Summary
Los receptores tirosina quinasas se expresan ectópica en muchos tipos de cáncer y han sido identificados como dianas terapéuticas en leucemia aguda. Este manuscrito describe una estrategia eficiente para la evaluación pre-clínica de inhibidores de tirosina quinasa para el tratamiento de la leucemia aguda.
Abstract
Los receptores de tirosina quinasas han sido implicados en el desarrollo y progresión de muchos tipos de cáncer, incluyendo tanto la leucemia y tumores sólidos, y son dianas terapéuticas druggable atractivos. Aquí se describe una estrategia de cuatro pasos eficiente para la evaluación pre-clínica de los inhibidores de tirosina quinasa (TKIs) en el tratamiento de la leucemia aguda. Inicialmente, el análisis de transferencia Western se usa para confirmar la inhibición de destino en células de leucemia cultivadas. La actividad funcional se evaluó después usando ensayos clonogénicos en metilcelulosa o cultivos de agar blando. Compuestos experimentales que demuestran la actividad en ensayos de cultivo de células se evaluaron in vivo utilizando ratones NOD-SCID-gamma (GSN) los ratones trasplantados ortotópicamente con líneas celulares de leucemia humana. In vivo estudios farmacodinámicos iniciales evaluar la inhibición de destino en blastos leucémicos aisladas de la médula ósea. Este enfoque se utiliza para determinar la dosis y pauta de administración requerida para la inhibición eficaz objetivode iones. Estudios posteriores Evaluar la eficacia de la TKIs en vivo utilizando luciferasa que expresan las células de leucemia, permitiendo de este modo para la supervisión bioluminiscente no invasiva de la carga de la leucemia y la evaluación de la respuesta terapéutica in vivo usando un sistema de imágenes de bioluminiscencia en. Esta estrategia ha sido eficaz para la evaluación de TKIs in vitro e in vivo y puede ser aplicado para la identificación de agentes dirigidos molecularmente con potencial terapéutico o para la comparación directa y la priorización de múltiples compuestos.
Introduction
La leucemia linfoblástica aguda (LLA) es la neoplasia maligna más frecuente en los niños 1,2. La tasa de supervivencia general de los casos de LLA pediátrica de linaje B (B-ALL) es de aproximadamente 85%, pero los subtipos biológicos específicos, entre ellos T-LLA de linaje (LLA-T), que el pronóstico sigue siendo pobre, incluso con protocolos terapéuticos actuales. El tratamiento posterior de la LLA recidivante sigue siendo un desafío 3. Aunque la mayoría de los pacientes adultos con leucemia aguda lograr una remisión con quimioterapia por adelantado, muchos pacientes todavía sufren recaídas 4. Regímenes quimioterapéuticos actuales en el tratamiento de la leucemia aguda son conocidos por causar efectos secundarios a corto y largo plazo de toxicidad asociada. Por lo tanto, las terapias menos tóxicas que atacan específicamente las células cancerosas con un efecto mínimo sobre los tejidos normales son muy necesarios. En los últimos años, se ha puesto énfasis en el desarrollo de la novela, agentes molecularmente orientados con especificidad para las células cancerosas, a menudo utilizando la química iterativapara generar múltiples compuestos activos que luego deben ser comparadas y priorizaron 5. Este manuscrito describe una estrategia eficiente para la evaluación preclínica de ITC para el tratamiento de la leucemia aguda, que puede ser utilizado para la evaluación de un único compuesto o para la comparación directa de múltiples compuestos con el fin de facilitar el desarrollo de fármacos.
