Summary
Vi beskriver framställningen av streckkodade DNA-bibliotek och efterföljande hybridisering-baserade exon fånga för detektion av viktiga cancerassocierade mutationer i kliniska tumörprover av massivt parallella "nästa generations" sekvensering. Riktad exon sekvense erbjuder fördelarna med hög genomströmning, låg kostnad, och djup sekvenstäckning, vilket således ger hög känslighet för att detektera lågfrekventa mutationer.
Abstract
Arbetet med att upptäcka och utreda viktiga onkogena mutationer har visat sig vara värdefullt för att underlätta lämplig behandling för cancerpatienter. Inrättandet av hög genomströmning, har massivt parallell "nästa generations" sekvense hjälp upptäckten av många sådana mutationer. För att förbättra den kliniska och translationell nytta av denna teknik, måste plattformar vara hög genomströmning, kostnadseffektiv, och kompatibel med formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) vävnadsprover som kan ge små mängder degraderad eller skadat DNA. Här beskriver vi framställningen av streckkodade och multiplexade DNA-bibliotek följt av hybridisering baserat infångande av målinriktade exoner för påvisande av cancerassocierade mutationer i färska frysta och FFPE tumörer genom massivt parallell sekvensering. Denna metod gör det möjligt att identifiera sekvens mutationer, kopiera antal förändringar, och väljer strukturella omorganiseringar som omfattar alla riktade gener. Riktad exon sekvense erbjuder than nytta av hög kapacitet, låg kostnad, och djupa sekvenstäckning, vilket ger hög känslighet för att detektera lågfrekventa mutationer.
Introduction
Identifieringen av "förare" tumör genetiska händelser i centrala onkogener och tumörsuppressorgener spelar en viktig roll vid diagnos och behandling av många cancerformer 1. Storskaliga forskningsinsatser som utnyttjar massivt parallella "nästa generations" sekvensering har gjort det möjligt att identifiera många sådana cancerassocierade gener under de senaste åren 2. Men dessa sekvense plattformar kräver normalt stora mängder av DNA som isolerats från färska frusna vävnader, och de utgör en stor begränsning vid karakterisering och analys av DNA-mutationer från bevarade vävnader, såsom formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) tumörprover. Förbättrade insatser för att på ett effektivt och tillförlitligt sätt kännetecknar "actionable" genomisk information från FFPE tumörprover kommer att möjliggöra retrospektiv analys av tidigare bankas exemplar och ytterligare uppmuntra individualiserade metoder för cancervården.
Traditionellt molekylär diagnostic laboratorier har förlitat sig på tidskrävande, låg genomströmning metoder såsom Sanger-sekvensering och realtids-PCR för DNA mutation profilering. På senare tid har högre genomströmning metoder som utnyttjar multiplex PCR eller masspektrometrisk genotypning utvecklats för att undersöka återkommande somatiska mutationer i viktiga cancergener 3-5. Dessa tillvägagångssätt är emellertid begränsat i det att endast förutbestämd "hotspot"-mutationer analyseras, vilket gör dem olämpliga för detektering av inaktiverande mutationer i tumörsuppressorgener. Massivt parallella sekvense erbjuder flera fördelar jämfört med dessa strategier inklusive möjligheten att förhöra hela exoner för både vanliga och sällsynta mutationer, förmågan att avslöja ytterligare klasser av genomiska förändringar såsom kopierings antal vinster och förluster, samt större känslighet upptäckt i heterogena prover 6, 7 . Hela genomet sekvensering är den mest heltäckande strategi för mutation upptäckt, även om det är relativtly dyrt och medför stora beräknings krav på dataanalys och förvaring.
