Summary
Жировая ткань (AT) является объектом интенсивных активации иммунной клетки и взаимодействия. Почти все клетки иммунной системы, которые присутствуют в AT и их отношения меняются от ожирения. Правильная изоляция, количественное определение и характеристика AT иммунные клеточные популяции имеют решающее значение для понимания их роли в immunometabolic заболевания.
Abstract
Открытие увеличился инфильтрации макрофагов в жировой ткани (AT), страдающих ожирением грызунов и человека привело к усилению интереса к иммунной клетке вклад местных и системных резистентность к инсулину. Выделение и количественная оценка различных иммунных клеточных популяций в худых и тучных AT сейчас обычно используются в технике immunometabolism лабораториях, однако особую осторожность должны быть приняты как в стромальных сосудистой изоляторе и в анализе проточной цитометрии, так что полученные данные надежно и интерпретируемых . В этом видео мы покажем, как фарш, переварить, и изолировать иммунных клеток обогащенного стромальных сосудистой фракции. Впоследствии мы покажем, как антитела этикетке макрофагов и Т-лимфоцитов, и как правильно на них ворота в экспериментах проточной цитометрии. Представитель проточной цитометрии участков из низким содержанием жира и мяса и кормили с высоким содержанием жиров кормили мышей ожирением предоставляются. Важнейшим элементом этого анализа является использование антител, которые делаютне флуоресцирует в каналы, где AT макрофаги естественно аутофлуоресцентной, а также использование надлежащего контроля компенсации.
Introduction
Исторически сложилось, что жировая ткань (AT), рассматривается в качестве инертного орган накопления липидов, который расширяется и сжимается в зависимости от энергетического баланса. Теперь мы понимаем, что AT представляет собой динамическое эндокринный орган, активно выделяет ряд гормонов, которые непосредственно влияют на пищевое поведение и системного гомеостаза глюкозы. Кроме того, в течение последнего десятилетия наблюдается увеличение признательность за многочисленные популяции иммунных клеток, проживающих в AT стромальных сосудистой фракции (НВФ), а также их вклад в AT гомеостаза.
Возможность отделить AT адипоцитов и СФДВ использованием коллагеназы дайджест последующим дифференциальным центрифугированием был впервые описан в 1964 году Родбелл 1. Коллагеназа II чаще всего используется для адипоцитов и SVF разделения за счет поддержания адипоцитов рецепторы инсулина 1. Уже на раннем этапе ферментативного фракционирования AT в основном используются для изучения ADIPOцит метаболизма и изолировать преадипоцитов. Совсем недавно, этот метод, в сочетании с широкой доступности потока цитометрах и постоянно растущего количества коммерчески доступных флуорофором антителами, способствовала характеристика AT иммунных клеток.
Хотя присутствие иммунных клеток в воспаленных AT было описано ранее 2, семенных работ Weisberg соавт. Сюй и др.. опубликованной в 2003 г. первым документом накопления AT макрофагов (ATM) в ожирение, которые секретируют цитокины и коррелируют с AT-специфический и системной инсулинорезистентности 3,4. Эти наблюдения послужили основой новой области исследования недавно придумали, "immunometabolism", 5 и были последовать исследования причастности различных иммунных клеточных популяций, в том числе 6 дендритных клеток, тучных клеток 7, 8 Т-клетки -10, В-клетки 11, 12 NKT клетки, эозинофилы 13, 14,15 и нейтрофилов в развитии ожирения связана резистентность к инсулину.
Цель этой статьи заключается в предоставлении подробное описание техники коллагеназе дайджест использованы для выделения клетками AT SVF и охарактеризовать атм и Т-клеток с помощью проточной цитометрии. Этот протокол был оптимизирован для мыши AT, однако зрители могут извлечь пользу из чтения отличную статью, предусматривающую подробностях по оптимизации этой техники для человека в 16 лет. Целевая аудитория этой статьи содержится следователей с ограниченным опытом работы с мышью и выполнение проточной цитометрии. Несколько практических соображений для балансировки сотовой урожайности и жизнеспособности со временем и ресурсами представлены, а также оптимальных управлений проточной цитометрии для характеристики AT иммунных клеточных популяций. В дополнение к нашему протоколу, читатели referrED В недавней статье на Юпитер Басу и др.. для отличной обсуждение некоторых технических аспектов проточной цитометрии включить надлежащего контроля и компенсаций 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Реактивов и расходных материалов
До начала этого экспериментального протокола, подготовить следующие реагенты:
- 70%-ном этаноле
- 1X PBS
- 1X DPBS (без Са и Mg) с добавлением 0,5% BSA
- FACS буфера: 1х DPBS (без кальция и магния), 2 мМ ЭДТА и 1% FCS
- ACK буфер: 150 мМ NH 4 Cl, 10 мМ КНСО3, и 0,1 мМ Na 2 ЭДТА в воде
2. Сбор и подготовка жировой ткани
- Усыпить мышей в соответствии с IACUC утвержденные процедуры, характерные для каждого учреждения.
