Summary
Descriviamo la preparazione di librerie di DNA codici a barre e la successiva base di ibridazione-esone cattura per la rilevazione di mutazioni tumorali associate chiave in campioni tumorali clinici di massively parallel sequencing "prossima generazione". Mirato esone sequenziamento offre i vantaggi di elevata produttività, basso costo, e la copertura sequenza profondo, ottenendo così elevata sensibilità per la rilevazione delle mutazioni a bassa frequenza.
Abstract
Gli sforzi per individuare e indagare principali mutazioni oncogene si sono rivelate preziose per facilitare il trattamento appropriato per i pazienti oncologici. L'istituzione di high-throughput, massicciamente parallelo sequenziamento "next-generation" ha favorito la scoperta di molte di queste mutazioni. Per migliorare l'utilità clinica e traslazionale di questa tecnologia, piattaforme devono essere ad alta produttività, conveniente e compatibile con paraffina fissato in formalina incorporato (FFPE) campioni di tessuto che possono produrre piccole quantità di DNA degradato o danneggiato. Qui, descriviamo la preparazione di librerie di DNA barcode e multiplex seguite da base di ibridazione-cattura di esoni mirati per la rilevazione delle mutazioni tumorali associate a tumori freschi congelati e FFPE di sequenziamento massivamente parallelo. Questo metodo consente l'identificazione di mutazioni di sequenza, copia numero di alterazioni, e seleziona riarrangiamenti strutturali che coinvolgono tutti i geni target. Mirato esone sequenziamento offre tegli beneficia di throughput elevato, a basso costo, e la copertura sequenza profondo, conferendo ad alta sensibilità per la rilevazione di mutazioni a bassa frequenza.
Introduction
L'identificazione di "driver" tumorali eventi genetici in oncogeni chiave e geni oncosoppressori gioca un ruolo essenziale nella diagnosi e nel trattamento di molti tumori 1. Attività di ricerca su larga scala che utilizzano massicciamente parallelo sequenziamento "next-generation" hanno permesso l'identificazione di molti di questi geni del cancro-associata negli ultimi anni 2. Tuttavia, queste piattaforme di sequenziamento in genere richiedono grandi quantità di DNA isolate da tessuti freschi congelati, ponendo così una limitazione importante nella caratterizzazione e l'analisi di mutazioni del DNA dai tessuti conservati, come la paraffina fissato in formalina incorporato (FFPE) campioni tumorali. Miglioramento sforzi per caratterizzare in modo efficiente e affidabile informazioni genomiche "fruibili" da campioni tumorali FFPE consentiranno l'analisi retrospettiva di campioni precedentemente sopraelevate e ulteriormente incoraggiare approcci individualizzati alla gestione del cancro.
Tradizionalmente, d molecolarelaboratori iagnostic hanno fatto affidamento su termini di tempo, metodologie a basso rendimento come il sequenziamento Sanger e real-time PCR per la mutazione del DNA profiling. Più di recente, i metodi più elevato throughput utilizzando PCR multiplex o spettrometria di massa genotipizzazione sono stati sviluppati per studiare le mutazioni somatiche ricorrenti nei geni chiave del cancro 3-5. Questi approcci, tuttavia, sono limitati dal fatto che solo "hotspot" mutazioni predesignated vengono dosati, che li rende inadatti per la rilevazione delle mutazioni inattivanti nei geni oncosoppressori. Sequenziamento massivamente parallelo offre diversi vantaggi rispetto a queste strategie, tra cui la possibilità di interrogare interi esoni per le mutazioni sia comuni che rare, la capacità di rivelare ulteriori classi di alterazioni genomiche quali utili e perdite del numero di copie, e una maggiore sensibilità di rilevazione in campioni eterogenei 6, 7 . Intero sequenziamento del genoma rappresenta l'approccio più completo per la scoperta mutazione, anche se è relativoly costoso e comporta grandi esigenze computazionali per l'analisi e l'archiviazione dei dati.