För kliniska tillämpningar, där endast en liten del av genomet kan vara av kliniskt intresse har två särskilda innovationer i sekvenseringsteknologi varit omvälvande. Först genom hybridisering-baserade exon fånga, kan man isolera DNA som motsvarar viktiga cancerassocierade gener för riktad mutation profilering 8. För det andra, genom ligering av molekylära streckkoder (dvs. DNA-sekvenser 6-8 nukleotider i längd), kan man samla hundratals prover per sekvense kör och fullt ut dra nytta av den ständigt ökande kapacitet på massivt parallella sekvenseringsinstrument 10. Sammantagna visar dessa innovationer möjliggör tumörer som ska profileras för lägre kostnad och med högre kapacitet, med mindre beräknings krav 11. Vidare, genom att omfördela sekvenstäckning till endast de gener som mest kritiska för den speciella applikationen, kan en achieve större sekvense djup för högre känslighet för låga händelser allelfrekvens upptäckt.
Här beskriver vi vår IMPACT-analys (Integrated Mutation Profilering av Actionable cancer mål), som utnyttjar exon fånga på streckkodade sekvens bibliotekspooler genom hybridisering med hjälp av anpassade oligonukleotider att fånga alla protein-kodande exoner och väljer introner av 279 nyckelcancerassocierade gener (Tabell 1 ). Denna strategi gör det möjligt att identifiera mutationer, indels, antal kopior förändringar, och väljer strukturella omorganiseringar som involverar dessa 279 gener. Vår metod är kompatibel med DNA isolerat från både fryst och FFPE vävnad samt fina nål aspirat och andra cytologiprover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA och Reagensberedning
OBS: Detta protokoll beskriver samtidig behandling och analys av 24 prover (t.ex. 12 tumör / normal par), men kan anpassas för mindre och större partier. DNA-prover kan härröra från FFPE eller färskfrusen vävnad, cytologiska prover, eller blod. Vanligtvis kommer både tumör och normal vävnad från samma patient profileras ihop för att skilja somatiska mutationer från nedärvda polymorfismer. Protokollet börjar omedelbart efter DNA-extraktion.
- Alikvot 50-250 ng (250 ng rekommenderas) av extraherat DNA per prov, späddes ut i 1 x Tris-EDTA (pH 8,0)-buffert till en slutlig volym av 50 | il, i separata Covaris rundbottnade rör.
- Skjuva DNA på Covaris E220 instrumentet på följande skjuvning inställningar: 360 sek vid 10 plikt faktor, 175 PIP, och 200 cykler per burst.
- Tina AMPure XP-Beads (tabell 2) till rumstemperatur. Tina alla buffers och enzymer på is före det lämpligt steg.
2. Bibliotek Förberedelser - End Repair Module
- Förbered slutet reparation huvudblandning i ett sterilt mikrocentrifugrör med hjälp av följande volymer per sampling: 10 ^ il 10 x NEBNext End Reparation Reaction Buffer (tabell 2), 5 | il NEBNext End reparation Enzyme Mix (tabell 2), 35 | il sterilt nukleasfritt H 2 O.
- Alikvotera 50 | il av varje klippt DNA i separata brunnar i en 96-brunnsplatta. Lägg till 50 l av det beredda slutreparations Master Mix till varje reaktion. Inkubera i en termocykler under 30 min vid 20 ° C.
3. Inlägg End Reparation Saneringen
- Lägg till 2x volym (200 l) av AMPure XP Pärlor (tabell 2) till varje prov och försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 10x med hjälp av en flerkanalspipett. Inkubera vid rumstemperatur i 15 min.
- Placera den magnetiska monter (Tabell 2
- Ta försiktigt bort och kassera klar supernatant till att inte störa pärlor. En del vätska finnas kvar i brunnarna.
- Med rören på stativet genom att försiktigt tillsätt 200 pl av nyframställd 80% etanol till varje prov och inkubera plattan vid rumstemperatur under 30 sek. Försiktigt, ta bort etanolen med pipett.
- Upprepa steg 5, för totalt 2 etanol tvättar. Se till att all etanol har tagits bort. Ta ut ur magnetstativ och låt torka vid RT i 5 min.