- Тщательно намочите меха с 70% этанола.
- Сделайте надрез на уровне мечевидного отростка (нижняя часть грудины) и откройте грудную полость, чтобы открыть сердце, стараясь не разорвать любые крупные кровеносные сосуды.
Примечание: На данный момент, это также полезно, чтобы оставить мембраны нетронутым каквозможно, и сократить паз из правой стороны грудной клетки, чтобы позволить крови и перфузату вытекать из грудной полости.
- Клип правое предсердие, чтобы позволить крови и перфузат избежать кровеносной системы.
Примечание: При работе с тучных мышей, избыток перикарда AT возможно, должны быть удалены, чтобы разрешить доступ к сердцу.
- Возьмитесь за сердце пинцетом и аккуратно вставьте иглу в левый желудочек через вершину. Медленно заливать мышь с 15 мл стерильного PBS.
Обратите внимание: Снизить коэффициент перфузии если легкие начинают заполнять и расширяться.
- Откройте брюшную полость и удалить жировые отложения perigonadal использованием осторожность, чтобы избежать любых половых тканей.
- Наведите жировых отложений на вес лодки на льду, содержащую 2 мл 1X DPBS (без Mg или Са) с добавлением 0,5% BSA, и фарш AT на мелкие кусочки.
Примечание: предельная сумма AT за лодкой весят до 1,2 г. Если количество AT превышает 1,2 г, разделить его поровну между двумя весят лодки.
- Хранить при образцы на льду и подготовить 3 мл коллагеназы дайджест раствора на AT образец, состоящий из 1X DPBS с добавлением 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 10 мМ CaCl 2 и 4 мг / мл коллагеназы типа II.
3. Коллагеназой
- Передача AT до 50 мл конические пробирки путем выливания гомогената и промывка весят лодке с 1 DPBS мл (0,5% BSA) и 3 мл коллагеназы II дайджест решение.
- Инкубируют при гомогената в ротационном шейкере (200 оборотов в минуту) при 37 ° С в течение 20 мин.
- Добавить 10 мл DPBS (0,5% BSA) в конические пробирки и место на льду.
- Растирают гомогенат много раз с использованием 10 мл серологические пипетки, и передать через клеточные суспензии 100 мкм фильтр в новый 50 мл коническую трубку.
- Центрифуга клеточной суспензии при 500 мкг в течение 10 мин при 4 & Dнапример, C.
- Слейте супернатант и ресуспендируют SVF осадок клеток в 3 мл ACK буфера для лизиса загрязняющих эритроцитов.
- Добавить 12 мл FACS буфера и подвески центрифуги клетки при 500 мкг в течение 10 мин при 4 ° C.
- Слейте супернатант и ресуспендируют SVF осадок клеток в буфере FACS.
Примечание: Используйте размер осадок клеток в качестве руководства для сколько FACS буфера для ресуспендирования дюйма Если осадок клеток охватывает нижнюю часть 50 мл коническую трубку, использовать 0,5-1 мл FACS буфера, в противном случае, ресуспендируют в 0,25-0,5 мл.
- Место образцы на льду и подготовить 1:10 разбавление аликвоты каждого образца для подсчета клеток путем смешивания 40 мкл FACS буфера, 50 мкл раствора трипанового синего (0,2%) и 10 мкл суспензии клеток.
- Граф жизнеспособных клеток на основе исключения трипанового синего и разбавленной суспензии клеток в конечной концентрации 5-10 × 10 6 клеток / мл.