Per le applicazioni cliniche, dove solo una piccola frazione del genoma può essere di interesse clinico, due particolari innovazioni nella tecnologia di sequenziamento sono stati trasformativa. In primo luogo, attraverso la cattura esone basato sull'ibridazione, si può isolare DNA corrispondente ai geni cancro-associate chiave per mirata mutazione profiling 8,. In secondo luogo, attraverso la legatura di codici a barre molecolare (cioè sequenze di DNA 6-8 nucleotidi di lunghezza), si possono riunire centinaia di campioni per analisi di sequenziamento e di sfruttare appieno la crescente capacità degli strumenti di sequenziamento massivamente parallelo 10. Quando combinati, queste innovazioni consentono di tumori ad essere sagomate per i costi più bassi e in un throughput più elevato, con minori requisiti di calcolo 11. Inoltre, ridistribuendo copertura della sequenza soltanto a quei geni più critici per la particolare applicazione, si può Achieve maggiore profondità di sequenziamento per la sensibilità di rilevazione più elevato per gli eventi a bassa frequenza allele.
Qui descriviamo il nostro impatto saggio (Integrated Mutazione Profiling di obiettivi Actionable Cancro), che utilizza la cattura esone su piscine Biblioteca sequenza di codici a barre mediante ibridazione con oligonucleotidi personalizzate per catturare tutti gli esoni codificanti proteine e selezionare introni di 279 geni del cancro-associata chiave (Tabella 1 ). Questa strategia consente l'identificazione di mutazioni, indels, numero di copie alterazioni, e seleziona riarrangiamenti strutturali che coinvolgono questi 279 geni. Il nostro metodo è compatibile con il DNA isolato sia fresco tessuto congelato e FFPE nonché aspirati con ago sottile e altri campioni citologici.
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Protocol
1. DNA e Preparazione dei reagenti
Nota: Questo protocollo descrive l'elaborazione simultanea e l'analisi di 24 campioni (ad esempio 12 / coppie tumorali normali) ma può essere adattato per lotti piccoli e più grandi. Campioni di DNA possono derivare da FFPE o tessuto fresco congelato, campioni citologici, o di sangue. Tipicamente, entrambi tumore e tessuto normale dello stesso paziente sarà profilata insieme per distinguere mutazioni somatiche da polimorfismi ereditati. Il protocollo inizia immediatamente dopo l'estrazione del DNA.
- Aliquota 50-250 ng (250 ng consigliato) di DNA estratto per campione, diluito in 1x Tris-EDTA (pH 8.0) tampone ad un volume finale di 50 ml, in provette a fondo sferico separati Covaris.
- Tosare il DNA sullo strumento Covaris E220 presso le seguenti impostazioni di taglio: 360 sec a 10 duty factor, 175 PIP, e 200 cicli per scoppiare.
- Scongelare AMPure Beads XP (Tabella 2) a temperatura ambiente. Scongelare tutti i buffers ed enzimi sul ghiaccio prima del passaggio appropriato.
2. End Module Repair - Preparazione Biblioteca
- Preparare la master mix riparazione end in una provetta sterile utilizzando i seguenti volumi per campione: 10 ml di 10x NEBNext End Repair Reaction Buffer (Tabella 2), 5 ml NEBNext End Repair Enzyme Mix (Tabella 2), 35 microlitri di nucleasi sterile libero H 2 O.
- Aliquotare i 50 pl di ciascun DNA tosata in pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 50 ml di riparazione parte master mix pronti a ogni reazione. Incubare in un termociclatore per 30 min a 20 ° C.
3. Messaggio di fine Repair Clean-up
- Aggiungere il volume 2x (200 ml) di AMPure Beads XP (Tabella 2) per ogni campione e pipettare delicatamente l'intero volume su e giù per 10 volte con una pipetta multicanale. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
- Posizionare sul supporto magnetico (Tabella 2
- Rimuovere delicatamente e scartare chiara presa surnatante attenzione a non disturbare perline. Alcuni liquido può rimanere in pozzi.
- Con tubi sul cavalletto, aggiungere lentamente 200 ml di preparato fresco 80% di etanolo per ogni campione e incubare piastra a temperatura ambiente per 30 sec. Con cautela, rimuovere l'etanolo mediante pipetta.
- Ripetere il passaggio 5, per un totale di 2 lavaggi etanolo. Assicurarsi che tutto l'etanolo è stato rimosso. Togliere dal supporto magnetico e lasciare asciugare a temperatura ambiente per 5 min.