- Resuspendera torkade kulor med 44,5 l sterilt H2O Försiktigt, pipett hela volymen upp och ner 10x blanda ordentligt. Se till pärlorna inte längre sitter på sidan av brunnen.
- Inkubera resuspenderas pärlor vid RT under 2 min. Placera på magnetisk stå i 5 min tills provet visas tydligt.
- Överför försiktigt 42 l av en klar supernatant innehåller provet till en ny brunn.
Förfarandet kan säkert stoppas vid denna mep och prover förvaras vid -20 ° C i upp till 7 dagar. För att starta om, tina frysta prover på is innan du fortsätter.
4. Bibliotek Förberedelser - dA-tailing modul
- Förbered dA-tailing huvudblandning i ett sterilt mikrocentrifugrör med hjälp av följande volymer per sampling: 5 ^ il 10 x NEBNext dA-tailing Reaction Buffer (tabell 2), 3 pl (3'-5'-exo-) Klenow-fragment (tabell 2 ).
- Lägg 8 | il av det beredda dA-tailing huvudblandning till varje brunn innehållande 42 pl av slut reparerade DNA. Inkubera i en termocykler under 30 min vid 37 ° C.
- Gör ett inlägg dA-tailing sanering: Upprepa steg från 3,1 till 3,8 med hjälp av 2x volym (100 l) av pärlor, men återsuspendera i sterilt H2O till en slutlig volym på 33.75 pl.
Proceduren kan säkert stoppas vid detta steg och prover som förvarats vid -20 ° C i upp till 7 dagar. För att starta om, tina frysta prover på is innan du fortsätter. </ Li>
5. Bibliotek Framställning - Adapter Ligering Modul
- Förbered Ligation Master Mix i ett sterilt mikrocentrifugrör med hjälp av följande volymer per prov: 10 mikroliter av 5x NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (New England Biolabs, Tabell 2), 5 pl Quick T4 DNA-ligas (tabell 2).
- Tillsätt 15 ul av Ligering huvudblandning till varje brunn innehållande dA-tailed DNA.
- Addera 1,25 pl av den lämpliga 25 pM NEXTflex streckkods adapter (tabell 2) till varje brunn. Varje prov ska få ett eget streckkods adapter. Inkubera i en termocykler under 15 min vid 20 ° C.
- Gör ett inlägg adapter ligation sanering: Upprepa steg från 3,1 till 3,8 med hjälp 1x volym (50 l) av pärlor, men återsuspendera i sterilt H2O till en slutlig volym på 50 pl.
- Upprepa steg från 3,1 till 3,8 för en andra 1x volym (50 l) sanering, men återsuspendera i sterilt H2O till enslutlig volym av 23 | il.
Proceduren kan säkert stoppas vid detta steg och prover som förvarats vid -20 ° C i upp till 7 dagar. För att starta om, tina frysta prover på is innan du fortsätter.
6. Bibliotek Amplifiering
- Förbered KAPA HiFi huvudblandning i ett sterilt mikrocentrifugrör med hjälp av följande volymer per prov: 25 pl 2x KAPA HiFi HS RM (tabell 2), 1 | il vardera av 100 | iM primer 1 och primer 2 (tabell 3).
- Addera 27 pl av mastermixen till varje brunn innehållande ligeringsprodukten. Ställ pipett till 50 ^ och försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 10x.
- Placera i termocykler av följande PCR-cykler: initial denaturering av 45 sek vid 98 ° C, 10 cykler av 15 sek vid 98 ° C, 30 sek vid 60 ° C, 30 sek vid 72 ° C, och slutlig förlängning av 1 min vid 72 ° C.
- Gör ett inlägg förstärkning sanering: Upprepa steg från 3,1 till 3,8 med hjälp av1x volym (50 | il) av AMPure XP pärlor, och återsuspendera i sterilt vatten till en slutlig volym av 30 | il.