4. Окрашивание клеточных поверхностных антигенов
Примечание: В качестве примера, когда количественное соотношение банкоматов на основе F4/80 и CD11b, следующие компенсации и предприятия управления должны быть подготовлены:
- Необработанный (ячеек)
- DAPI или пропидий йодида (PI) одно пятно (клетки, никогда не добавляйте краситель жизнеспособность до шага 5.1)
- F4/80 APC одного пятна (ячейки или компенсации бисера)
- CD11b FITC одно пятно (клетки иликомпенсации бисера)
- Предприятию 1 (ячеек): Крыса IgG2a κ изотипом управления APC + CD11b FITC + жизнеспособность красителя (добавлено на шаге 5.1)
- Предприятию 2 (клеток): F4/80 APC + Крыса IgG2b κ изотипический контроль FITC + жизнеспособность красителя (добавлено на шаге 5.1)
- Добавить флуорофора конъюгированных первичных антител и / или изотипа управления в соответствующей концентрации (см. таблицу реагентов и материалов).
- Защитить образцы от света и инкубировали при 4 ° С в течение 30 мин.
- Добавить 2 мл FACS буфера и подвески центрифуги клетки при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° C.
- Слейте супернатант и ресуспендируют SVF осадок клеток в 2 мл буфера FACS.
- Центрифуга клеточной суспензии 500 х г в течение 5 мин при 4 ° С, и ресуспендируют СФДВ осадок клеток в ≥ 400 мкл буфера FACS.
- Передача образцов до 12 х 75 мм полистирола с круглым дном трубках, оборудованных 35 мкм ячейки фильтра вершины трубы.
- Не Беречь от света, и хранить образцы при 4 ° С до анализа FACS.
Примечание: Для достижения оптимальных результатов клетки должны быть проанализированы immeadiately, однако FACS-анализ с этим протоколом был успешно проведен меченых клеток сохраняется в буфере FACS в течение 1-2 часов при 4 ° С. Если клетки должны быть установлены для увеличения срока хранения, меченые клетки могут быть исправлены с 2% параформальдегида при 4 ° С в течение 24 ч до анализа FACS. Антитело компании предполагают, что меченые клетки можно хранить в течение одной недели, однако это не была испытана в контексте этой процедуры.
5. Анализ FACS
- Перед анализом FACS, добавьте краситель жизнеспособности образцов и соответствующие управления, чтобы обеспечить Live / Dead Cell дискриминации.
Примечание: многочисленные красители жизнеспособности имеются в продаже, но и PI DAPI рекомендуются в зависимости от возбуждения / испускания профИлес из флуорофора конъюгированных антител используется. DAPI и пропидия иодида для каждого образца при конечной концентрации 0,2 мг / мл.
- Использование неокрашенных отрицательного контрольного образца, предпочтительно клетки, выделенные из той же ткани, как экспериментальные образцы, для регулировки бокового рассеяния (SSC) и прямого рассеяния (FSC), так что популяция клеток (ы), представляющие интерес находятся на шкале.
Примечание: Для анализа AT SVF клетки, рекомендуется SSC быть отображены в логарифмической шкале по сравнению с FSC в линейном масштабе. Использование логарифмической шкалы для SSC особенно важно при анализе банкоматов, которые часто являются очень большими и зернистая.
- Нарисовать начальный ворота рассеивать свет на основе типа клеток (ы) анализируются, и отрегулировать фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) коэффициент усиления таким образом, что неокрашенные клетки находятся на крайней левой части одного параметра гистограмма (примерно по центру 10 +2) для соответствующих каналов. </ Li>
Примечание: Рекомендуется, чтобы лимфоциты и макрофаги (или других клеток миелоидного) быть проанализированы отдельно из-за различий в аутофлюоресценция.
- Используйте одинарные окрашенных управления или антитела бисера захвата возмещения выполнять многоцветные компенсации.
Примечание: Использование компенсации бусы рекомендуется, однако совместимость каждого антитела должны быть обеспечены. Например, компенсация шариков не может перекрестную реакцию с кроличьими антителами, в этом случае изолированных клеток, необходимых для получения соответствующего одного пятна управления.
- Установить экспериментальные ворота на основе модифицированного управления предприятием.
- Установите проточной цитометрии для сбора соответствующего количества событий на основе распространенности население интерес и записи экспериментальных данных.
- Экспорт данным ФТС файлы для автономного анализа. Есть множество программ, доступных для потока cytometrY анализа данных. Мы рекомендуем Cytobank, веб-платформа, которая позволяет investigatores для хранения и анализа данных и создания цифры с любого компьютера с доступом в Интернет 18. Кроме того, Cytobank дает возможность сделать данные доступными общественности или ограничить доступ к коллаборационистов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Коллагеназой АТ с последующим дифференциальным центрифугированием, используемый для изоляции СФДВ из придатка жировой ткани самцов мышей C57BL/6J подается с низким содержанием жира (10% ккал за счет жира) или с высоким содержанием жиров (60% ккал за счет жира) диету (ЛФД и HFD соответственно) в течение 16 недель. Клетки СФДВ затем были помечены флуорофора конъюгированных первичных антител для количественного определения долю жизнеспособных банкоматы (рис. 1) и АТ Т-клетки (рис. 2) с помощью анализа FACS. Начальная Память, включая рассеяние света, двойной дискриминации, и жизнеспособность ворота изображены на рисунках 1А и 2А. Следует подчеркнуть, что начальное ворота рассеивать свет на фиг.2А ограничивается популяции лимфоцитов во избежание включая аутофлуоресцентной миелоидные клетки. Пример использования модифицированных Предприятию управления для задания экспериментальных ворот изображен на рисунке 1b. В этом примере F4/80 (левая колонка) и CD11b (правая колонка) антитела заменены соответствующими изотипические контроли для учета аутофлюоресценция и неспецифическое связывание. Квадрант ворота затем вытягивают определить жизнеспособные банкоматов (F4/80 CD11b + +). Память для CD4 + и CD8 + Т-клеток, В показан на фиг.2В. Жизнеспособными на лимфоциты первого закрытого для TCRβ (левая колонка). Впоследствии TCRβ AT + Т-клетки закрытого для CD4 и CD8 (правая колонка).
Рисунок 1. Жировой ткани макрофагами. СФДВ был выделен из придатка AT самцов мышей C57BL/6J подается с низким содержанием жира или высоким содержанием жиров в течение 16 недель использованием коллагеназы дайджест протокола. ПоследоСледовательно, СФДВ клетки окрашивали в течение F4/80 и CD11b и FACS-анализ проводили с использованием проточного цитометра идентифицировать банкоматов. (A) Начальная рассеивают свет и жизнеспособность воротами. (B), модифицированная предприятие контролирует включение изотипом антител для F4/80 CD11b и были использованы для выравнивания квадранте воротами. (C) Сравнение доли F4/80 CD11b + + банкоматов от AT с низким содержанием жира и высоким содержанием жира мышей, которых кормили. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Жировая ткань Т-клеток. СФДВ был выделен из придатка жировой ткани самцов мышей C57BL/6J подается с низким содержанием жира или высоким содержанием жиров в течение 16 недель с использованием третОн коллагеназе дайджест протокола. Впоследствии СФДВ клетки окрашивали в течение TCRβ, CD4, и CD8a и FACS-анализ проводили с использованием проточного цитометра, чтобы охарактеризовать AT Т-клеток. (A) Начальная рассеивают свет и жизнеспособность воротами. (BC) Сравнение доли TCRβ + Т-клеток (левая колонка) и CD4 + и CD8 + Т-клетки (правая колонка) из AT (В) низкое содержание жиров и (C) с высоким содержанием жира мышей, которых кормили. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Растущий интерес к роли иммунной системы в метаболических последствий ожирения привело к широкому использованию проточной цитометрии, чтобы охарактеризовать иммунные клетки АТ. Хотя точный протокол будет варьироваться между лабораториями на основе их собственного опыта и имеющегося оборудования, критические шаги включают коллагеназой, дифференциального центрифугирования и клеточных поверхностных антигенов маркировки. Целью настоящей статьи является предоставление подробного протокола и практического руководства для выделения AT SVF следователям с ограниченным опытом работы с AT и / или выполнение проточной цитометрии.