- Risospendere perle secchi con 44,5 ml sterile H 2 O. Delicatamente, pipetta intero volume su e giù per 10 volte mescolando accuratamente. Assicurare perle sono più attaccati al lato del bene.
- Incubare microsfere in sospensione a temperatura ambiente per 2 min. Posto su supporto magnetico per 5 minuti fino a quando appare il campione chiaro.
- Delicatamente trasferire 42 ml di surnatante trasparente contenente il campione di un nuovo pozzo.
La procedura può essere tranquillamente fermato a questo step e campioni conservati a -20 ° C per 7 giorni. Per riavviare, scongelare i campioni congelati in ghiaccio prima di procedere.
4. Preparazione Biblioteca - Modulo dA-tailing
- Preparare la master mix dA-tailing in una provetta sterile utilizzando i seguenti volumi per campione: 5 microlitri di 10x NEBNext reazione dA-tailing Buffer (Tabella 2), 3 ml (3'-5 'exo-) Klenow Fragment (Tabella 2 ).
- Aggiungere 8 ml di preparato master mix dA-tailing in ciascun pozzetto contenente 42 ml di DNA di fine riparato. Incubare in un termociclatore per 30 min a 37 ° C.
- Eseguire un post dA-tailing clean-up: Ripetere i passaggi 3,1-3,8 utilizzando il volume 2x (100 ml) di perline, ma risospendere in H 2 O sterile per un volume finale di 33,75 ml.
La procedura può essere tranquillamente fermato a questo punto e campioni conservati a -20 ° C per 7 giorni. Per riavviare, scongelare i campioni congelati in ghiaccio prima di procedere. </ Li>
5. Preparazione Biblioteca - Adattatore legatura Module
- Preparare la master mix legatura in una provetta sterile utilizzando i seguenti volumi per campione: 10 ml di 5x NEBNext rapida Ligation Reaction Buffer (New England Biolabs, Tabella 2), 5 ml rapida T4 DNA ligasi (Tabella 2).
- Aggiungere 15 ml di master mix legatura in ciascun pozzetto contenente il DNA dA-code.
- Aggiungere 1,25 ml di 25 mM appropriato NEXTflex adattatore di codice a barre (Tabella 2) a ciascun pozzetto. Ogni campione deve ricevere una scheda con codice a barre separato. Incubare in un termociclatore per 15 min a 20 ° C.
- Eseguire un adattatore di post legatura clean-up: Ripetere i passaggi 3,1-3,8 utilizzando il volume 1x (50 ml) di perline, ma risospendere in H 2 O sterile fino ad un volume finale di 50 microlitri.
- Ripetere i passaggi 3,1-3,8 per un secondo volume 1x (50 pl) clean-up, ma risospendere in sterile H 2 O ad unvolume finale di 23 microlitri.
La procedura può essere tranquillamente fermato a questo punto e campioni conservati a -20 ° C per 7 giorni. Per riavviare, scongelare i campioni congelati in ghiaccio prima di procedere.
6. Amplificazione Biblioteca
- Preparare la master mix KAPA HiFi in una provetta sterile utilizzando i seguenti volumi per campione: 25 microlitri 2x KAPA HiFi HS RM (Tabella 2), 1 ml ciascuno di 100 micron Primer Primer 1 e 2 (Tabella 3).
- Aggiungere 27 microlitri della master mix in ciascun pozzetto contenente il prodotto di ligazione. Impostare pipetta a 50 microlitri e delicatamente pipetta l'intero volume su e giù 10x.
- Collocare nel termociclatore per i seguenti cicli di PCR: denaturazione iniziale di 45 sec a 98 ° C, 10 cicli di 15 secondi a 98 ° C, 30 sec a 60 ° C, 30 sec a 72 ° C, e l'estensione finale di 1 min a 72 ° C.
- Eseguire un post di amplificazione clean-up: Ripetere i passaggi 3,1-3,8 usandoVolume 1x (50 ml) di AMPure Beads XP, e risospendere in acqua sterile fino ad un volume finale di 30 microlitri.
- Quantificare la concentrazione di ciascuna libreria utilizzando Qubit Ampia gamma Assay (Life Technologies, tabella 2) secondo le istruzioni del produttore.
7. Roche Nimblegen SeqCap EZ Biblioteca ibridazione, lavaggio, e Amplificazione
- Scongelare bloccanti oligonucleotidi universali e indice (Tabella 3), SeqCap EZ Biblioteca, e componenti di acquisizione NimbleGen (COT DNA, tampone di ibridazione 2x, e l'ibridazione dei componenti A, Tabella 2) su ghiaccio. Tutti i bloccanti oligonucleotidi sono memorizzati in azioni di lavoro di 1 mm. Il nostro SeqCap EZ Library è un pool di custom-designed di sonde di cattura che comprende tutti gli esoni codificanti proteine di 279 geni del cancro-associata, anche se possono essere utilizzati altri disegni personalizzati e catalogo.
- Preparare un pool di 1 mm bloccanti indice di oligonucleotidi corrispondenti all'annuncio codice a barre specificosequenze aptor utilizzati nella preparazione biblioteca. Combina 1 ml di ogni blocker, e vortex.
- In un nuovo sterile da 1,5 ml provetta, aggiungere 5 ml di 1mg/ml COT DNA, 2 ml di 1 mm bloccante universale e 2 microlitri della piscina 1 mm bloccanti indice di oligonucleotidi.
- Pool 24 biblioteche codice a barre in una singola reazione. Aggiungere un totale di 1-3 mg di pool, biblioteca sequenza di codice a barre (preparato in precedenza) alla miscela di cattura. Per 24 campioni, si raccomanda 100 ng per campione. Quando il pool tumori e campioni normali abbinati, si consiglia l'aggiunta più biblioteca tumore (ad esempio 100 ng per tumore e 50 ng per normale) in modo che essi sono in sequenza ad una maggiore profondità di copertura.
- Chiudere tappo della valvola e fare 15-20 fori nella parte superiore del cappuccio con un 18-20 G o più piccolo. Velocità Vac il campione biblioteca / COT DNA / oligo amplificati in un vuoto concentratore DNA in alto calore (60 ° C).
- Una volta completamente asciutta giù, reidratare con 7,5 ml di 2x hybriditampone zazione e 3 ml di ibridazione componente A. Il tubo dovrebbe contenere le seguenti: 5 mg COT DNA, ug variabile biblioteca campione amplificato, 1000 pmol di Universal e Index Oligos, buffer di 7,5 microlitri 2x ibridazione, 3 componente microlitri di ibridazione A in un volume totale di 10,5 microlitri.
- Coprire i fori del tappo con un piccolo pezzo di nastro laboratorio. Vortex il campione per 10 secondi e centrifugare alla massima velocità per 10 sec.
- Incubare il campione a 95 ° C per 10 minuti per denaturare il DNA, seguita da centrifugazione a velocità massima per 10 secondi a temperatura ambiente.
- In un nuovo 0.2 ml PCR tubo striscia, preparare 2,25 ml aliquota di SeqCap EZ sonde di cattura Biblioteca e 2,25 ml di sterile nucleasi libera H 2 O e aggiungere il contenuto di passo 7.7. Pipettare delicatamente l'intero volume su e giù 10x.
- Incubare in un termociclatore a 47 ° C per 48-96 ore. Impostare e mantenere la temperatura coperchio del termociclatore a 57 ° C.
- Folbassi passaggi nel capitolo 6 della Guida dell'utente SR NimbleGen SeqCap EX Biblioteca v3.0 (Tabella 2) per il lavaggio e recupero del DNA catturato.
- Segue passaggi nel capitolo 7 del protocollo Roche NimbleGen per l'amplificazione del DNA catturato con le seguenti modifiche:
- Utilizzare 2x KAPA HiFi polimerasi (tabella 2) anziché Phusion-High Fidelity PCR Master Mix
- Utilizzare 100 micron Primer 1 e 2 Primer elencati nella Tabella 3.
- Eseguire le seguenti condizioni di PCR: denaturazione iniziale a 98 ° C per 30 sec, 11 cicli di 98 ° C per 10 sec, 60 ° C per 30 sec, 72 ° C per 30 sec, e di estensione finale a 72 ° C per 5 min . Tenere a 4 ° C.