- Beräkna koncentrationen av varje bibliotek med användning Qubit Broad Range Assay (Life Technologies, tabell 2) i enlighet med tillverkarens instruktioner.
7. Roche Nimblegen SeqCAP EZ Library Hybridisering, Wash, och Amplification
- Tina universella och index oligonukleotid blockerare (tabell 3), SeqCap EZ Bibliotek och NimbleGen fånga komponenter (COT-DNA, 2x hybridisering buffert, och hybridisering komponent A, Tabell 2) på is. Alla oligonukleotid blockerare lagras i arbets lager av 1 mM. Vår SeqCap EZ Library är ett skräddarsytt pool av infångningssökfragment omfattar alla protein-kodande exoner av 279 cancerassocierade gener, även om andra anpassade och katalog mönster kan användas.
- Bered en 1 mM pool av index oligonukleotida blockerare som motsvarar den specifika streckkods annonsAptor sekvenser som används i biblioteket förberedelse. Kombinera 1 jil av varje blockerare, och skaka.
- I en ny steril 1,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt 5 ìl av 1mg/ml COT-DNA, 2 pl 1 mM universalblockerare och 2 pl av 1 mM pool av index oligonukleotid blockerare.
- Pool 24 streckkodade biblioteken till en enda reaktion. Lägg totalt 1-3 pg av poolade, streckkods sekvens bibliotek (framställd ovan) till fånga blandningen. För 24 prover, är 100 ng per prov rekommenderas. Vid sammanslagning tumörer och matchade normala prover, rekommenderar vi att du lägger mer tumörbibliotek (t.ex. 100 ng per tumör och 50 ng per normal), så att de är sekvens till större djup av täckning.
- Förslut röret lock och gör 15 till 20 hål i den övre delen av locket med en 18-20 G eller tunnare nål. Hastighet Vac de förstärkta prov bibliotek / COT DNA / oligos i en DNA vakuumkoncentrator på hög värme (60 ° C).
- En gång helt torkat ner, rehydrate med 7,5 l av 2x hybridiseringnisation buffert och 3 l av hybridisering komponent A. Röret ska nu innehålla följande: 5 mikrogram COT-DNA, variabel ug förstärkt prov bibliotek, 1000 pmol Universal och index Oligos, 7,5 pl 2x hybridisering buffert, 3 pl hybridisering komponent A i ett total volym av 10,5 | il.
- Täck hålen i locket med en liten bit av laboratorie tejp. Vortex provet under 10 sek och centrifugera vid maximal hastighet under 10 sekunder.
- Inkubera provet vid 95 ° C under 10 min för att denaturera DNA, följt av centrifugering vid maximal hastighet under 10 sekunder vid rumstemperatur.
- I en ny 0,2 ml PCR-remsor rör, förbereda 2,25 l alikvot av SeqCap EZ Library infångningsprober och 2.25 l sterilt nukleasfritt H2O och lägg till innehållet i steg 7,7. Försiktigt pipettera hela volymen upp och ner 10x.
- Inkubera i en termocykler vid 47 ° C i 48-96 timmar. Ställ in och upprätthålla termocyklern lock temperatur till 57 ° C.
- Follåga steg i kapitel 6 i NimbleGen SeqCap EX Library SR Användarhandbok v3.0 (tabell 2) för tvättning och återvinning av den tagna DNA.
- Följer stegen i kapitel 7 i Roche NimbleGen protokoll för förstärkning av den tagna DNA med följande ändringar:
- Använd 2x KAPA HiFi-polymeras (tabell 2) i stället för Phusion High-Fidelity PCR Master Mix
- Använd 100 ^ M primer 1 och primer 2 anges i tabell 3.
- Kör följande PCR-betingelser: initial denaturering vid 98 ° C under 30 sek, 11 cykler av 98 ° C under 10 sek, 60 ° C under 30 sekunder, 72 ° C under 30 sekunder, och slutlig förlängning vid 72 ° C under 5 min . Håll vid 4 ° C.
