Summary
Wir beschreiben die Herstellung von mit Strichcode-DNA-Bibliotheken und die anschließende Hybridisierung Basis Exon Erfassung zur Erkennung von Schlüssel Krebs-assoziierten Mutationen in der klinischen Tumorproben von massiv parallelen Sequenzierung der "nächsten Generation". Gezielte Exon-Sequenzierung bietet die Vorteile der hohen Durchsatz, geringe Kosten, und tiefe Sequenzabdeckung, woraus sich eine hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Niederfrequenz-Mutationen.
Abstract
Die Bemühungen um die Aufdeckung und Untersuchung von Schlüssel onkogenen Mutationen sind wertvoll, um die geeignete Behandlung für Krebspatienten erleichtern bewährt. Die Errichtung von Hochdurchsatz, massiv parallel sequencing "nächsten Generation" die Entdeckung von vielen solcher Mutationen unterstützt. Um die klinische und translationale Nutzen dieser Technologie zu verbessern, müssen Plattformen mit hohem Durchsatz, kostengünstig und mit Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebeproben, die kleine Mengen von degradierten oder beschädigte DNA ergeben können kompatibel sein. Hier beschreiben wir die Herstellung von Barcode-und Multiplex-DNA-Bibliotheken, gefolgt von der Hybridisierung-basierte Erfassung von Exons für den Nachweis von Krebs-assoziierte Mutationen in frisch eingefroren und FFPE Tumoren durch massiv parallele Sequenzierung. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Sequenzmutationen, die Kopienzahl Änderungen, und wählen strukturelle Umlagerungen gezielte Einbeziehung aller Gene. Gezielte Exon-Sequenzierung bietet ter profitiert von hohen Durchsatz, geringe Kosten, und tiefe Sequenzabdeckung gelegt und somit hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Niederfrequenz-Mutationen.
Introduction
Die Identifizierung der "Fahrer" Tumor genetischen Ereignissen in Schlüssel Onkogene und Tumorsuppressorgene, spielt eine wesentliche Rolle bei der Diagnose und Behandlung vieler Krebsarten 1. Großforschungsanstrengungen massiv parallele Sequenzierung Verwendung "der nächsten Generation" haben die Identifizierung von vielen solcher Krebs-assoziierte Gene, die in den letzten Jahren 2 freigegeben. Allerdings sind diese Sequenzierungsplattformen erfordern in der Regel große Mengen an DNA aus gefrorenem Frischgewebe isoliert und so posiert eine große Einschränkung in der Charakterisierung und Analyse von DNA-Mutationen von konservierten Geweben, wie Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Tumorproben. Verbesserte Bemühungen, effizient und zuverlässig charakterisieren "verwertbare" genomische Informationen aus FFPE Tumorproben die retrospektive Analyse von zuvor überhöhten Proben zu ermöglichen und weiter zu fördern, individuelle Ansätze, um Krebs-Management.
Traditionell Molekular diagnostic Labors auf zeitraubende, geringe Durchsatz-Methoden wie die Sanger-Sequenzierung und Echtzeit-PCR für DNA-Mutation Profilierung verlassen. Neuerdings höhere Durchsatzverfahren unter Verwendung von PCR oder Multiplex-Genotypisierung massenspektrometrischen entwickelt worden, um wiederkehrende somatische Mutationen in Schlüsselkrebsgene 3-5 untersuchen. Diese Ansätze sind jedoch dadurch begrenzt, daß nur vorbezeichneten "Hotspot"-Mutationen untersucht, so dass sie zur Detektion inaktivierende Mutationen in Tumorsuppressorgenen ungeeignet. Massiv parallele Sequenzierung bietet mehrere Vorteile gegenüber diesen Strategien, einschließlich der Fähigkeit, ganze Exons für beide gemeinsame und seltene Mutationen zu verhören, die Fähigkeit, weitere Klassen von genomischer Veränderungen, die Kopienzahl Gewinne und Verluste zu offenbaren, und größere Nachweisempfindlichkeit in heterogenen Proben 6, 7 . Gesamtgenom-Sequenzierung stellt den umfassenden Ansatz für die Mutation Entdeckung, obwohl es relativ istly teuer und verursacht großen Rechenaufwand für die Datenanalyse und-speicherung.
