Biz Barkodlanan DNA kütüphaneleri ve büyük ölçüde paralel "yeni nesil" dizisi ile klinik tümör numunelerinde önemli kanserle ilişkili mutasyonların saptanması için olan hibridizasyon-bazlı sonraki ekson yakalama hazırlanmasını tarif etmektedir. Hedefli ekson dizileme nedenle düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için yüksek duyarlılık verimli, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve derin dizisi kapsama avantajlar sunmaktadır.
Anahtar onkojenik mutasyonları tespit ve araştırmak için çabalar kanser hastaları için uygun tedaviyi kolaylaştırmak değerli kanıtlanmıştır. Yüksek verimlilik kurulması, kitlesel paralel "yeni nesil" dizileme gibi pek çok mutasyonların keşif destekli vardır. Bu teknolojinin klinik ve yorumsal programını geliştirmek için, platformlar, yüksek verimlilik, maliyet-etkin, ve bozulmuş veya hasar görmüş DNA'nın küçük miktarlarda verim olabilir (FFPE) doku örnekleri gömülü formalin ile fikse parafin ile uyumlu olmalıdır. Burada, büyük ölçüde paralel dizilemesi ile taze, dondurulmuş ve FFPE tümörlerde kanserle ilişkili mutasyonların saptanması için hedeflenen eksondan olan hibridizasyon-bazlı yakalama ardından Barkodlanan ve birden fazla mesaj göndermiş DNA kütüphanelerinin hazırlanmasını tarif etmektedir. Bu yöntem, dizi mutasyonların tanımlanmasını sağlayan numara değişiklikleri kopyalamak ve hedeflenen tüm genleri içeren yapısal yeniden düzenlenmeleri seçin. Hedefli ekson dizileme t sunuyorO nedenle düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için yüksek duyarlılık kazandırmak, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve derin dizisi kapsama yararlanır.
Anahtar onkogenler ve tümör baskılayıcı genler "sürücü" tümör genetik olayların tanımlanması birçok kanser 1'in tanı ve tedavisinde önemli bir rol oynar. Kitlesel paralel "yeni nesil" sıralamasını kullanan büyük ölçekli araştırma çabaları son yıllarda 2 gibi pek çok kanser ilişkili genlerin belirlenmesini sağlamıştır. Bununla birlikte, bu dizilim, genellikle bu nedenle bu tür platformlar (FFPE) tümör örnekleri gömülü formalinle sabitlenmiş parafin gibi korunmuş dokulardan DNA mutasyonlarının karakterize ve analiz önemli bir sınırlama poz dondurulmuş dokulardan izole DNA büyük miktarlarda gerektirir. Verimli ve güvenilir FFPE tümör örneklerinden "eyleme" genomik bilgilerini karakterize etmek için geliştirilmiş çabalar önceden saklanmış örneklerin retrospektif analizini sağlayacak ve daha fazla kanser yönetimine bireysel yaklaşımları teşvik edecektir.
Geleneksel olarak, moleküler diagnostic laboratuarlar, DNA mutasyon profilleme için Sanger dizileme ve gerçek-zamanlı PCR gibi zaman alıcı, düşük hacimli metodolojileri yararlanmıştır. Daha yakın bir zamanda, çok katlı PCR veya kütle spektroskopisi genotipleme kullanan daha verimli yöntemler anahtar kanser genlerinin 3-5 tekrarlayan somatik mutasyonları incelemek için geliştirilmiştir. Bu yaklaşımlar, ancak, sadece önceden belirlenmiş bir "sıcak nokta" mutasyonlar tümör baskılayıcı genlerin in etkisiz mutasyonları tespit etmek için uygun olmayacak hale getirmeyecek, tahlil edilir olması ile sınırlıdır. Devasa paralel dizilim yaygın ve nadir iki mutasyonlar için tüm eksonları sorgulamak için yeteneği, böyle bir kopya sayısı karı ve zararı olarak genomik değişiklikler ek sınıfları ortaya çıkarmak için yetenek ve heterojen örnekleri 6, daha yüksek algılama hassasiyeti dahil olmak üzere bu stratejileri üzerinde çeşitli avantajlar sunuyor 7 . Göreceli olsa tüm genom dizileme, mutasyon keşif için en kapsamlı yaklaşımı temsilly pahalı ve veri analizi ve depolama için büyük hesaplama talepleri doğurur.
Genomunun sadece küçük bir kısmı klinik ilgisini çekebilir klinik uygulamalar için, dizileme teknolojisindeki iki özel yenilikler dönüştürücü olmuştur. İlk olarak, hibridizasyon-bazlı exon yakalama ile, bir, hedefli mutasyon profil 8 için önemli kanserle ilişkili genlere karşı gelen DNA izole edebilir. İkincisi, moleküler barkod (yani DNA dizileri uzunluğunda 6-8 nükleotid) ligasyonu ile, bir sıralama çalışma başına örneklerin yüzlerce havuz ve tam kitlesel paralel dizilim araçların 10 artan kapasitesi yararlanmak. Kombine edildiğinde, bu yenilikler küçük hesaplamalı gereksinimleri 11 ile, düşük maliyet için profilli olması tümörleri sağlamak ve daha yüksek debisinde. Bundan başka, özel bir uygulama için en önemli yalnızca genlerle olan sekans kapsama tekrar dağıtarak, tek bir achie olabilirdüşük allel sıklığı olaylar için daha yüksek algılama hassasiyeti için daha fazla sıralama derinliği ettik.
İşte biz (tüm protein kodlayan ekzon yakalamak ve 279 anahtar kanserle ilişkili genlerin intronlan seçmek için özel oligonükleotidler kullanarak melezleme ile barkodlu sıra kütüphane havuzları ekson yakalama kullanır bizim ETKİ tahlili (Actionable Kanser Hedefler Entegre Mutasyon profil), tarif Tablo 1 .) Bu strateji mutasyonlar, indellerin, kopya sayısı değişikliklerin belirlenmesini sağlar ve bu 279 geni içeren yapısal yeniden düzenlenmeleri seçin. Bizim yöntem taze, dondurulmuş ve FFPE dokusu yanı sıra ince iğne aspiratları ve diğer sitoloji örneklerinde hem de izole edilen DNA ile uyumludur.
Bizim ETKİ tahlil yüksek uyum oranı, yüksek on-hedef oranı, yüksek hedef kapsama alanı ve algılama mutasyonlar, indellerin ve numara değişiklikleri kopyalamak için yüksek duyarlılık üretir. Biz taze dondurulmuş hem dizisi DNA'ya bizim ETKİ tahlil yeteneği gösterdi ve düşük DNA girdi FFPE örnekleri arşiv var. Anahtar kanserle ilişkili genlerin hedef sıralama yapılarak ekson, bir böylece alçak frekans mutasyonları tespit etmek için yeteneğini maksimize bu en önemli genin ekson dizisi i…
The authors have nothing to disclose.
Biz teknik yardım için Dr Agnes Viale ve MSKCC Genomik Çekirdek Laboratuvarı teşekkür ederim. Bu protokol Geoffrey Beene Kanser Araştırma Merkezi ve Çiftçi Aile Vakfı desteği ile geliştirilmiştir.
NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
Covaris E220 | Covaris | ||
Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |