan de lokale elektrische synaptische stimulatie een methode van keuze te zijn. Echter, de nadelen van elektrische synaptische stimulatie vergeleken micro-iontoforese zijn de onbekende locatie van de geactiveerde synapsen en co-activatie van axons van verschillende neuronale populaties, eventueel van andere neurotransmittersystemen (tabel 1).
In de samenvatting van de belangrijkste voordelen van micro-iontoforese is, naar onze mening, dat het mogelijk is om verschillende neurotransmitters gebruiken en hun interactie op neuronale compartimenten zoals dendrieten 9 bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann en Walker Jackson voor het zorgvuldig lezen van het manuscript. De auteurs ontvingen financiering die werd verstrekt door het ministerie van onderzoek MIWF van de staat Noordrijn-Westfalen (SR), de BMBF-Projekträger DLR US-Duitse samenwerking in computational neuroscience (CRCNS, SR), Centers of Excellence in neurodegeneratieve ziekten (COEN; SR), en de Universiteit van Bonn intramurale programmafinanciering (BONFOR; SR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
References
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- Single-Channel Recording. , Springer. (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C. Practical Electrophysiological methods. Kettenmann, H., Grantyn, R. , Wiley-Liss. (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