Как и в любой экспериментальной техники, существует множество вариаций, которые могут или не могут существенно повлиять на желаемый результат. Основываясь на нашем опыте, протокол подробно описано здесь представляет собой наиболее эффективный компромисс между временем, ресурсами, сотовая выхода и жизнеспособности клеток. Например, мы обнаружили, что увеличениеПродолжительность пищеварение коллагеназы II на целых 60 мин при аналогичных концентраций коллагеназы оказывает незначительное воздействие на клеточный выход, таким образом, мы используем 20 мин пищеварения для того, чтобы уменьшить длину коллагеназы экспозиции. Коллагеназы II является наиболее часто используемым коллагеназы для переваривания жировой ткани. Описание всех различных коллагеназы и их основных применений можно найти на веб-сайте Сигмы. Типичные сотовой урожайность выше протокола в 2-3 х 10 6 и 4-5 х 10 6 клеток / г при температуре от мышей, которых кормили с низким содержанием жира (10% ккал за счет жира) и высоким содержанием жиров (60% ккал за счет жира) диета для 16 недель соответственно. В дополнение к различным коллагеназы дайджест раз, существует несколько потенциальных изменений в текущий протокол в зависимости от экспериментальной модели используется, в том числе диетического лечения. Во-первых, при уборке AT от мышей, получавших диету, обогащенную холестерина или насыщенных жирных кислот, во избежание выдержки образцов на льду до измельчения, посколькуT укрепить и сделать мясорубки трудно. Во-вторых, наши протокол включает в себя этап лизиса эритроцитов (3.6), однако успешной начальной перфузии часто делает этот шаг нужно. В-третьих, необходимо соблюдать осторожность, чтобы не добавлять более 10 мМ CaCl 2 в раствор коллагеназы дайджест (5 мМ конечной концентрации), более высокие концентрации кальция может привести к образованию осадка фосфата кальция. Если этот осадок образуется после начальной стадии центрифугирования (3.5), добавьте две стадии промывки 20 мл FACS буфера (содержащего EDTA) до лизиса эритроцитов шагом, чтобы удалить осадок. В-четвертых, мы рекомендуем, чтобы исследователи используют по крайней мере один полный perigonadal жировой ткани при выделении SVF. Мы делаем эту рекомендацию не из-за ограничений в сотовых выход, но из-за различных клеточных популяций отображения различных региональных распределений 19. Таким образом, результаты могут быть неточными, когда только часть perigonadal жировой ткани намиЭд выделить иммунные клетки, проживающих в AT. Если весь жировой ткани больше, чем 1,2 грамма, разделите жировой ткани в продольном направлении от ростральнее каудального концов. Если разделена пополам таким образом, каждая половина должна обеспечивать представитель популяции клеток, и как правило, должны быть не менее 1,2 грамма. Тем не менее, в случае, если это еще более 1,2 грамма, рекомендуется выполнить коллагеназы пищеварения 1,2 г сегменты в отдельные пробирки, а затем объединив все СФДВ клеток для проточной цитометрии. Кроме того, для постного мышей, это может быть необходимо объединить жировых отложений с 2 или 3 мышей, чтобы получить достаточное количество клеток СФДВ для анализа методом проточной цитометрии. Потребность в дополнительных мышей должны учитываться при проектировании экспериментов. Наконец, еще один способ отображения данных, число клеток на грамм ткани. Если плотность клеток желательно, AT следует взвешиваться до измельчения и пищеварения.
В отношении характеризующие AT СФДВ клеток с помощью проточной цитометрии, двапунктов следует подчеркнуть. Во-первых, все флуорофором конъюгированных первичные антитела должны быть утверждены для использования с AT SVF клетки и правильно титрование. Хотя мы продемонстрировали компенсации бисером, мы ранее титрование этих антител с AT SVF. Характеризуя макрофаги, мы не рекомендуем использование тандема красители (например, PE-Cy7), как мы уже были смешанные результаты в отношении неспецифическое связывание банкоматов при использовании антител, конъюгированных с этими красителями. Кроме того, флуорофорам таких как ПЭ и FITC следует использовать только после тщательного титрования, как описано выше. Перечень специфических антител, которые мы обычно используется для описания AT СФДВ клетки наряду с рекомендуемыми концентрации могут быть найдены в приведены в таблице 1. Во-вторых, потому, что банкоматы проявляют сильную аутофлюоресценция и количество антител отображения низкий уровень неспецифического связывания при использовании при высокой концентрации, мы рекомендуем использование модифицированных предприятие контролирует установить экспериментальным воротами.Предприятие управления генерируются путем окрашивания набора контрольных образцов с все, кроме одного из антител используется для обозначения экспериментальных образцов 20. Мы модифицировали Предприятию управления в нашем протоколе, чтобы заменить одно из антител с соответствующим флуорофором конъюгированных изотипом управления, а не просто удалить его. На практике это может быть приемлемо отказаться Предприятию управления для антител, которые обеспечивают исключительное разделение между положительными и отрицательными населения. Помимо этих элементов управления отметим, что до стробирования на антитела, мы предварительного выбора для лимфоцитов и макрофагов популяций на основе прямой и боковой разброс. Это позволит избежать обнаружения аутофлуоресцентной макрофагов при анализе популяций лимфоцитов флуорофорами таких как FITC и тандема красителей.