- Quantificare la concentrazione del DNA catturato amplificato utilizzando Qubit alta sensibilità del test (Tabella 2) secondo le istruzioni del produttore.
- Analizzare la qualità del DNA catturato utilizzando Agilent BioChip analizzatore di DNA HS (Tabella 2) secondo le istruzioni del produttore.
- La resa PCR deve essere almeno 100 ng (range 100-1.000 ng).
- La lunghezza media frammento deve essere compresa tra 150-400 coppie di basi.
8. Illumina Hi-Seq Sequencing
- Diluire il DNA catturato amplificato a 2:00, e caricare il campione su una sola corsia di una cella di flusso Illumina HiSeq 2000. Sequenza accoppiato-end coppia di 75 di base legge secondo le istruzioni del produttore. Nella nostra esperienza, una corsia è sufficiente a produrre una copertura sequenza unica 500-700x per esempio tra 279 geni per un pool di 24 campioni.
- Software Illumina (Real Time Analysis) ti permette di convertire immagini ad alta risoluzione per intensità di cluster di basare le chiamate e punteggi di qualità. Utilizzare Casava per demultiplex dati in base all'identità di codici a barre e generare file FASTQ individuali per ogni campione.
9. Dati Anallisi
- Sequenze adattatore Trim dalla fine del 3 'della sequenza di legge nei file FASTQ utilizzando Cutadapt ( http://code.google.com/p/cutadapt/ ). La lunghezza minima di sovrapposizione (-O) è 3 con un tasso di errore (-e) del 1%. La lunghezza minima di base per il mantenimento di Gemellaggio legge dopo il taglio è di 25.
- Allineare sequenza di legge alle hg19 genoma umano di riferimento utilizzando lo strumento Burrows-Wheeler Aligner (BWA) 12. Eseguire le operazioni di post-processing, tra cui la marcatura duplicato, sequenza locale riallineamento multipla, e la qualità di base il punteggio ricalibrazione usando l'analisi del genoma Toolkit (GATK) secondo le migliori prassi standard ( http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? name = best practice ) 13. Quando profilatura più campioni dello stesso paziente (es. tumore accoppiati e normali), sequenza locale riallineamento multipla dovrebbe essere prestazioniMED congiuntamente. L'output di questi passaggi di post-processing è un file BAM separato per ogni campione, che contiene tutte le sequenze, la qualità e le informazioni di allineamento e può essere caricato direttamente nella Integrative Genomics Viewer (IGV) per la visualizzazione di letture e di varianti di sequenza 14.
- Calcola metriche di performance sequenza utilizzando strumenti Picard ( http://picard.sourceforge.net/ ). Metriche informativi includono tasso di allineamento, distribuzione dimensione del frammento, GC-content pregiudizi di copertura associato, on-target capture specificità, PCR duplicare frequenza, complessità biblioteca e media copertura del bersaglio. Valori rappresentativi sono indicati in Figura 1. Frequenze alleliche nei siti comune polimorfismo calcolati utilizzando DepthOfCoverage da GATK vengono utilizzati per monitorare la contaminazione da DNA estranei e per garantire che i campioni abbinati provenivano dagli stessi pazienti.
I seguenti analisi computazionali dipendono dalla presenza di abbinatocampioni tumorali e normali per la rilevazione di alterazioni genetiche somatiche. I tumori senza precedenti possono anche essere analizzati utilizzando un campione di controllo normale separato, ma mutazioni più somatiche non possono essere facilmente distinti da varianti di sequenza ereditate. - Chiamare varianti somatiche singolo nucleotide (SNVs) per ogni coppia tumore-normale usando un chiamante mutazione somatica, come muTect 15, SomaticSniper 16, o Strelka 17. Usiamo muTect con criteri di filtro modificati, consentendo varianti con bassa (non zero) conta allele nel campione normale purché la frequenza allele è almeno 5 volte maggiore nel tumore. Varianti ricorrentemente chiamato in un pannello di DNA normali vengono rimossi come probabili manufatti sistematiche di sequenziamento o l'allineamento. Ogni SNV passando filtri viene poi accuratamente esaminato utilizzando IGV.