El método presentado aquí consta de cuatro pasos. En primer lugar la bioquímica (1) y anti-leucemia (2) las actividades de los compuesto (s) se evalúan en cultivo celular, a continuación, la inhibición de la diana se confirma en modelos animales (3), y, finalmente, la eficacia terapéutica de la TKI (s) se determina en modelos de xenoinjerto de leucemia ortotópico (4). Para estos estudios, es importante elegir líneas celulares pertinentes, que son representantes de los subtipos biológicos más comunes. Las líneas celulares se deben seleccionar, que tanto, expresan la diana de interés y carecen de la diana de interés, para investigar si los efectos biológicos están medIATED por la inhibición de la diana. Esto es particularmente relevante para el desarrollo de inhibidores de moléculas pequeñas, que tienen fuera de objetivo efectos que pueden ser importantes para la actividad anti-tumoral. También es necesario escoger una línea celular que es dependiente de la diana para los efectos funcionales, tales como la proliferación o la supervivencia. Estudios de validación de destino preliminares (fuera del alcance de este artículo) utilizando la interferencia de ARN u otros medios específicos para inhibir el objetivo se pueden utilizar para identificar líneas de células dependiente de la diana. También es deseable elegir líneas celulares que pueden formar xenoinjertos murinos, de tal manera que los resultados del cultivo celular puede ser más directamente traducido a experimentos in vivo.
Para la evaluación de la actividad bioquímica mediada por TKIs en células de leucemia, una disminución en la fosforilación del receptor se puede utilizar como un indicador de inhibición de destino. Ensayos de análisis de transferencia de Western o ELISA se pueden emplear, dependiendo de la disponibilidad y la especificidad de los anticuerpos.Si los anticuerpos con especificidad suficiente para el objetivo están disponibles, ensayos de ELISA son preferibles ya que son más cuantitativa y eficiente. En los casos en que los anticuerpos con especificidad suficiente para ELISA no están disponibles, el análisis de transferencia Western puede ser necesario. En este caso, la inmunoprecipitación de una gran cantidad de lisado puede ser útil para la detección de objetivos que están en baja abundancia. Este enfoque es particularmente relevante para la medición de fosfo-proteínas, que pueden tener una vida media corta para permitir cambios rápidos en la señalización en respuesta a los estímulos ambientales. Algunas proteínas fosforiladas son extremadamente lábil, muy probablemente como resultado de la formación de complejos con fosfatasas. Para la detección robusto y consistente de estas proteínas fosforiladas, también puede ser posible para el tratamiento de las células con pervanadato, un inhibidor de la fosfatasa de la proteína tirosina irreversibles 6, para estabilizar el fosfato proteína antes de la preparación de lisados de células enteras.
Adeterminar si la actividad bioquímica resulta en efectos anti-tumorales, procesos biológicos dependiente de la diana se pueden monitorizar en experimentos basados en células. Para las líneas celulares de leucemia, actividad anti-leucemia mediada por TKIs se puede evaluar usando ensayos de formación de colonias realizadas en metilcelulosa o agar blando 7. Agar blando puede ser preferible, ya que es un medio sólido que es más susceptible a la manipulación, si es necesario un tratamiento repetido con un TKI. Mientras que muchas líneas celulares de leucemia aguda myloid (LMA) formarán colonias en agar blando, la mayoría de todas las líneas celulares solo se forman colonias en metilcelulosa, que es un medio semi-sólido. Aunque es posible para refrescar medio y / o TKIs en cultivos de metilcelulosa, sólo pequeños volúmenes se pueden utilizar y con frecuencia limitada. Del mismo modo, es más difícil para teñir colonias sin interrumpir en metilcelulosa. Los estudios preliminares deben definir la capacidad de líneas de células apropiadas para formar colonias en metilcelulosa y / o agar blando y Tque la densidad óptima de células en cultivo tales que las colonias no se solapan y en número suficiente para obtener datos estadísticamente relevantes (normalmente 50-200 colonias por placa de 35 mm).
Mientras que los ensayos in vitro son robustos y rentables, y tienen menos consecuencias éticas que los experimentos con animales enteros, el avance de los compuestos terapéuticos requiere prueba de eficacia y seguridad en modelos animales. Para los estudios in vivo, las líneas celulares de leucemia aguda humanos pueden ser trasplantadas en ortotópicamente NOD.Cg-Prkdc SCID I l2rg tm1Wjl / SZJ (GSN) ratones y TKIs se pueden administrar fácilmente por inyección o una sonda nasogástrica. Algunas líneas celulares pueden requerir la exposición de ratones sin garantía soberana a una dosis baja de línea celular dependiente de la radiación con el fin de xenoinjertos de establecer, y en este caso los ratones no pueden tolerar la alimentación oral forzada sin un período de recuperación de 5 a 10 días después de la irradiación. Este manuscrito describe la generación de B-ALL y T-ALL xenoinjertos utilizandolíneas celulares específicos (697 y Jurkat) como ejemplos, pero pueden establecerse xenoinjertos en ratones GSN utilizando una amplia variedad de líneas celulares. En el caso de que otras líneas celulares son más aplicables, el requisito para la irradiación, el número óptimo de células a trasplante, y el momento de aparición de la enfermedad y la progresión se debe determinar experimentalmente. Idealmente, estos modelos tendrán penetrancia completa (cada animal trasplantado desarrolla la leucemia), la cinética consistentes (leucemia progresa de manera similar en todos los animales), y una ventana de tratamiento razonable (idealmente 20-30 días entre el inicio del tratamiento y la eliminación del estudio debido a la enfermedad) . El número de células trasplantadas se puede aumentar para mejorar la penetración y la consistencia cinética o disminuye para mejorar la ventana de tratamiento si es necesario.
