Summary
רקמת שומן (AT) היא אתר של הפעלת תא חיסונית חזקה ואינטראקציה. כמעט בכל התאים של המערכת החיסונית נמצאים בAT ויחסים שלהם שונו על ידי השמנת יתר. בידוד נכון, כימות, ואפיון של אוכלוסיות בתא חיסון הם קריטיים להבנת תפקידם במחלה immunometabolic.
Abstract
הגילוי של חדירת מקרופאג גדל ברקמת השומן (AT) של מכרסמים ובני אדם סובלים מהשמנת יתר הוביל להתגברות העניין בתרומה של תאים חיסונית לעמידות לאינסולין מקומית ומערכתית. בידוד וכימות של אוכלוסיות תאי חיסון שונות ברזה והשמנת יתר בחברה הוא טכניקה מנוצל בדרך כלל במעבדות immunometabolism; טיפול עדיין קיצוני יש לנקוט הן בבידוד בתא בכלי דם סטרומה וניתוח תזרים cytometry כך שהנתונים המתקבלים הוא אמין ולפרש . בסרטון הזה אנחנו מדגימים איך בשר טחון, לעכל, ולבודד את החלק היחסי של כלי הדם המועשר בתאי סטרומה החיסונית. כתוצאה מכך, אנו מראים כיצד מקרופאגים נוגדני התווית ולימפוציטים מסוג T וכיצד כראוי שער עליהם בניסויי cytometry זרימה. חלקות זרימת cytometry נציג מעכברים שמנים שאוכלים שומן רזים וגבוהים בשומן האכילו נמוכים מסופקות. אלמנט קריטי של ניתוח זה הוא השימוש בנוגדנים שעושיםלא לזרוח בערוצים שבו במקרופאגים הם autofluorescent אופן טבעי, כמו גם שימוש בפקדי פיצוי הולם.
Introduction
מבחינה היסטורית, רקמת השומן (AT) כבר נתפסה כאיבר אדיש של אחסון שומנים בדם, שמתרחב ומתכווץ בתגובה למאזן אנרגיה. כעת אנו מבינים כי AT מייצג איבר האנדוקרינית דינמי שמפריש באופן פעיל מספר ההורמונים, אשר משפיעים באופן ישיר התנהגות אכילה והומאוסטזיס הגלוקוז מערכתי. בנוסף, בעשור האחרון חלה עלייה הולכת וגובר לאוכלוסיות הרבות של תאים חיסוניים המתגוררות בכל חלק סטרומה וסקולרית (SVF), כמו גם את תרומתם ל-AT הומאוסטזיס.
היכולת להפריד בין AT adipocyte וSVF באמצעות לעכל collagenase אחריו צנטריפוגה ההפרש תואר לראשונה בשנת 1964 על ידי Rodbell 1. Collagenase השני משמש לרוב להפרדת adipocyte וSVF בשל תחזוקה של הקולטנים לאינסולין adipocyte 1. חלוקה במוקדם, האנזימטית של AT הייתה בעיקר מועסק ללמוד adipocyte חילוף חומרים וכדי לבודד preadipocytes. לאחרונה, בטכניקה זו, בשילוב עם הזמינות הנרחבת של cytometers הזרימה ומספר הגדל וההולך של נוגדני fluorophore-מצומדות זמינים מסחרי, יש להקל אפיון של AT תאים חיסוניים.
למרות נוכחותם של תאי מערכת חיסונית בדלקת שתוארה בעבר 2, את המסמכים על ידי הזרע וייסברג ואח'. ושו et al. פורסם בשנת 2003 היו הראשון לתעד את ההצטברות של AT מקרופאגים (כספומטים) בהשמנה יתר, אשר מפרישה ציטוקינים דלקתיים ולתאם עם תנגודת לאינסולין AT ספציפית ומערכתית 3,4. תצפיות אלה שימש כבסיס לשדה חדש של חקירה לאחרונה שטבע, "immunometabolism," 5 וכבר במעקב על ידי מחקרים לכך לאוכלוסיות תאי חיסון שונות, כוללים תאים דנדריטיים, תאי פיטום 6 7, 8 תאי T -10, 11, תאי B NKT תאים 12, 13, אאוזינופילים ונויטרופילים 14,15 בהתפתחות של תנגודת לאינסולין השמנת יתר קשור.
מטרת מאמר זה היא לספק תיאור מפורט של הטכניקה לעכל collagenase משמשת לבודד תאים של AT SVF ולאפיין כספומטים ו-AT תאי T באמצעות cytometry הזרימה. פרוטוקול זה כבר מותאם לעכבר ב, עם זאת, צופים יכולים ליהנות מקריאת מאמר מצוין המספק פירוט נרחב על אופטימיזציה של טכניקה זו לאדם בגיל 16. קהל היעד של מאמר זה כולל חוקרים בעלי ניסיון מוגבל בעבודה עם עכבר ובביצוע cytometry זרימה. כמה שיקולים מעשיים לאיזון תשואה סלולרית וכדאיות עם זמן ומשאבים מוצגים כמו גם בקרות cytometry זרימה אופטימליות לאפיון AT אוכלוסיות תאים חיסוניים. בנוסף לפרוטוקול שלנו, קוראים referrאד למאמר יופיטר לאחרונה על ידי Basu et al. לדיון מצוין של חלק מההיבטים הטכניים של cytometry זרימה לכוללים בקרות ופיצויים נאותות 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. חומרים כימיים ומתכלה
לפני שתתחיל בפרוטוקול הניסוי הזה, להכין את ריאגנטים הבאים:
- 70% אתנול
- 1X PBS
- 1X DPBS (ללא Ca וMg) בתוספת 0.5% BSA
- FACS חיץ: 1X DPBS (ללא Ca ומ"ג), 2 mM EDTA, ו -1% FCS
- חיץ ACK: Cl 150 מ"מ NH 4, 10 מ"מ 3 KHCO, ומ"מ Na 2 EDTA 0.1 במים
2. קצירת והכנה של רקמת שומן
- להרדים עכברים על פי נהלים שאושרו IACUC ספציפיים לכל מוסד.
- יסודיות להרטיב את הפרווה עם 70% אתנול.
- עושה חתך ברמה של תהליך xiphoid (חלק תחתון של עצם החזה) ולפתוח את חלל בית החזה כדי לחשוף את הלב, נזהר שלא לנתק את כל כלי דם גדולים.
הערה: בשלב זה, היא גם מועילה להשאיר את הדיאפרגמה שלמה ככל אפשר ולחתוך חריץ מהצד של כלוב הצלעות הימני כדי לאפשר לדם לזרום וperfusate מתוך חלל בית החזה.
- קליפ העלייה הימנית כדי לאפשר לדם וperfusate להימלט מערכת הדם.
שים לב: כאשר מתמודדים עם עכברים שמנים, קרום לב עודף בייתכן שיהיה הצורך להסיר על מנת לאפשר גישה אל הלב.
- לתפוס את הלב עם מלקחיים ובעדינות להכניס מחט לתוך החדר השמאלי דרך הקודקוד. לאט perfuse העכבר עם 15 מ"ל סטרילי PBS.
שימו לב: להפחית את שיעור זלוף אם הריאות מתחילות למלא ולהרחיב.
- פתח את חלל הצפק ולהסיר את רפידות שומן perigonadal באמצעות טיפול, כדי למנוע כל רקמות האשכים.
- הנח כריות שומן במשקל סירה על קרח המכיל 2 DPBS מ"ל 1X (ללא מ"ג או Ca) בתוספת 0.5% BSA, ובשר טחון AT לחתיכות דקות.
התחת = "jove_content"> הערה: הגבל את כמות AT לשוקלת סירה עד 1.2 גרם. אם הכמות של AT עולה על 1.2 גרם, לחלק אותו שווה בשווה בין שתי סירות שוקלות.
- לשמור על דגימות על קרח ולהכין לעכל פתרון מיליליטר collagenase 3 לכל מדגם AT בהיקף של 1X DPBS בתוספת 0.5% BSA, 10 מ"מ CaCl 2, ו -4 מ"ג / מיליליטר collagenase, מהסוג II.