- Chiama indels somatiche per ogni coppia di tumore normale utilizzando algoritmi come SomaticIndelDetector 13, Dindel 18, o SOAPindel 19
- Estrapolare copia dello stato numero dalla copertura sequenza in esoni bersaglio. Per ogni singolo campione, eseguire una normalizzazione Loess di copertura sequenza media per tutti gli esoni bersaglio, regressione sopra percentuale GC. Regolare i valori di copertura normalizzate sottraendo la misura Loess e aggiungendo la copertura mediana a livello di campione. Calcolare il rapporto di copertura in sequenza normalizzata in tutti gli esoni bersaglio per le coppie tumore normale. In assenza di un campione normale accoppiati e / o per diminuire il rumore, altri diploide per sessopossono essere utilizzati normali controlli che mancano varianti del numero di copie germinali. Determinare somatici utili e le perdite di numero di copia basato su aumenti o diminuzioni del rapporto di copertura.
- Chiamare riarrangiamenti somatici tra geni tumorali in cui almeno un punto di interruzione genomico cade all'interno o vicino a un intervallo mirato del genoma. Algoritmi suggeriti includono GASV 20, Breakdancer 21, CREST 22, e Dranger 23. Intrachromosomal inversioni, delezioni e duplicazioni tandem possono essere distinti in base alla posizione relativa e l'orientamento di sostenere legge in coppie discordanti. Tutti i riarrangiamenti candidati dovrebbero essere rivisti manualmente con IGV. Si consiglia di validazione sperimentale mediante PCR e sequenziamento Sanger di tutti i punti di interruzione riarrangiamento putativi.
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Representative Results
Una piscina di 24 biblioteche sequenza codice a barre (12 paia tumore-normale) è stato catturato utilizzando sonde corrispondenti a tutti gli esoni codificanti proteine di 279 geni del cancro e sequenziato da 2 x 75 bp legge su una sola corsia di una cella di flusso HiSeq 2000. Tumore e biblioteche normali sono stati raggruppati in un rapporto 2:1. Metriche di performance Esempio per una piscina di surgelati campioni di DNA del tumore sono mostrati in figura 1, tra cui il tasso di allineamento, distribuzione dimensione del frammento, on-target capture specificità e media copertura del bersaglio. Esempi di mutazioni somatiche, inserimenti, eliminazioni e del numero di copie alterazioni sono riportati nelle figure 2-4.
Figura 1. Figure rappresentative delle metriche di performance sequenza. a) densità di cluster e tasso di allineamento, b) significa copertura del bersaglio,
Figura 2. Immagine Integrative Genomics Viewer (IGV) che mostra la specificità della copertura sequenza in esoni di EGFR in un cancro al polmone (in alto) e tessuto normale abbinato (in basso). Barre grigie rappresentano sequenza unica legge. A destra, un eterozigote mutazione T> G è presente nel 24% della legge nel tumore e 0% di letture nel normale, indicando che si tratta di una somatica sostituzione aminoacidica L858R. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
3 "fo: content-width =" "src =" 6in / files/ftp_upload/50710/50710fig3.jpg "width =" 600px "/>
Figura 3. Esempi di indels di una coppia tumore normale cancro colorettale:.. A) inserimento frameshift somatica in APC b) Somatic delezione frameshift di 7 paia di basi di TP53 Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 4. Numero di copia alterazioni di una coppia tumore-normale. Ogni punto di dati rappresenta un singolo esone di 279 geni bersaglio. Guadagni numero di copie e le perdite sono desunti da aumenti e le diminuzioni nella copertura sequenza tumore. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Tabella 1: Sonda Caratteristiche del progetto per Target Capture.
| Totale esoni | 4.535 |
| Totale introni | 14 |
| SNPs * | 1042 |
| Totale territorio di destinazione | 879.966 paia di basi |
| Territorio sonda Total | 1.400.415 paia di basi |
Tabella 2. Reagenti e kit.