Für klinische Anwendungen, bei denen nur ein kleiner Anteil des Genoms von klinischem Interesse sein, insbesondere zwei Innovationen in Sequenzierungstechnologie haben transformierende. Erstens, durch Hybridisierung Exon-basierten Erfassung, kann man DNA, die Taste Krebs-assoziierte Gene, die für eine gezielte Mutation Profilierung 8 isolieren. Zweitens, durch Ligation der molekularen Barcodes (dh DNA-Sequenzen 6-8 Nukleotide in der Länge), kann man Hunderte von Proben pro Sequenzierungslauf bündeln und voll die Vorteile der immer größeren Kapazität von massiv-parallele Sequenzierung 10 Instrumente. In Kombination ermöglichen diese Innovationen Tumoren, für niedrigere Kosten profiliert werden und bei höheren Durchsatz, mit kleineren Rechenanforderungen 11. Ferner kann durch die Umverteilung Sequenzabdeckung auf jene Gene am wichtigsten für die bestimmte Anwendung, eine Achie könnenve größer Sequenzierung Tiefe für höhere Nachweisempfindlichkeit für niedrige Allelfrequenz Veranstaltungen.
Hier beschreiben wir unsere IMPACT-Assay (Integrated Mutation Profiling von Action Krebs Targets), die Exon-Capture auf einer Barcode-Sequenzbibliothek Pools nutzt durch Hybridisierung unter Verwendung kundenspezifische Oligonukleotide, um alle Protein-kodierenden Exons zu erfassen und wählen Introns von 279 Schlüssel Krebs-assoziierte Gene (Tabelle 1 ). Diese Strategie ermöglicht die Identifikation von Mutationen, indels, Kopienzahl Änderungen, und wählen Sie Strukturänderungen im Zusammenhang mit diesen 279 Gene. Unsere Methode ist mit DNA aus sowohl frisch eingefroren und FFPE Gewebe sowie Feinnadelaspirate und andere Zellproben isoliert kompatibel.
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Protocol
1. DNA und Vorbereitung der Reagenzien
Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die gleichzeitige Aufbereitung und Analyse von 24 Proben (zB 12 Tumor / Normalpaare), kann aber bei kleineren und größeren Chargen angepasst werden. DNA-Proben können von FFPE oder gefrorenem Frischgewebe, zytologischen Proben, oder Blut abzuleiten. Typischerweise werden sowohl Tumor und normalem Gewebe des gleichen Patienten zusammen, um somatische Mutationen von Polymorphismen zu unterscheiden geerbt profiliert werden. Das Protokoll beginnt unmittelbar nach der DNA-Extraktion.
- 50-250 ng Aliquot (250 ng) empfohlen extrahierten DNA pro Probe, in 1x Tris-EDTA verdünnt (pH 8,0)-Puffer auf ein Endvolumen von 50 ul, in getrennte Covaris Rundbodenröhrchen.
- Scheren die DNA auf der Covaris E220 Instrument bei den folgenden Einstellungen Scher: 360 s bei 10 Tastverhältnis, 175 PIP und 200 Zyklen pro Burst.
- Auftauen AMPure XP Perlen (Tabelle 2) auf Raumtemperatur. Tauen Sie alle buob bietet und Enzyme auf Eis vor dem entsprechenden Schritt.
2. Bibliothek Vorbereitung - End Repair-Modul
- Bereiten Sie das Ende Reparatur Master-Mix in einer sterilen Mikrozentrifugenröhrchen mit den folgenden Bänden pro Probe: 10 ul 10x NEBNext End Repair Reaktionspuffer (Tabelle 2), 5 ul NEBNext End Reparatur-Enzym-Mix (Tabelle 2), 35 ul sterile nucleasefreiem H 2 O.
- Aliquoter Teil, der 50 &mgr; l jeder gescherte DNA in einzelne Wells einer 96-Well-Platte. In 50 ul der vorbereiteten Ende Reparatur Master Mix zu jeder Reaktion. Inkubiere in einem Thermozykler für 30 min bei 20 ° C.
3. Beitrag End Repair Aufräum
- In 2x Volumen (200 ul) AMPure XP Perlen (Tabelle 2) zu jeder Probe und vorsichtig pipettieren, das gesamte Volumen auf und ab 10x mit einer Mehrkanalpipette. Inkubieren bei Raumtemperatur für 15 min.
- Legen Sie auf dem Magnetständer (Tabelle 2
- Vorsichtig entfernen und entsorgen Sie klare Überstand kümmert sich nicht um Perlen zu stören. Einige Flüssigkeit kann in den Vertiefungen bleibt.
- Rohre mit auf dem Stand sanft mit 200 ul frisch hergestellte 80% igem Ethanol zu jeder Probe und inkubiere Platte bei Raumtemperatur für 30 Sekunden. Vorsichtig entfernen Ethanol durch Pipette.
- Wiederholen Sie Schritt 5 für insgesamt 2 Ethanol wäscht. Stellen Sie sicher, alle Ethanol wurde entfernt. Aus dem Magnetständer nehmen und lassen bei RT trocken für 5 min.
- Resuspendieren getrocknet Perlen mit 44,5 ul sterilem H 2 O. Sanft, Pipetten gesamte Volumen auf und ab 10x Durchmischung. Sicherzustellen Perlen sind nicht mehr auf der Seite der Wanne angebracht ist.
- Inkubieren resuspendierten Perlen bei RT für 2 min. Zeigen auf Magnetständer für 5 Minuten, bis die Probe klar erscheint.
- Vorsichtig über 42 ul der klare Überstand, der die Probe auf einen neuen Brunnen.
Das Verfahren kann sicher in diesem st gestoppt werdenep und die Proben bei -20 ° C für bis zu 7 Tage gelagert. Um neu zu starten, Auftauen gefrorenen Proben auf Eis, bevor Sie fortfahren.
4. Bibliothek Vorbereitung - dA-Tailing-Modul
- Bereiten Sie die dA-Tailing Master-Mix in einer sterilen Mikrozentrifugenröhrchen mit den folgenden Bänden pro Probe: 5 ul 10x NEBNext dA-Tailing Reaktionspuffer (Tabelle 2), 3 ul (3'-5'-Exo-) Klenow Fragment (Tabelle 2 ).
- In 8 ul der vorbereiteten dA-Tailing Master-Mix in jede Vertiefung mit 42 ul von End-DNA repariert. Inkubiere in einem Thermozykler für 30 min bei 37 ° C.
- Führen Sie einen Beitrag dA-Tailing clean-up: Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.8 mit 2x Volumen (100 ul) von Perlen, aber resuspendieren in sterilem H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 33,75 ul.
Das Verfahren kann ohne Bedenken bei diesem Schritt und die Proben bei -20 ° C für bis zu 7 Tage gelagert gestoppt werden. Um neu zu starten, Auftauen gefrorenen Proben auf Eis, bevor Sie fortfahren. </ Li>
5. Bibliothek Vorbereitung - Adapter Ligation-Modul
- Bereiten Sie die Ligation Master-Mix in einer sterilen Mikrozentrifugenröhrchen mit den folgenden Bänden pro Probe: 10 ul 5x NEBNext Ligation Schnellreaktionspuffer (New England Biolabs, Tabelle 2), 5 ul Schnell T4 DNA Ligase (Tabelle 2).
- In 15 ul der Ligation Master-Mix in jede Vertiefung, die das dA-Schwanz-DNA.
- In 1,25 ul der entsprechenden 25 uM NEXTflex Barcode-Adapter (Tabelle 2) in jede Vertiefung. Jede Probe sollte eine separate Barcode-Adapter zu erhalten. Inkubiere in einem Thermozykler für 15 min bei 20 ° C.
- Führen Sie einen Beitrag Adaptorligation clean-up: Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.8 mit 1x Volumen (50 ul) von Perlen, aber resuspendieren in sterilem H 2 O auf ein Gesamtvolumen von 50 pl.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.8 für eine zweite 1x Volumen (50 ul) clean-up, aber resuspendieren in sterilem H 2 O, um eineEndvolumen von 23 ul.
Das Verfahren kann ohne Bedenken bei diesem Schritt und die Proben bei -20 ° C für bis zu 7 Tage gelagert gestoppt werden. Um neu zu starten, Auftauen gefrorenen Proben auf Eis, bevor Sie fortfahren.
6. Bibliothek Amplification
- Bereiten Sie die KAPA HiFi Master-Mix in einer sterilen Mikrozentrifugenröhrchen mit den folgenden Bänden pro Probe: 25 ul 2x KAPA HiFi HS RM (Tabelle 2), 1 ul von jeweils 100 uM Primer 1 und Primer 2 (Tabelle 3).
- In 27 ul des Master-Mix in jede Vertiefung, die das Ligationsprodukt. Stellen Pipette pipettieren und 50 ul das gesamte Volumen auf und ab 10x sanft.
- Legen im Thermocycler für folgende PCR-Zyklen: anfängliche Denaturierung 45 s bei 98 ° C, 10 Zyklen von 15 sec bei 98 ° C, 30 sec bei 60 ° C, 30 sec bei 72 ° C und abschließende Extension von 1 min bei 72 ° C.
- Führen Sie einen Beitrag Verstärkung clean-up: Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.8 mit1x Volumen (50 ul) AMPure XP Perlen und Resuspension in sterilem Wasser bis zu einem Endvolumen von 30 &mgr; l.
- Quantifizierung der Konzentration von jeder Bibliothek mit Qubit Breite Palette Assay (Life Technologies, Tabelle 2) nach der Anleitung des Herstellers.
7. Roche NimbleGen SeqCap EZ Bibliothek Hybridisierung, Waschen und Verstärkung
- Tauwetter universelle und Index-Oligonukleotid-Blocker (Tabelle 3), SeqCap EZ Library und Nimblegen Capture-Komponenten (COT DNA, 2x Hybridisierungspuffer und die Hybridisierung Komponente A, Tabelle 2) auf Eis. Alle Oligonukleotid-Blocker werden in Arbeits Aktien von 1 mM gespeichert. Unsere SeqCap EZ Library ist eine maßgeschneiderte Pool von Capture-Sonden, die alle Protein-kodierenden Exons von 279 Krebs-assoziierte Gene, obwohl auch andere kundenspezifische Designs und Katalog verwendet werden.
- Bereiten Sie eine 1 mM Pool von Index-Oligonukleotid-Blocker entsprechend der spezifischen Barcode-AnzeigeAptor Sequenzen in der Bibliothek der Herstellung verwendet. Kombinieren Sie 1 ul jeder Blocker und Wirbel.
- In einer neuen sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen werden 5 ul 1mg/ml COT-DNA, 2 ul 1 mM Universal-Blocker und 2 ul der 1 mM Pool von Index-Oligonukleotid-Blocker.
- Schwimmbad 24 Barcode-Bibliotheken in einer einzigen Reaktion. In insgesamt 1-3 ug vereinigt, Barcode-Sequenz-Bibliothek (oben hergestellt) an die Capture-Mischung. Für 24 Proben wird 100 ng pro Probe empfohlen. Wenn die Bündelung Tumoren und normalen Proben abgestimmt ist, empfehlen wir das Hinzufügen von mehr Tumor Bibliothek (zB 100 ng pro Tumor und 50 ng pro normal), so dass sie eine größere Tiefe der Berichterstattung sind sequenziert.
- Schließen Kappe der Röhre und machen 15-20 Löcher in der Spitze der Kappe mit einem 18-20 G oder kleiner Nadel. Speed Vac die verstärkten Sample Library / COT DNA / Oligos in einem DNA-Vakuum-Konzentrator auf hoher Hitze (60 ° C).
- Einmal ganz nach unten getrocknet, deinen Durst mit 7,5 ul 2x Hybridisierungrung Puffer und 3 ul Hybridisierung Komponente A. Das Rohr sollte nun die folgende: 5 ug COT DNA, variable ug verstärkt Sample-Bibliothek, 1000 pmol von Universal und Index Oligos, 7,5 ul 2x Hybridisierungspuffer, 3 ul Hybridisierung Komponente A in eine Gesamtvolumen von 10,5 ul.
- Bedecken Sie die Löcher in der Kappe mit einem kleinen Stück von Labor-Band. Wirbel die Probe für 10 Sekunden und Zentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 10 Sekunden.
- Inkubieren der Probe bei 95 ° C für 10 Minuten, um die DNA zu denaturieren, gefolgt von einer Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für 10 s bei RT.
- In einem neuen 0,2 ml PCR-Streifen Rohr, bereiten 2,25 ul Aliquot SeqCap EZ Bibliothek Fangsonden und 2,25 ul sterilem nucleasefreiem H 2 O und fügen Sie den Inhalt der Schritt 7.7. Pipette vorsichtig das gesamte Volumen auf und ab 10x.
- Inkubieren in einem Thermocycler bei 47 ° C für 48-96 Stunden. Eingestellt und Deckeltemperatur Thermocycler beizubehalten bis 57 ° C
- FolNieder Schritte in Kapitel 6 des NimbleGen SeqCap EX-Bibliothek SR Benutzerhandbuch v3.0 (Tabelle 2) zum Waschen und Wiederherstellung des aufgenommenen DNA.