3. עיכול collagenase
- העברה לצינורות חרוטי 50 מ"ל על ידי שפיכת homogenate ושטיפת סירה לשקול עם 1 DPBS מ"ל (0.5% BSA) ופתרון לעכל מיליליטר collagenase השני 3.
- לדגור על homogenate בייקר סיבובי (200 סל"ד) על 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- הוסף 10 מ"ל DPBS (0.5% BSA) לצינורות החרוטים ומניחים על קרח.
- Triturate homogenate פעמים רבות באמצעות פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל, ולהעביר השעיות תא דרך 100 מיקרומטר במסנן לצינור חדש 50 מיליליטר חרוטי.
- צנטריפוגה השעיה תא בXG 500 עבור 10 דקות ב 4 & Dלמשל, ג
- למזוג supernatant ו resuspend תא גלולה SVF במאגר ACK 3 מ"ל לlyse מזהמים אריתרוציטים.
- הוסף חיץ FACS מ"ל 12 והשעית תא צנטריפוגות ב XG 500 עבור 10 דקות ב 4 ° C.
- למזוג supernatant ו resuspend תא גלולה ב SVF חיץ FACS.
הערה: השתמש בגודל של התא גלולה כמדריך לכמה חיץ FACS לresuspend פנימה אם התא גלולה מכסה את החלק התחתון של צינור חרוטי 50 מ"ל, השתמש 0.5-1 חיץ FACS מ"ל, אחרת resuspend ב0.25-0.5 מ"ל.
- דגימות מניחים על קרח ולהכין aliquots דילול 1:10 של כל דגימה לספירת תאים על ידי ערבוב 40 μl חיץ FACS, פתרון כחול 50 μl trypan (0.2%), ו10 השעיה תא μl.
- ספירת תאי קיימא המבוסס על הרחקת trypan הכחולה ולדלל השעיות תא לריכוז סופי של x 05-10 אוקטובר 6 תאים / מ"ל.
4. צביעה של אנטיגנים תא שטח
הערה: כדוגמה, כאשר כימות שיעור הכספומטים המבוסס על פקדי FMO F4/80 וCD11b, הפיצוי הבא ויצטרך להיות מוכנים:
- מחולל (תאים)
- DAPI או יודיד propidium (PI) כתם בודד (תאים, לא להוסיף צבע כדאיות עד שלב 5.1)
- F4/80 APC (תאים או חרוזים פיצויים) כתם בודדים
- CD11b FITC תאים בודדים או כתם (חרוזים פיצויים)
- FMO 1 (תאים): + + CD11b FITC צבע כדאיות עכברוש IgG2a κ אלוטיפ השליטה APC (הוסיף בשלב 5.1)
- FMO 2 (תאים): F4/80 APC + עכברוש IgG2b κ אלוטיפ השליטה FITC + צבע כדאיות (הוסיף בשלב 5.1)
- הוסף נוגדנים fluorophore-מצומדות עיקריים ו / או פקדי אלוטיפ בריכוז המתאים (ראה טבלה של חומרים כימיים וחומרים).
- הגן על דגימות מאור ודגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- הוסף חיץ FACS מ"ל 2 והשעית תא צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.
- למזוג supernatant ו resuspend תא גלולה ב SVF 2 חיץ FACS מ"ל.
- צנטריפוגה XG תא ההשעיה 500 דקות 5 ב 4 ° C, ו resuspend תא גלולה ב SVF ≥ 400 חיץ FACS μl.
- העבר את הדגימות ל12 x 75 צינורות תחתית עגולות קלקר מ"מ מאובזר עם 35 סטרפלס מסננת תא מיקרומטר.
- להגן מפני אור, ודגימות חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד ניתוח FACS.
הערה: לקבלת תוצאות אופטימליות יש לנתח תאי immeadiately, עם זאת, ניתוח FACS עם פרוטוקול זה נערך בהצלחה על תאים שכותרתו מאוחסנים במאגר FACS ל1-2 שעות ב 4 ° C. אם תאים צריכים להיות קבועים כדי להגדיל את זמן אחסון, ניתן לתקן תאים שכותרתו עם paraformaldehyde 2% על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני ניתוח FACS. חברות נוגדנים מצביעות על כך שניתן לאחסן את תאי שכותרתו לתקופה של עד שבוע אחד, עם זאת, זה לא נבדק במסגרת הליך זה.