- Beräkna koncentrationen av den amplifierade infångade DNA med användning Qubit Hög känslighet analys (tabell 2) i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- Analysera den tagna DNA-kvalitet med hjälp av Agilent Bioanalysator DNA HS-chip (tabell 2) i enlighet med tillverkarens instruktioner.
- PCR-utbytet bör vara minst 100 ng (intervall 100-1000 ng).
- Den genomsnittliga fragmentlängd bör vara mellan 150 till 400 baspar.
8. Illumina Hi-Seq sekvense
- Späd den förstärkta tagna DNA till 14:00, och ladda provet på ett enda körfält av en flödescell Illumina HiSeq 2000. Sekvens parade slut 75 baspar läser enligt tillverkarens anvisningar. Enligt vår erfarenhet är en lane tillräcklig för att producera 500-700x unik sekvenstäckning per prov över 279 gener för en pool av 24 prover.
- Illumina programvara (Real Time Analysis) kommer att konvertera bilder med hög upplösning till kluster intensiteter att basera samtal och kvalitetsresultat. Använd CASAVA att demultiplexera data enligt streckkod identitet och generera individuella FASTQ filer för varje prov.
9. Data Anallys
- Trim adaptersekvenser från 3 '-änden av sekvensen läser i FASTQ filer med Cutadapt ( http://code.google.com/p/cutadapt/ ). Den minsta överlappnlängd (-O) är 3 med en felfrekvens (-e) på 1%. Minsta grundlängd för bibehållande av parade läser efter trimning är 25.
- Rikta sekvens läser till referens mänskliga genomet hg19 använder Burrows-Wheeler Aligner verktyget (BWA) 12. Utför efterbehandlingssteg inklusive dubbletter märkning, lokala multipel sekvens omläggning, och basen kvalitetsresultat omkalibrering hjälp av Genome Analysis Toolkit (GATK) enligt deras standard bästa praxis ( http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? name = bästa praxis ) 13. När profilering flera prover från samma patient (t.ex. matchade tumör och normal), bör lokala multipel sekvens omläggning vara prestandaMed gemensamt. Utgången av dessa efterbehandlingssteg är en separat BAM-fil för varje prov, som innehåller all sekvens, kvalitet och inriktning information och kan laddas direkt i Integrative Genomics Viewer (IGV) för visualisering av läsningar och sekvensvarianter 14.
- Beräkna sekvensprestationsmått använder Picard verktyg ( http://picard.sourceforge.net/ ). Informativa mått inkluderar inriktnings takt, fragment storleksfördelning, GC-innehåll associerat täckning partiskhet, på-Target Capture specificitet, PCR duplicera hastighet, bibliotek komplexitet, och menar mål täckning. Representativa värden visas i Figur 1. Allelfrekvenser vid de gemensamma polymorfism platser beräknats med hjälp DepthOfCoverage från GATK används för att övervaka förorening från orelaterade DNA och för att se till att matchade proverna kom från samma patienter.
Följande beräknings analyser är beroende av förekomsten av matchastumör och normala prover för detektion av somatiska genetiska förändringar. Icke avstämda tumörer kan också analyseras med användning av en separat normal kontrollprov, men de flesta somatiska mutationer inte lätt kan skiljas från nedärvda sekvensvarianter. - Ring somatiska single nucleotide varianter (SNVs) för varje tumör-normal par med hjälp av en somatisk mutation som ringer, t.ex. muTect 15, SomaticSniper 16, eller Strelka 17. Vi använder muTect med modifierade filterkriterier, vilket möjliggör varianter med låg (icke-noll) allel räknas i det normala provet så länge allelfrekvens är minst 5x större i tumören. Varianter återkommande kallade i en panel av normala DNA tas bort som troliga systematiska artefakter av sekvensering eller inriktning. Varje SNV passerar filter sedan noggrant med hjälp IGV.