Хотя подробные протоколы выходят за рамки данной статьи, методики, описанной изоляции служит важным первым шагом для многочисленных методов, направленных на характерхарактеризующего иммунных клеток, проживающих в AT. Например, указанное изоляция и окрашивание протокол может быть использован для облегчения сортировки конкретных групп, из которых мРНК может быть выделена для анализа экспрессии генов. Кроме того, простой модификации протокола могут быть сделаны, чтобы позволить бывший обработки естественных банкоматов. Такие модификации будут включать использование стерильных методов для получения СФДВ, которые будут затем дважды промывают и повторно суспендируют в соответствующей среде клеточной культуры. Вместо добавления флуорофора конъюгированных антител для окрашивания антигенов клеточной поверхности, СФДВ могут быть добавлены к необработанной пластины для культуры ткани для обогащения банкоматы посредством пластиковых соблюдение (хотя это не может быть востребовано быть чистой популяции как фибробласты и преадипоцитов также может прилипать ). Это достигается путем культивирования СФДВ в течение 2-4 ч при 37 ° С с последующим две стадии промывки для удаления не прилипшие клетки. Банкоматы можно затем обработать соответствующим образом и собирали с использованием ЭДТА на основе диссоциации клеток такрешением для проточной цитометрии или лизируют в Trizol или RIPA буфере для выделения РНК или белка, соответственно. Независимо от того, ниже по течению приложений, техника коллагеназе дайджест выделения адипоцитов и SVF клетки впервые описан в 1964 году Родбелл 1 продолжает оставаться бесценным инструментом для характеристики AT иммунных клеток и их вклад в метаболические последствия ожирения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
JSO поддерживается NIH Рут Л. Kirschstein NRSA (F32 DK091040), А. К. поддерживается Докторантура стипендий от Американской Диабетической Ассоциации (7-10-МИ-05), а АНН поддерживается Американской кардиологической ассоциации, созданной Награда Исследователя (12EIA8270000). Эксперименты проточной цитометрии проводили в проточной цитометрии VMC общему ресурсу. VMC проточной цитометрии общий ресурс поддерживается пищеварительной Вандербильта Болезнь научно-исследовательский центр (DK058404).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (no Ca or Mg) 10 x 500 ml | Life Technologies | 14190-250 | |
| DAPI | Life Technologies | D3571 | |
| BSA | Sigma | A2153-100G | |
| collagenase | Sigma | C6885-5G | |
| propidium iodide solution | Sigma | P4864-10 ml | |
| stable stack 20 microliter | Rainin | SS-L10 | |
| 20 microliter filter tips | Rainin | SRL10F | |
| stable stack 250 microliter tips | Rainin | SS-L250 | |
| 1000 microliter tips | Rainin | GPS-L1000 | |
| 1000 microliter filter tips | Rainin | GP-L1000F | |
| 250 microliter Filter Tips | Rainin | SR-L200F | |
| FC Block | BD Biosciences | 553142 | |
| fisher 100mn strainers | Fisherbrand | 22-363-549 | |
| medium weigh dish | Fisherbrand | 02-202B | |
| aluminum foil | Fisherbrand | 1213100 | |
| mincing scissors | Fisherbrand | 089531B | |
| Vortex | Fisherbrand | 2215365 | |
| 50 ml conical tubes | BD Falcon | 14-959-49A | |
| filter top FACS tubes | BD Falcon | 352235 | |
| 10 ml pipette case 200 | BD Falcon | 1367520 | |
| round bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 5 ml syringe | BD Falcon | 309646 | |
| V Bottom Plates | Costar | 07-200-107 | |
| transfer bulb pipette | Thermo Scientific | 13-711-22 | |
| Shaker | Thermo Scientific | 11 676 071 | |
| Adhesive mat | Thermo Scientific | 1368750 | |
| Cell Culture Centrifuge | Sorvall | 75253839 | |
| Adapters | Sorvall | 75003723 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 | BD Biosciences | 553142 | Concentration: 0.5 - 1 μg/ 106 cells |
| Rat anti-mouse F4/80 | eBioscience | 17-4801 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 17-4321 |