5. ניתוח FACS
- לפני ניתוח FACS, להוסיף צבע כדאיות לדגימות ובקרות מתאימות כדי לאפשר לאפליה תא חי / מת.
הערה: צבעי כדאיות רבים זמינים באופן מסחרי, אבל DAPI וPI מומלצים בהתאם לפרופ 'עירור / פליטהIles של נוגדני fluorophore-מצומדות בשימוש. DAPI ויודיד Propidium מתווספים לכל דגימה בריכוז סופי של 0.2 מ"ג / מ"ל.
- השתמש במדגם בלא כתם שלילי שליטה, רצוי תאים מבודדים מאותה הרקמה כמו דגימות ניסוי, כדי להתאים את פיזור צד (SSC) ופיזור קדימה (FSC), כך שאוכלוסיית התא (ים) של עניין הן בקנה מידה.
הערה: לניתוח של AT תאי SVF, מומלץ שSSC יוצג בקנה מידה לעומת יומן FSC בקנה מידה ליניארי. השימוש בקנה מידת יומן לSSC חשוב במיוחד בעת ניתוח כספומטים, שהן לעתים קרובות גדולות מאוד ופרטניות.
- צייר שער פיזור אור ראשוני המבוסס על הסוג של התא (ים) להיות מנותחים, ולהתאים את הצינור המכפיל (PMT), כך שעלייה בתאים בלא הכתם הם בקצה שמאלי של ההיסטוגרמה פרמטר יחיד (מרוכז כ ב -10 ב2) עבור הערוצים המתאימים. </ P>
הערה: מומלץ שלימפוציטים ומקרופגים (או תאי מיאלואידית אחרים) להיות מנותחים בנפרד בשל הבדלים בautofluorescence.
- שימוש בפקדים מוכתמים בודדים או חרוזים פיצויים ללכוד נוגדנים לבצע פיצוי צבע רב.
הערה: השימוש בחרוזי פיצויים מומלץ, עם זאת, התאימות של כל נוגדן חייבת להיות מובטחת. לדוגמה, חרוזים פיצוי עשויים שלא לחצות-מגיבים עם נוגדני ארנבות, במקרה שבו תאים מבודדים נדרשים להשיג שליטת כתם יחידה מתאימה.
- קבע שערים ניסיוניים המבוססים על פקדי FMO שונים.
- הגדר את cytometer הזרימה לאסוף את המספר המתאים של אירועים המבוססים על השכיחות של האוכלוסייה של עניין ולהקליט את נתוני ניסוי.
- קבצי נתונים FCS יצוא לניתוח מצב לא מקוון. ישנם מספר רב של תוכניות זמינות לcytometr הזרימהניתוח נתונים y. אנו ממליצים Cytobank, פלטפורמה מבוססת אינטרנט המאפשרת investigatores לאחסן ולנתח נתונים וליצור דמויות מכל מחשב עם גישה לאינטרנט 18. בנוסף, Cytobank מציע את היכולת לבצע ציבור נתונים נגיש או להגביל את הגישה למשתפי פעולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עיכול collagenase של AT אחריו צנטריפוגה ההפרש שימש לבודד את SVF מרפידות שומן epididymal של עכברים ממין זכר C57BL/6J האכיל שומן נמוך (10% מקלוריות שומן) או שומן גבוה (60% קלוריות משומנים) דיאטה (LFD וHFD , בהתאמה) במשך 16 שבועות. תאים של SVF אז תויגו עם נוגדנים ראשוניים fluorophore-מצומדות לכמת את שיעור הכספומטים קיימא (איור 1) ובתאי T (איור 2) באמצעות ניתוח FACS. gating הראשוני, כולל פיזור אור, אפליה כפיל, ושערים כדאיות מתואר באיורים 1 א 'ו2A. יודגש, כי שער פיזור האור הראשוני באיור 2 א מוגבל לאוכלוסיית הלימפוציטים על מנת למנוע כולל תאי מיאלואידית autofluorescent. דוגמה לשימוש בעדכון FMO שולטת להגדיר שערי ניסוי מתואר באיור 1. בדוגמה זו, F4/80 (עמודה שמאלית) וCD11b (עמודה ימנית) נוגדנים מוחלפים עם פקדי אלוטיפ מתאימים לחשבון לכריכת autofluorescence ואינם ספציפית. שערים ברבע לאחר מכן נמשכים לזהות קיימא כספומטים (F4/80 + CD11b +). Gating לCD4 + וCD8 + בתאי T שמוצג באיור 2. קיימא בימפוציטים הם מגודרים ראשון לTCRβ (עמודה שמאלית). כתוצאה מכך, תאי TCRβ + AT T הם מגודרים לCD4 ו CD8 (עמודה ימנית).
איור 1. מקרופאגים רקמת שומן. SVF היה מבודד מepididymal AT של עכברים ממין זכר C57BL/6J קבלו תזונה שומן גבוהה או נמוכה במשך 16 שבועות באמצעות collagenase לעכל הפרוטוקול. Subseבעקבות זאת, תאי SVF היו מוכתמים לF4/80 וCD11b וניתוח FACS בוצע באמצעות cytometer זרימה לזהות כספומטים. () פיזור אור ראשוני ושערים כדאיות. (ב) שינוי FMO שולט שילוב נוגדני אלוטיפ לF4/80 וCD11b שמשו כדי ליישר הרבע שערים. (ג) השוואה בין שיעור F4/80 + + CD11b כספומטים בכתובת של עכברים שהוזן שומן גבוה והנמוכים. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. תאי T רקמת שומן. SVF היה מבודד מרקמת השומן של עכברי epididymal C57BL/6J זכר האכילו דל שומן או דיאטה דלת שומן גבוהה במשך 16 שבועות באמצעות tהוא collagenase לעכל פרוטוקול. כתוצאה מכך, תאי SVF היו מוכתמים לTCRβ, CD4, וCD8a וניתוח FACS בוצעו באמצעות cytometer זרימה לאפיין AT תאי T. () פיזור אור ראשוני ושערים כדאיות. (BC) השוואה של שיעור TCRβ + T תאים (עמודה שמאלית) ושל CD4 + ו CD8 + T תאים (עמודה ימנית) מ-AT של (B) ודל שומן (C) עכברים שהוזן שומן גבוה. לחץ כאן ל להציג דמות גדולה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
עניין גובר בתפקידה של המערכת החיסונית בהשלכות מטבוליות של השמנה הוביל לשימוש הנרחב בזרימת cytometry לאפיין תאים חיסוניים של AT. אף על פי הפרוטוקול המדויק ישתנה בין מעבדות המבוססות על הניסיון שלהם וציוד זמין, כוללים את השלבים הקריטיים עיכול collagenase, צנטריפוגה ההפרש, וסימון אנטיגן פני תא. מטרתו של המאמר הנוכחי היא לספק לפרוטוקול מפורט ומדריך מעשי לבידודה של AT SVF לחוקרים בעלי ניסיון מוגבל בעבודה עם AT ו / או ביצוע cytometry זרימה.