- Ring somatiska indels för varje tumör-normal par med hjälp av algoritmer såsom SomaticIndelDetector 13, Dindel 18, eller SOAPindel 19
- Extrapolera antalet exemplar status från sekvenstäckning på mål exoner. För varje enskilt prov, utför en Loess normalisering av medelsekvenstäckning för alla mål exoner, regression över GC procentsats. Justera onormaliserad värdena täckning genom att subtrahera löss passform och lägga provet täckande median täckning. Beräkna förhållandet i normaliserad sekvens täckning runtom i alla exoner för tumör normala par. I avsaknad av en matchad normal prov och / eller för att minska buller, andra könsmatchade diploidanormala kontroller som saknade könsceller kopietal varianter kan användas. Bestäm somatiska kopietal vinster och förluster baserat på ökningar eller minskningar i täckningsgrad.
- Ring somatiska omdisponeringar involverar cancergener där minst en genomisk brytpunkt faller inom eller i närheten av en riktad intervall av genomet. Föreslagna algoritmer inkluderar GASV 20, Dancer 21, CREST 22, och Dranger 23. Intrakromosomal inversioner, deletioner och tandem-upprepningar kan särskiljas baserat på den relativa positionen och orienteringen av stöd läser i diskordanta par. Alla kandidat omdisponeringar bör manuellt omdömet använda IGV. Vi rekommenderar experimentell validering av PCR och Sanger-sekvensering över de förmodade polyadditionsprodukter brytpunkter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En pool av 24 streckkodade bibliotek sekvens (12 tumör normala par) fångades med hjälp av sonder som motsvarar alla protein-kodande exoner av 279 cancergener och sekvens som 2 x 75 bp läser på ett enda körfält av en flödescell HiSeq 2000. Tumör-och normala bibliotek slogs samman i ett förhållande 02:01. Prov prestationsmått för en pool av frusna tumör DNA-prover visas i figur 1, inklusive inriktningshastighet, fragment storleksfördelning, på-target capture specificitet, och medelvärdet eftersträvade täckningen. Exempel somatiska mutationer är infogningar, borttagningar och kopienummer förändringar som visas i figurerna 2-4.
Figur 1. Representativa siffror från de sekvensresultatstatistik. a) kluster densitet och inriktningshastighet, b) menar mål täckning,
Figur 2. Integrative Genomics Viewer (IGV) bild som visar specificitet sekvenstäckning vid exoner av EGFR i lungcancer (överst) och matchas normal vävnad (botten). Grå staplar representerar unik sekvens läser. Till höger är en heterozygot T> G-mutation förekommer i 24% av läsningar i tumören och 0% av läsningar i det normala, vilket indikerar att det är en somatisk L858R aminosyrasubstitution. Klicka här för att visa en större bild .
3 "fo: innehåll-width =" 6in "src =" / files/ftp_upload/50710/50710fig3.jpg "width =" 600px "/>
Figur 3. Exempel på indels i en kolorektal cancer tumör normal par:.. A) Somatisk läsramsförskjutning insättning i APC b) Somatisk läsramsförskjutning radering av 7 baspar i TP53 Klicka här för att visa en större bild .
Figur 4. Kopiera antal förändringar i en tumör normal par. Varje datapunkt representerar en enda exon från 279 mål gener. Copy antal vinster och förluster utläsas av ökningar och minskningar i tumörsekvenstäckning. Klicka här för att visa en större bild .