| Rat anti-mouse CD11b | eBioscience | 11-0112 | Fluorophore conjugate: FITC Concentration: 0.5 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 11/1/4031 |
| Armenian Hamster anti-mouse CD11c | eBioscience | 12-0114 | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: Dec-88 |
| Goat anti-mouse MGL1/2 | R&D Systems | FAB4297P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Goat anti-mouse CD206 | R&D Systems | FAB2535P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC108P |
| Rat anti-mouse CCR2 | R&D Systems | FAB5538P | Fluorophore conjugate: PE Concentration: 0.1 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: IC013P |
| Armenian Hamster anti-mouse TCRβ | BD Biosciences | 553174 | Fluorophore conjugate: APC Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 553956 |
| Rat anti-mouse CD8a | BD Biosciences | 552877 | Fluorophore conjugate: PE-Cy7 Concentration: 0.8 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 552784 |
| Rat anti-mouse CD4 | BD Biosciences | 557956 | Fluorophore conjugate: Alexa Fluor 700 Concentration: 0.2 μg/ 106 cells Isotype control catalog number: 557963 |
Table 1. List of Materials and Reagents. |
|||
References
- Rodbell, M. Metabolism of Isolated Fat Cells. I. Effects of Hormones on Glucose Metabolism and Lipolysis. The Journal of Biological Chemistry. 239, 375-380 (1964).
- Danse, L. H., Verschuren, P. M. Fish oil-induced yellow fat disease in rats. III. Lipolysis in affected adipose tissue. Veterinary Pathology. 15, 544-548 (1978).
- Weisberg, S. P., et al. Obesity is associated with macrophage accumulation in adipose tissue. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1796-1808 (2003).
- Xu, H., et al. Chronic inflammation in fat plays a crucial role in the development of obesity-related insulin resistance. The Journal of Clinical Investigation. 112, 1821-1830 (2003).
- Mathis, D., Shoelson, S. E.
- Stefanovic-Racic, M., et al. Dendritic cells promote macrophage infiltration and comprise a substantial proportion of obesity-associated increases in CD11c+ cells in adipose tissue and liver. Diabetes. 61, 2330-2339 (2012).
- Liu, J., et al. Genetic deficiency and pharmacological stabilization of mast cells reduce diet-induced obesity and diabetes in mice. Nature Medicine. 15, 940-945 (2009).
- Feuerer, M., et al. Lean, but not obese, fat is enriched for a unique population of regulatory T cells that affect metabolic parameters. Nature Medicine. 15, 930-939 (2009).
- Nishimura, S., et al. CD8+ effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity. Nature Medicine. 15, 914-920 (2009).
- Winer, S., et al. Normalization of obesity-associated insulin resistance through immunotherapy. Nature Medicine. 15, 921-929 (2009).
- Winer, D. A., et al. B cells promote insulin resistance through modulation of T cells and production of pathogenic IgG antibodies. Nature Medicine. 17, 610-617 (2011).
- Wu, L., et al. Activation of invariant natural killer T cells by lipid excess promotes tissue inflammation, insulin resistance, and hepatic steatosis in obese mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109. , 1143-1152 (2012).
- Wu, D., et al. Eosinophils sustain adipose alternatively activated macrophages associated with glucose homeostasis. Science. 332, 243-247 (2011).
- Elgazar-Carmon, V., Rudich, A., Hadad, N., Levy, R. Neutrophils transiently infiltrate intra-abdominal fat early in the course of high-fat feeding. Journal of Lipid Research. 49, 1894-1903 (2008).
- Talukdar, S., et al. Neutrophils mediate insulin resistance in mice fed a high-fat diet through secreted elastase. Nature Medicine. 18, 1407-1412 (2012).
- Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386, 50-59 (2012).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circulation Research. 100, e47-e57 (2007).
- Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45, 194-205 (2001).