כמו בכל טכניקה ניסיונית, יש וריאציות רבות שעשויים או לא עשויים להשפיע על תוצאה הרצויה באופן משמעותי. בהתבסס על הניסיון שלנו, במסמך זה מפורט בפרוטוקול מייצג את האיזון יעיל ביותר בין הזמן, משאבים, תשואה סלולרית, וכדאיויות תא. לדוגמה, מצאנו כי הגדלתיש משך זמן של עיכול collagenase השני לעד 60 דקות בריכוזים דומים של collagenase השפעה זניחה על תשואה סלולרית, ולכן, אנו מנצלים עיכול דקות 20 על מנת לצמצם את משך חשיפת collagenase. Collagenase השני הוא collagenase הנפוץ ביותר עבור digestions רקמת השומן. ניתן למצוא תיאור של כל collagenases השונים והשימושים העיקריים שלהם באתר האינטרנט של סיגמא. תשואות סלולריות טיפוסיות מהפרוטוקול לעיל הן 2-3 x 10 6 ו4-5 x 10 6 תאים / G מעכברים שהוזן בשומן נמוך (10% קלוריות משומנים) ושומן גבוה (60% מקלוריות שומן) לדיאטה 16 שבועות, בהתאמה. בנוסף למשתנה פעמים לעכל collagenase, יש מספר השינויים הפוטנציאליים לפרוטוקול הנוכחי בהתאם לדגם הניסיוני בשימוש, כולל טיפול תזונתי. ראשית, כאשר קצירת AT מעכברים שהוזנו בדיאטה מועשרת לחומצות שומן רוויים או כולסטרול, להימנע משמירה על הדגימות על קרח לפני מיותרות משוםT יהיה לגבש ולהפוך קשים מיותר. שנית, הפרוטוקול שלנו כולל צעד תמוגה כדורית אדומה (3.6), עם זאת, זלוף ראשוני מוצלח לעתים קרובות עושה את הצעד הזה מיותר. יש לקחת שלישית, טיפול שלא להוסיף יותר מ 10 מ"מ CaCl 2 לפתרון לעכל collagenase (ריכוז סופי 5 מ"מ); ריכוזי סידן גדולים יותר עלולים לגרום להיווצרות של משקע סידן פוספט. אם משקע זה יוצר בעקבות הצעד הראשוני צנטריפוגה (3.5), להוסיף שני שלבי כביסה עם 20 מ"ל FACS חיץ (המכיל EDTA) שקדמו לצעד תמוגה הכדורית האדומה כדי להסיר את המשקע. רביעית, אנו ממליצים לחוקרים להשתמש בכרית שומן perigonadal כל אחד לפחות, כאשר בידוד SVF. אנחנו עושים המלצה זו לא בגלל מגבלות בתשואה סלולרית, אלא משום שאוכלוסיות תאים שונות להציג חלוקות אזוריות שונות 19. לפיכך, תוצאות עלולות להיות מוטות, כאשר רק בחלק של כרית שומן perigonadal הואאד לבודד תאים חיסוניים המתגוררים בAT. אם כרית שומן כולו היא גדולה יותר מאשר 1.2 גרם, לחלק את רקמת שומן longitudinally מהמקורי לקצות זנב. אם נחלק לשתיים בדרך זו, כל מחצית צריכה לספק אוכלוסייה מייצג של תאים ובדרך כלל צריכה להיות פחות מ 1.2 גרם. עם זאת, במקרה שזה עדיין יותר מ 1.2 גרם, אנו ממליצים לבצע digestions collagenase של 1.2 מגזרים גרם בצינורות נפרדים, ולאחר מכן משלבים את כל תאי SVF לcytometry הזרימה. בנוסף, לעכברים רזים, ייתכן שיהיה צורך לשלב רפידות שומן מעכברים 2 או 3 כדי להשיג תאי SVF מספיק לניתוח תזרים cytometric. הצורך בעכברים נוספים צריך להיות מטופלת בעת תכנון ניסויים. לבסוף, דרך נוספת להציג את הנתונים היא מספר התאים לגרם של רקמה. אם צפיפות תאים רצויה, יש לשקול את AT לפני הריסוק ומערכת עיכול.