- Folgt Schritte in Kapitel 7 der Roche NimbleGen-Protokoll für die Amplifikation des aufgenommenen DNA mit folgenden Änderungen:
- Verwenden Sie 2x KAPA HiFi-Polymerase (Tabelle 2) statt Phusion High-Fidelity PCR Master Mix
- Verwenden von 100 &mgr; M Primer 1 und Primer 2 in Tabelle 3 aufgelistet.
- Laufen die folgenden PCR-Bedingungen: anfängliche Denaturierung bei 98 ° C für 30 sec, 11 Zyklen von 98 ° C für 10 sec, 60 ° C für 30 sec, 72 ° C für 30 sec, und abschließende Extension bei 72 ° C für 5 min . Halten bei 4 ° C.
- Quantifizierung der Konzentration der amplifizierten DNA mit erfasst Qubit High Sensitivity Assay (Tabelle 2) gemß den Anweisungen des Herstellers.
- Analysieren Sie die aufgenommenen DNA-Qualität mit Agilent BioAnalysator DNA HS-Chip (Tabelle 2) gemß den Anweisungen des Herstellers.
- Das PCR-Ausbeute sollte mindestens 100 ng (Bereich 100-1000 ng) sein.
- Die durchschnittliche Fragmentlänge sollte zwischen 150-400 Basenpaare.
8. Hallo Illumina-Seq-Sequenzierung
- Verdünnen Sie die aufgenommenen DNA amplifiziert, um 02.00 Uhr, und laden Sie die Probe auf einer einzigen Spur einer Illumina HiSeq 2000 Durchflusszelle. Sequence paired-Ende 75 Basenpaar liest nach den Anweisungen des Herstellers. Nach unserer Erfahrung ist eine Spur aus, um 500-700x einzigartigen Sequenzabdeckung pro Probe über 279 Gene, die für einen Pool von 24 Proben.
- Illumina-Software (Echtzeit-Analyse) werden Bilder mit hoher Auflösung, um die Cluster-Intensitäten zu konvertieren, um Anrufe und Qualitätswerte zu stützen. Verwenden casava Daten nach Barcode Identität demultiplexieren und erzeugen FASTQ einzelnen Dateien für jede Probe.
9. Daten Anallyse
- Trim-Adapter-Sequenzen vom 3'-Ende der Sequenz liest FASTQ Dateien mit Cutadapt ( http://code.google.com/p/cutadapt/ ). Die minimale Überlappungslänge (-O-) ist 3 mit einer Fehlerrate (-e) von 1%. Die minimale Basislänge für die Beibehaltung der gepaarten liest nach dem Trimmen ist 25.
- Richten Folge liest den Referenz menschlichen Genoms hg19 mit der Burrows-Wheeler-Aligner-Tool (BWA) 12. Führen Nachbearbeitungsschritte einschließlich doppelte Kennzeichnung, lokale multiplen Sequenz-Neuausrichtung und Grundqualität Punktzahl Neukalibrierung mit Hilfe der Genomanalyse Toolkit (GATK) nach ihrer Standard-Best Practices ( http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic? name = Best-Practices ) 13. Beim Profiling mehrere Proben von dem gleichen Patienten (z. B. abgestimmt Tumor und normal), sollten die lokalen multiplen Sequenz Neuausrichtung leistungs seinMED gemeinsam. Die Ausgabe dieser Nachbearbeitungsschritte ist eine separate BAM-Datei für jede Probe, die alle Folge, Qualität und Ausrichtung Informationen enthält, und kann direkt in die Integrative Genomics Viewer (IGV) zur Visualisierung von Lese-und Sequenzvarianten 14 geladen werden.
- Berechnen Sequenz Performance-Metriken mit Picard-Werkzeuge ( http://picard.sourceforge.net/ ). Informative Metriken sind Ausrichtung Rate Bruchgrößenverteilung, GC-Gehalt verbunden Deckung Bias, On-Target-Capture Spezifität PCR doppelte Rate, Bibliothek Komplexität und meine Zielabdeckung. Repräsentative Werte sind in Abbildung 1 dargestellt. Allelfrequenzen bei gemeinsamen Polymorphismusorten berechnet DepthOfCoverage von GATK werden verwendet, um Verunreinigungen von nicht verwandten DNA zu überwachen und sicherzustellen, dass die jeweiligen Proben von denselben Patienten kamen.