Tabell 1: Probe Design Funktioner för Target Capture.
| Totalt exoner | 4535 |
| Totalt introner | 14 |
| SNPs * | 1042 |
| Totalt mål territorium | 879966 baspar |
| Totalt sond territorium | 1400415 baspar |
Tabell 2. Reagenser och kit.
| NamnReagens / Material | Company | Katalognummer |
| NEBNext End Reparation Modul | New England Biolabs | E6050L |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L |
| NEBNext Snabb Ligering Modul | New England Biolabs | E6056L |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | |
| NEXTflex PCR-Free Streckkoder - 24 | Bioo Scientific | 514103 |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 |
| COT Mänskligt DNA, Fluorometrisk Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridisering och Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 |
| SeqCap EZ Library Beten | Roche NimbleGen | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 |
| Qubit dsDNA Hög känslighet (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | |
| Covaris E220 | Covaris | |
| Magnetisk Stand-96 | Ambion | AM10027 |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
Tabell 3. Index Oligo blockerare & Tänd sekvenser.
| TS-HE Universal Blocker | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 1 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 3 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 4 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 5 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 6 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 7 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 8 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE index 9 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 10 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 11 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 12 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 13 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 14 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 15 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 16 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 18 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 19 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 20 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 21 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 22 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 23 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 25 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 27 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| Primer 1 | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3 ' |
| Primer 2 | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3 ' |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vår IMPACT-analysen ger en hög anpassning hastighet, hög på målnivån, höga mål täckning och hög känslighet för detektion av mutationer, indels, och antalet exemplar förändringar. Vi har visat förmågan att vår IMPACT-analys till sekvens DNA från både fryst och arkiveras FFPE prover av låg DNA-ingång. Genom att utföra riktade exon sekvensering av viktiga cancerassocierade gener, kan man uppnå mycket djup sekvenstäckning för exoner av dessa mest kritiska gener och därigenom maximera förmågan att detektera lågfrekventa mutationer. Användningen av streckkodning och multiplexering möjliggör högre kapacitet, lägre kostnad per prov, och lägre ingångs mängder DNA.
En fördel med det riktade tillvägagångssättet är att det är möjligt att optimera infångningssonder, så att alla exoner täcks likformigt och tillräckligt för mutationsdetektion. Som framgår av tabell 1, vår design omfattar 4535 exoner i 279 gener. Efter iterativa förbättringarvår design, ger en typisk sekvense experiment inte mer än 2% av exoner vid mindre än 20% av median täckning för hela provet. Således, för en tumör sekvens till 500x sekvenstäckning (en försiktig uppskattning som visas i figur 1),> 98% av exoner kommer att täckas av> 100x djup, som garanterar hög känslighet för att identifiera lågfrekventa mutationer. Denna likformighet av täckning kan till stor del hänföras till flexibiliteten hos Nimblegen SeqCap systemet, där sonderna kan syntetiseras till olika längder i regioner med olika nukleo-komposition. Vi har också med framgång användas individuellt syntetiserade biotinylerade oligonukleotider från Integrated DNA Technologies (IDT) för att lägga till nytt innehåll till vår panel och för att öka täckningen av områden som är svåra att fånga och / eller sekvens. Genom att också fånga utvalda introner av återkommande omarrangerade gener, har vi möjlighet att identifiera strukturella omorganiseringar som producerar fusionsgener även när endast en Fusion partner fångas.
Denna målinriktade sekvense strategi besitter två huvudsakliga begränsningar i förmågan att upptäcka "förare" genetiska förändringar i tumörer. För det första är endast en bråkdel av genomet förhörs. Riktad sekvensering är till sin natur begränsad. Som nya cancergener ur systematiska genomik insatser, kan de snabbt läggas till en capture panel, men funktionellt viktiga mutationer kan missas som kan upptäckas genom hela genom eller hela exome sekvensering. För det andra, är den begränsad till DNA-baserade förändringar. Upptäckten av avvikande uttryckta avskrifter, nya skarv isoformer och genfusioner kräver RNA-Seq eller liknande tekniker 24. Epigenetiska förändringar såsom kromatin ändringar och DNA-metylering kan också spela en viktig roll i tumörbildning och tumörprogression. Som sekvensering teknik fortsätter att förbättras, kan man föreställa sig integrerade strategier anställa hela genom sekvensering, RNA-Seq och kompletterande approaches att övergripande beskriva den genetiska och epigenetiska make-up av individuella tumörer rutinmässigt 25. Som kompletta integrerade strategier för närvarande kostnads-och beräknings-oöverkomliga, målinriktad sekvense utgör ett praktiskt alternativ för att fånga de mest framträdande iska funktioner för kliniska och translationella applikationer.