בכל הקשור לאפיון תאי AT SVF באמצעות cytometry הזרימה, שתייםנקודות יודגש. ראשית, כל הנוגדנים הראשוניים fluorophore-מצומדות צריכים להיות תוקף לשימוש עם AT תאי SVF וטיטרציה כמו שצריך. למרות שאנחנו הפגנו פיצוי עם חרוזים, היינו לנו בעבר טיטרציה נוגדנים אלה עם AT SVF. כאשר אפיון מקרופאגים, אנו ממליצים על השימוש בצבעי טנדם (למשל PE-Cy7), כפי שהיו לנו תוצאות מעורבות ביחס למחייב הלא ספציפי של כספומטים בעת שימוש בנוגדנים מצומדות לצבעים אלה. בנוסף, fluorophores כגון PE וFITC יש להשתמש רק לאחר טיטרציה זהירה כפי שתואר לעיל. ניתן למצוא רשימה של נוגדנים ספציפיים שמשמשים בדרך כלל לאפיון תאי AT SVF יחד עם ריכוזים מומלצים בספקה בטבלת 1. שנית, משום שautofluorescence חזק תערוכת הכספומטים ומספר הנוגדנים להציג רמה נמוכה של הלא ספציפי מחייב כאשר משתמשים בו בריכוז גבוה, אנו ממליצים על השימוש בעדכון FMO שולט להגדיר שערים ניסיוניים.פקדי FMO מופקים על ידי מכתים קבוצה של דגימות בקרה עם כל אבל אחד מהנוגדנים המשמשים לתייג דגימות ניסוי 20. יש לנו שונה בפקדי FMO בפרוטוקול שלנו כדי להחליף את אחד מהנוגדנים עם שליטת אלוטיפ fluorophore מצומדות מתאימה ולא רק הסרתו. בפועל, זה עשוי להיות מקובל לוותר על פקדי FMO לנוגדנים המספקים הפרדה בין אוכלוסיות חריגות חיוביות ושליליות. בנוסף לבקרות אלה, תוכל לציין כי לפני gating על הנוגדנים, אנו מיון קפדני לאוכלוסיות לימפוציטים ומקרופאג מבוסס על פיזור קדימה וצד. זה יהיה לבטל את זיהוי של מקרופאגים autofluorescent בעת ניתוח אוכלוסיות לימפוציטים עם fluorophores כגון FITC וצבעי טנדם.
למרות שפרוטוקולים מפורטים הם מעבר להיקף של מאמר זה, טכניקת הבידוד תאר משמשת כצעד ראשון חשוב לטכניקות רבות שמטרתם מאפייניםterizing תאים חיסוניים המתגוררים בAT. לדוגמה, ניתן להשתמש בבידוד לעיל ופרוטוקול מכתים כדי להקל על מיון של אוכלוסיות ספציפיות שממנו יכול להיות מבודד mRNA לנתח ביטוי גנים. בנוסף, שינויים פשוטים בפרוטוקול יכולים להתבצע כדי לאפשר טיפול vivo לשעבר של כספומטים. שינויים אלו יכללו שימוש בטכניקות סטריליות להשיג SVF, אשר יהיה שטף לאחר מכן פעמיים וresuspended בתרבות תקשורת סלולרי המתאימה. במקום להוסיף נוגדני fluorophore-מצומדות להכתים פני שטח אנטיגנים תא, SVF ניתן להוסיף לצלחות תרבית רקמה שאינן מטופלים להעשרה לכספומטים באמצעות דבקות פלסטיק (אם כי זה לא יכול להיות טען להיות טהור אוכלוסייה כfibroblasts וpreadipocytes יכול גם לדבוק ). המטרה זו מושגת על ידי culturing SVF במשך 2-4 שעות על 37 מעלות צלזיוס ואחריו שני שלבי כביסה כדי להסיר תאים שאינם חסיד. ניתן לטפל בכספומטים אז בהתאם, ונקטפו באמצעות ניתוק תא מבוסס EDTA כךlution לcytometry זרימה או lysed בTrizol או Ripa חיץ לבידודה של RNA או חלבון, בהתאמה. ללא תלות ביישום במורד הזרם, טכניקת collagenase לעכל לבידוד adipocytes ותאי SVF שתואר לראשונה על ידי Rodbell בשנת 1964 1 ממשיכה להיות כלי רב ערך עבור האפיון של AT תאים חיסוניים ותרומתם לתוצאות מטבוליות של השמנת יתר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לנו מה למסור.
Acknowledgments
התזמורת סימפונית נתמכת על ידי NIH רות ל 'Kirschstein NRSA (F32 DK091040), AK נתמך על ידי מלגת דוקטורים מהאגודה האמריקנית לסוכרת (7-10-MI-05), והוא נתמך על ידי אהה פרס איגוד לב אמריקאי הוקם חוקר (12EIA8270000). ניסויי cytometry זרימה בוצעו במשאבים משותפים Cytometry זרימת VMC. משאבי cytometry זרימת VMC משותפים נתמך על ידי המרכז לחקר מחלות העיכול ונדרבילט (DK058404).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents. |
|||
References
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
- Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
- Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
- Mathis, D., Shoelson, S. E.
- Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
- Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
- Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
- Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).
- Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
- Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
- Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).