Die folgenden Computeranalysen sind abhängig von der Gegenwart von passTumor-und normalen Proben für den Nachweis von somatischen genetischen Veränderungen. Unübertroffene Tumoren kann auch unter Verwendung eines separaten normalen Kontrollprobe analysiert werden, aber die meisten somatischen Mutationen können nicht leicht von ererbten Sequenzvarianten unterschieden werden. - Rufen somatischen Einzel-Nukleotid-Varianten (SNVs) für jeden Tumor-normales Paar mit einem somatische Mutation Anrufer, wie muTect 15, SomaticSniper 16 oder 17 Strelka. Wir verwenden muTect mit modifizierten Filterkriterien, so dass für Varianten mit niedriger (nicht Null) Allel zählt in der normalen Probe, solange die Allelfrequenz mindestens 5fach größer in den Tumor. Varianten immer wieder in einem Panel von normalen DNAs genannt werden so wahrscheinlich systematische Artefakte der Sequenzierung oder Ausrichtung entfernt. Jeder SNV vorbei Filter wird dann vorsichtig mit IGV prüft.
- Rufen somatischen indels für jeden Tumor-normales Paar durch Algorithmen wie SomaticIndelDetector 13, Dindel 18 oder 19 SOAPindel
- Extrapolieren Kopienzahl-Status von der Sequenzabdeckung bei Ziel Exons. Für jede einzelne Probe, führen Sie eine Löss Normalisierung der mittleren Sequenzabdeckung für alle Ziel Exons, Regression über GC Prozentsatz. Stellen Sie die nicht-normierte Deckungswerte durch Subtraktion der Löss-Passform und Zugabe der Probe weite Median Abdeckung. Berechnen des Verhältnisses des normalisierten Sequenzabdeckung über alle Ziel Exons für Tumor-normal-Paaren. In Abwesenheit eines passenden normalen Probe und / oder Rauschen zu verringern, andere geschlechtsspezifische diploidennormalen Kontrollen fehlt Keimbahn-Kopienzahl-Varianten verwendet werden. Bestimmen Sie somatischen Kopienzahl Gewinne und Verluste, die auf Zu-oder Abnahmen in der Deckungsgrad.
- Nennen somatischen Umlagerungen mit Krebsgenen, wobei mindestens ein Haltepunkt in der genomischen oder um gezielt Intervall des Genoms fällt. Empfohlene Algorithmen gehören GASV 20, 21 Breakdancer, CREST 22 und 23 Dranger. Intrachromosomalen Inversionen, Deletionen und Duplikationen Tandem kann basierend auf der relativen Position und Orientierung der Stütz in diskordanten Paaren liest unterscheiden. Alle Beitritts Umlagerungen sollte manuell mit IGV prüft werden. Wir empfehlen experimentellen Validierung von PCR-und Sanger-Sequenzierung über die mutmaßlichen Umlagerung Haltepunkte.
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Representative Results
Ein Pool von 24 Bibliotheken mit Barcode-Sequenz (12 Tumor-normal-Paare) wurde mit Sonden, die allen Protein-kodierenden Exons von 279 Krebs-Gene erfasst und sequenziert, wie 2 x 75 bp liest auf einer einzigen Spur einer HiSeq 2000 Durchflusszelle. Tumor-und Normal Bibliotheken wurden in einem Verhältnis von 2:1 vereinigt. Beispiel Performance-Metriken für einen Pool von gefrorenen Tumor DNA-Proben sind in Abbildung 1 dargestellt, einschließlich Ausrichtung Rate Bruchgrößenverteilung, On-Target-Capture-Spezifität und meine Zielabdeckung. Beispiel somatische Mutationen sind Insertionen, Deletionen und Kopienzahl Veränderungen in den Abbildungen 2-4 dargestellt.
Fig. 1 ist. Repräsentative Zahlen der Sequenz Performance-Metriken. a) Cluster-Dichte und Ausrichtung Frequenz, b) meine Zielabdeckung,
2. Integrative Genomics Viewer (IGV) Bild, das Besonderheit des Sequenzabdeckung bei Exons des EGFR in einer Lungenkrebs-(oben) und abgestimmt normalen Gewebe (unten). Graue Balken repräsentieren einzigartige Sequenz liest. Zu Recht, ist eine heterozygote T> G Mutation in 24% der liest im Tumor und 0% der liest in der normalen, die anzeigt, dass es eine somatische L858R Aminosäuresubstitution vorhanden. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
3 "fo: content-width =" 6in "src =" / files/ftp_upload/50710/50710fig3.jpg "width =" 600px "/>
3. Beispiele für indels in einer Darmkrebs-Tumor normales Paar:.. A) Somatische Frame Einsetzen in APC b) Somatische Frame Löschung von sieben Basenpaaren in TP53 Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
4. Kopienzahl Veränderungen in einem Tumor-normales Paar. Jeder Datenpunkt repräsentiert ein einzelnes Exon von 279 Zielgene. Kopienzahl Gewinne und Verluste aus Erhöhungen abgeleitet und nimmt in Tumorsequenzabdeckung. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Tabelle 1: Probe Konstruktionsmerkmale für Target Capture.
| Insgesamt Exons | 4535 |
| Insgesamt Introns | 14 |
| SNPs * | 1042 |
| Gesamtzielgebiet | 879.966 Basenpaare |
| Insgesamt Sonde Gebiet | 1.400.415 Basenpaare |
Tabelle 2. Reagenzien und Kits.
| Name desReagenz / Material | Firma | Katalognummer |
| NEBNext End Repair-Modul | New England Biolabs | E6050L |
| NEBNext dA-Tailing-Modul | New England Biolabs | E6053L |
| NEBNext Schnellligation-Modul | New England Biolabs | E6056L |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | |
| NEXTflex PCR-Free Barcodes - 24 | Bioo Scientific | 514103 |
| HiFi-Bibliothek Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridisierung und Wasch Kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 |
| SeqCap EZ Bibliothek Köder | Roche NimbleGen | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 |
| Agilent DNA Kit HS | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | |
| Covaris E220 | Covaris | |
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 |
| Hallo Illumina-Seq 2000 | Illumina |
Tabelle 3. Index Oligo-Blocker & Primer Sequenzen.
| TS-HE Universal-Blocker | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-Index 1 HE-Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-Index 3 HE-Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-Index 4 HE-Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-Index 5 HE-Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-Index 6 HE-Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 7 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 8 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE Index 9 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-Index 10 HE Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-Index 11 HE Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-Index 12 HE Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-Index 13 HE Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-Index 14 HE Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-Index 15 HE Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-Index 16 HE Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE-Index 18 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE-Index 19 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-Index 20 HE Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE-Index 21 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE-Index 22 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE-Index 23 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE-Index 25 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| TS-INV-HE-Index 27 Blocker | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT |
| Primer 1 | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCT-3 ' |
| Primer 2 | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-3 ' |
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Discussion
Unsere IMPACT-Assay erzeugt eine hohe Rate Ausrichtung, hoch auf-Zielrate, hohe Zielabdeckung und hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Mutationen, indels, und Nummer des Exemplars Veränderungen. Wir haben die Leistungsfähigkeit unserer IMPACT-Assay auf DNA-Sequenz sowohl von frisch gefrorenem nachgewiesen und archiviert FFPE-Proben niedriger DNA-Eingang. Mit der Durchführung ziel Exon-Sequenzierung der wichtigsten Krebs-assoziierte Gene, kann man sehr tief Sequenzabdeckung für die Exons dieser kritischen Gene dadurch die Fähigkeit, niedrige Frequenz Mutationen erkennen Maximierung zu erreichen. Die Verwendung von Barcode-und Multiplex ermöglicht einen höheren Durchsatz, niedrigere Kosten pro Probe und niedriger Eingangs DNA-Mengen.
Ein Vorteil der gezielten Ansatz ist, dass es möglich ist, zu optimieren Capture-Sonden, so daß alle Exons sind gleichmäßig und ausreichend für die Detektion von Mutationen bedeckt. Wie in Tabelle 1 gezeigt, umfasst unser Design 4535 Exons in 279 Genen. Folgende iterative Verbesserungenunsere Konstruktion, ein typisches Sequenzierexperiment erzeugt nicht mehr als 2% der Exons auf weniger als 20% des mittleren Dichte für die gesamte Probe. So kann der Tumor nicht 500x Sequenzabdeckung (eine konservative Schätzung, wie in 1 dargestellt) sequenziert,> 98% der Exons werden durch> 100x Tiefe abgedeckt werden, garantieren hohe Empfindlichkeit für niedrige Frequenz Mutationen identifiziert. Diese Gleichförmigkeit der Abdeckung ist im Wesentlichen auf die Flexibilität der Nimblegen SeqCap System, wo Sonden können auf unterschiedliche Längen in verschiedenen Regionen der Nukleotid-Zusammensetzung synthetisiert werden, zugeschrieben werden. Wir haben auch erfolgreich individuell synthetisiert biotinylierten Oligonukleotide von Integrated DNA Technologies (IDT) verwendet werden, um neue Inhalte auf unserem Panel hinzuzufügen und die Abdeckung von Regionen, die schwer zu erfassen und / oder Sequenz zu steigern. Durch die Erfassung auch wählen Introns immer wieder neu angeordnet Gene sind wir in der Lage, strukturelle Umlagerungen Herstellung von Fusionsgene zu identifizieren, auch wenn nur eine Fusion Partner aufgenommen wird.