| Nome delReagente / Materiale | Azienda | Numero di catalogo |
| Modulo di riparazione NEBNext End | New England Biolabs | E6050L |
| NEBNext dA-tailing Module | New England Biolabs | E6053L |
| NEBNext Module legatura rapida | New England Biolabs | E6056L |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | |
| NEXTflex PCR-Free codici a barre - 24 | Bioo scientifico | 514.103 |
| HiFi Biblioteca Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 |
| COT DNA umano, fluorometrica Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 |
| NimbleGen SeqCap EZ ibridazione e kit di lavaggio | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 |
| Esche SeqCap EZ Biblioteca | Roche NimbleGen | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Tecnologie di Vita | Q32850 |
| Qubit dsDNA ad alta sensibilità (HS) Assay Kit | Tecnologie di Vita | Q32851 |
| Kit Agilent DNA HS | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | |
| Covaris E220 | Covaris | |
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
Tabella 3. Indice Oligo Blocchi e Primer sequenze.
| TS-HE universale Blocker | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 1 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 3 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 4 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 5 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 6 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 7 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 8 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 9 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 10 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 11 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 12 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 13 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 14 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 15 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 16 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 18 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 19 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 20 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 21 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 22 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 23 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 25 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 27 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| Primer 1 | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3 ' |
| Primer 2 | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3 ' |
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Discussion
Il nostro test IMPACT produce un alto tasso di allineamento, alto tasso on-target, elevata copertura di destinazione, e ad alta sensibilità per le mutazioni rilevamento, indels, e numero di esemplari alterazioni. Abbiamo dimostrato la capacità del nostro test IMPACT alla sequenza di DNA sia fresco congelato e archiviato campioni FFPE di ingresso DNA bassa. Eseguendo mirata esone sequenziamento dei geni del cancro-associata chiave, si può ottenere una copertura sequenza molto profondo per gli esoni di questi geni più critiche massimizzando così la capacità di rilevare mutazioni a bassa frequenza. L'uso di codici a barre e multiplexing consente un throughput più elevato, minor costo per campione, e minori quantità di input di DNA.
Un vantaggio dell'approccio mirato è che è possibile ottimizzare sonde di cattura tale che tutti gli esoni sono coperti uniformemente e sufficientemente per la rilevazione delle mutazioni. Come indicato nella tabella 1, il nostro progetto comprende 4535 esoni in 279 geni. A seguito di miglioramenti iterativi pernostro disegno, un tipico esperimento sequenziamento produce non più del 2% di esoni a meno del 20% della copertura mediano per l'intero campione. Così, per un tumore sequenziato a 500x copertura della sequenza (una stima conservativa come indicato in Figura 1),> 98% di esoni sarà coperta da> 100x profondità, garantendo elevata sensibilità per identificare mutazioni a bassa frequenza. Questa uniformità di copertura può essere in gran parte attribuito alla flessibilità del sistema Nimblegen SeqCap, in cui le sonde possono essere sintetizzati a diverse lunghezze in regioni di diversa composizione nucleotidica. Abbiamo anche utilizzato con successo sintetizzati individualmente oligonucleotidi biotinilati di DNA Technologies integrati (IDT) per aggiungere nuovi contenuti al nostro pannello e per aumentare la copertura delle regioni che sono difficili da catturare e / o la sequenza. Con anche l'acquisizione di selezionare introni dei geni ricorrentemente riarrangiati, siamo in grado di identificare riarrangiamenti strutturali che producono geni di fusione, anche quando uno solo Fusion socio viene catturato.
Questo approccio ordinamento mirato risulta possedere due principali limitazioni nella capacità di rilevare "driver" alterazioni genetiche nei tumori. In primo luogo, solo una frazione del genoma viene interrogato. Sequenziamento mirato è, per sua natura, limitata. Come nuovi geni del cancro emergono dalla genomica sistematici sforzi, essi possono essere rapidamente aggiunti ad un pannello di acquisizione, ma funzionalmente importanti mutazioni potrebbero non avere che verrebbe rilevato dal genoma completo o intero sequenziamento exome. In secondo luogo, è limitato ad alterazioni basati sul DNA. Il rilevamento dei trascritti aberrante espressi, isoforme di splicing romanzo e fusioni geniche richiede RNA-Seq o tecniche simili 24. Alterazioni epigenetiche come modificazioni della cromatina e la metilazione del DNA possono giocare un ruolo chiave nella tumorigenesi e nella progressione tumorale. Poiché le tecnologie di sequenziamento continuano a migliorare, si può immaginare strategie integrate che impiegano intero sequenziamento del genoma, RNA-Seq e avvicinamen complementariches per caratterizzare in modo completo la make-up genetico ed epigenetico dei tumori individuali su base di routine 25. Strategie integrate completi sono attualmente costo e computazionalmente proibitivo, sequenziamento mirato presenta una pratica alternativa per catturare le caratteristiche genomiche più salienti per le applicazioni cliniche e traslazionali.
Il nostro protocollo presuppone che i tumori sono in sequenza lungo il tessuto normale abbinato prelevato dal paziente stesso. Lo scopo di questo controllo normale è determinare se varianti di sequenza nel tumore vengono ereditate o acquisite somaticamente. In assenza di un normale corrispondenza, si può dedurre che le varianti si verificano in hotspot mutazionali (cioè siti di mutazioni somatiche ricorrenti in altri tipi di tumore) sono suscettibili di essere somatica. Inoltre, l'analisi delle plusvalenze e minusvalenze di numero di copia può essere effettuata con un campione normale diploide geneticamente non abbinato. Per tutte le altre alterazioni genetiche romanzo, il simultaneamenteanalisi dente di tessuto normale abbinato semplifica notevolmente l'interpretazione dei dati di mutazione risultanti ed è altamente raccomandato.
Il protocollo IMPACT qui descritto dimostra la coerenza e prestazioni di alta qualità per i campioni congelati. Abbiamo osservato la variabilità occasionale quando si lavora con campioni FFPE, però. A seconda dell'età e qualità del campione FFPE, il DNA può essere pesantemente degradati o chimicamente modificati, e di conseguenza può rendere difficile il sequenziamento e l'analisi 26. Detto questo, abbiamo trovato queste condizioni sperimentali per essere affidabile per la grande maggioranza dei campioni FFPE. Abbiamo anche applicato con successo questo protocollo per caratterizzare altri campioni clinicamente rilevanti, quali biopsie, aspirati con ago sottile, e campioni citologici. E 'per questa ragione la flessibilità necessaria per adattarsi ai diversi tipi di campioni di qualità variabile, quantità, e-eterogeneità che questo metodo sta urtare la diagnosid trattamento di pazienti affetti da cancro in ambito clinico.
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Disclosures
Il dottor Berger ha ricevuto compensi per consulenze e finanziamenti per la ricerca da Medicine Foundation, una società di diagnostica del cancro.
Acknowledgments
Ringraziamo il Dott. Agnes Viale e il MSKCC Genomica Nucleo Laboratorio per l'assistenza tecnica. Questo protocollo è stato sviluppato con il sostegno della Geoffrey Beene Cancer Research Center e dalla Fondazione Farmer famiglia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
References
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer. Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).
- Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples. PLoS One. 4 (11), e7887 (2009).
- Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine. EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).
- Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. C. Clinical implementation of comprehensive strategies to characterize cancer genomes: opportunities and challenges. Cancer Discov. 1 (4), 297-311 (2011).
- Taylor, B. S., Ladanyi, M. Clinical cancer genomics: how soon is now. J. Pathol. 223 (2), 318-326 (2011).
- Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat. Biotechnol. 27 (2), 182-189 (2009).
- Mamanova, L., Coffey, A. J., Scott, C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat. Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Craig, D. W., Pearson, J. V., Szelinger, S., et al. Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing. Nat. Methods. 5 (10), 887-893 (2008).
- Wagle, N., Berger, M. F., Davis, M. J., et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov. 2 (1), 82-93 (2012).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Depristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).
- Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
- Larson, D. E., Harris, C. C., Chen, K., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
- Saunders, C. T., Wong, W. S., Swamy, S., Becq, J., Murray, L. J., Cheetham, R. K. Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Albers, C. A., Lunter, G., Macarthur, D. G., Mcvean, G., Ouwehand, W. H., Din del Durbin, R. Accurate indel calls from short-read data. Genome Res. 21 (6), 961-973 (2011).
- Li, S., Li, R., Li, H., et al. Efficient identification of indels from short paired reads. Genome Res. 23 (1), 195-200 (2013).
- Sindi, S., Helman, E., Bashir, A., Raphael, B. J. A geometric approach for classification and comparison of structural variants. Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).
- Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation. Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).
- Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).
- Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability. Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study. Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).
- Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).