Vår protokoll förutsätter att tumörer sekvens tillsammans matchas normal vävnad från samma patient. Syftet med denna normal kontroll är att bestämma om sekvensvarianter som detekteras i tumören ärvs eller somatiskt förvärvas. I avsaknad av en matchad normal, kan man dra slutsatsen att varianter förekommer vid mutations hotspots (dvs platser för återkommande somatiska mutationer i andra cancerformer) är sannolikt somatisk. Vidare kan utföras analys av antal kopior vinster och förluster med ett icke genetiskt matchade diploid normalt prov. För alla andra nya genetiska förändringar, att samtidiggående analys av matchad normal vävnad förenklar tolkningen av de resulterande mutation uppgifter och rekommenderas starkt.
I IMPACT protokoll som beskrivs här visar konsekvens och hög kvalitet prestanda för frysta prover. Vi har observerat enstaka variabilitet vid arbete med FFPE prover, dock. Beroende på ålder och kvalitet FFPE provet kan DNA vara allvarligt skadad eller kemiskt modifierade, och som ett resultat kan göra sekvensering och analys svår 26. Med detta sagt, har vi funnit dessa experimentella förhållanden för att vara tillförlitliga för den stora majoriteten av FFPE prover. Vi har också med framgång tillämpat detta protokoll för att karakterisera andra kliniskt relevanta prover såsom biopsier, fina nål aspirat och cytologiska prover. Det är av denna anledning-flexibilitet för att tillgodose olika typer av prover av varierande kvalitet, kvantitet och heterogenitet-att denna metod står att påverka diagnosen end behandling av cancerpatienter i den kliniska arenan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr Berger har erhållit konsultarvode och forskningsanslag från Stiftelsen Medicin, ett cancerdiagnostik företag.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Agnes Viale och MSKCC Genomics Core-laboratoriet för teknisk assistans. Detta protokoll har utvecklats med stöd från Geoffrey Beene Cancer Research Center och Farmer Family Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
References
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer. Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).
- Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples. PLoS One. 4 (11), e7887 (2009).
- Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine. EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).
- Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. C. Clinical implementation of comprehensive strategies to characterize cancer genomes: opportunities and challenges. Cancer Discov. 1 (4), 297-311 (2011).
- Taylor, B. S., Ladanyi, M. Clinical cancer genomics: how soon is now. J. Pathol. 223 (2), 318-326 (2011).
- Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat. Biotechnol. 27 (2), 182-189 (2009).
- Mamanova, L., Coffey, A. J., Scott, C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat. Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Craig, D. W., Pearson, J. V., Szelinger, S., et al. Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing. Nat. Methods. 5 (10), 887-893 (2008).
- Wagle, N., Berger, M. F., Davis, M. J., et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov. 2 (1), 82-93 (2012).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Depristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).
- Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
- Larson, D. E., Harris, C. C., Chen, K., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
- Saunders, C. T., Wong, W. S., Swamy, S., Becq, J., Murray, L. J., Cheetham, R. K. Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Albers, C. A., Lunter, G., Macarthur, D. G., Mcvean, G., Ouwehand, W. H., Din del Durbin, R. Accurate indel calls from short-read data. Genome Res. 21 (6), 961-973 (2011).
- Li, S., Li, R., Li, H., et al. Efficient identification of indels from short paired reads. Genome Res. 23 (1), 195-200 (2013).
- Sindi, S., Helman, E., Bashir, A., Raphael, B. J. A geometric approach for classification and comparison of structural variants. Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).
- Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation. Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).
- Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).
- Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability. Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study. Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).
- Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).