Diese gezielte Sequenzierung Ansatz nicht besitzt zwei Haupt Einschränkungen in der Fähigkeit, "Fahrer" genetischen Veränderungen in Tumoren zu erkennen. Zuerst wird nur ein Bruchteil des Genoms abgefragt. Gezielte Sequenzierung ist von Natur aus begrenzt. Als neue Krebsgene ergeben sich aus systematischen Genomforschung Bemühungen, können sie schnell zu einer Aufnahmeplatte hinzugefügt werden, aber funktionell wichtigen Mutationen verpassten, die von Gesamtgenom-Sequenzierung oder ganze exome erkannt werden würde. Zweitens ist es beschränkt sich auf DNA-basierte Änderungen vorbehalten. Der Nachweis von aberrant exprimierten Transkripte, Roman Spleiß-Isoformen und-Fusionen erfordert RNA-Seq oder ähnlichen Techniken 24. Epigenetische Veränderungen, die Chromatin-Modifikationen und DNA-Methylierung kann auch eine wichtige Rolle spielen bei der Tumorentstehung und Tumorprogression. Als Sequenzierungstechnologien weiter zu verbessern, kann man sich vorstellen, integrierte Strategien beschäftigt ganze Genom-Sequenzierung, RNA-Seq und ergänzende approaches umfassend zu charakterisieren die genetischen und epigenetischen Make-up der einzelnen Tumoren auf einer Routinebasis 25. Als vollständig integrierte Strategien sind derzeit kosten-und rechen unerschwinglich, gezielte Sequenzierung stellt eine praktische Alternative, um die hervorstechenden Merkmale genomische für klinische und translationale Anwendungen zu erfassen.
Unser Protokoll nimmt an, dass Tumoren neben abgestimmt normales Gewebe von dem gleichen Patienten entnommen sequenziert. Der Zweck dieser normalen Steuerung ist, um zu bestimmen, ob Sequenzvarianten im Tumor nachgewiesen werden vererbt oder erworben somatisch. In Abwesenheit eines passenden normalen, kann man ableiten, dass bei Mutationsvarianten Hotspots (dh Stellen der wiederkehrenden somatischen Mutationen in anderen Krebsarten) sind wahrscheinlich auftretenden somatischen sein. Weiterhin kann die Analyse der Kopienzahl Gewinne und Verluste mit einem nicht-genetisch angepasst diploiden normalen Probe durchgeführt werden. Für alle anderen neuartigen genetischen Veränderungen, die gleichzeitigAnalyse von Organisationseinheiten abgestimmt normalen Gewebe die Interpretation der resultierenden Mutation Daten erheblich vereinfacht und ist sehr empfehlenswert.
Die hier beschriebene IMPACT-Protokoll zeigt, Konsistenz und hohe Qualität und Leistung für die eingefrorenen Proben. Wir haben gelegentlich Variabilität beobachtet, wenn die Arbeit mit FFPE-Proben, though. Je nach Alter und Qualität des FFPE-Proben kann die DNA stark abgebaut oder chemisch modifiziert werden, und als Ergebnis kann die Sequenzierung und-Analyse schwierig 26 übertragen. Davon abgesehen, haben wir diese Versuchsbedingungen zuverlässig für die große Mehrheit der FFPE-Proben zu sein, gefunden. Wir haben auch dieses Protokoll erfolgreich angewendet, um andere klinisch relevante Proben wie Biopsien, Feinnadelaspirate und zytologischen Proben zu charakterisieren. Es ist aus diesem Grund-die Flexibilität, verschiedene Arten von Proben von unterschiedlicher Qualität, Menge und Heterogenität-Platz, dass diese Methode, um die Diagnose steht ein schlagd Behandlung von Krebspatienten im klinischen Bereich.
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Disclosures
Dr. Berger hat Beratungshonorare und Forschungsförderung von Foundation Medicine, einer Krebsdiagnostik-Unternehmen erhalten.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Agnes Viale und die MSKCC Genomics Core-Labor für technische Hilfe. Dieses Protokoll wurde mit Unterstützung der Geoffrey Beene Krebsforschungszentrum und dem Farmer-Familien-Basis entwickelt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
References
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