Para determinar si TKIs median la inhibición diana in vivo, las muestras se obtuvieron de ratones con xenoinjertos de leucemia después del tratamiento con ITC o sólo vehículo. Idealmente, la una dosisd programa de administración para estos experimentos se guían por los estudios farmacocinéticos, que a menudo pueden ser realizados por laboratorios comerciales y están fuera del alcance de este artículo. Si se dispone de datos farmacocinéticos, la concentración de compuesto requerida para la inhibición eficaz objetivo en cultivo de células y la concentración máxima en suero después de una única dosis de TKI se puede utilizar para definir una dosis de partida para los estudios en animales. Los estudios farmacocinéticos también pueden informar al momento de la recolección de la muestra después del tratamiento para los estudios farmacodinámicos y la vía de administración. La inhibición de la diana puede evaluarse en cualquier órgano afectado, pero los tejidos que se recolectan y procesan con mayor facilidad son preferibles. Líneas celulares de leucemia más agudos establecen en el hígado, médula ósea, bazo, sangre periférica, y el sistema nervioso central, aunque los órganos específicos afectados y el grado de injerto en estos órganos varía entre modelos. El protocolo presentado aquí evalúa fosfinhibición o-proteína en la médula ósea utilizando análisis de transferencia de Western, pero órganos sólidos pueden ser más fáciles de cosechar constantemente y requieren un procesamiento mínimo o nada de antes de la congelación, lo que permite menos oportunidad para la degradación de fosfo-proteínas durante la recogida y procesamiento de la muestra. La inmunohistoquímica también se puede utilizar para evaluar tumores sólidos o órganos afectados por la leucemia.
Finalmente, la eficacia terapéutica de la TKI (s) se determina en modelos de xenoinjerto de leucemia ortotópico. Para estos estudios, el momento de inicio del tratamiento puede variar, de modo que la enfermedad está más o menos establecido. El tratamiento puede comenzar inmediatamente después del trasplante para los estudios iniciales y luego se retrasó en estudios posteriores hasta que se detecta la carga de morbilidad significativa para aproximarse más a un modelo de tratamiento de diagnóstico. Idealmente, estos modelos animales también tienen la capacidad para la medición no invasiva de la carga de morbilidad. Hemos optimizado los métodos de introducción de la lucifer luciérnagaASE gen en líneas celulares de leucemia utilizando partículas similares a virus, lo que permite el análisis no invasivo, longitudinal de inicio de la enfermedad y la progresión y la evaluación de la carga de la enfermedad en la médula ósea y los órganos sólidos. Fundamental para este enfoque es el uso de líneas celulares de luciferasa-etiquetados monoclonales para evitar la variabilidad en el desarrollo de la leucemia que expresan luciferasa asociado con el uso de líneas celulares policlonales y no está relacionado con el tratamiento con un TKI 8.
Tomados en conjunto, estos pasos se pueden utilizar para la evaluación de una sola TKI o para la comparación directa y la clasificación de múltiples TKIs. Mientras que los protocolos presentados aquí se centran en el desarrollo de TKIs, estos métodos se pueden adaptar a otros objetivos y consideraciones para el desarrollo del ensayo se describen. Por lo tanto, esta estrategia puede ser más ampliamente aplicable a la evaluación pre-clínica de agentes dirigidos molecularmente para el tratamiento de la leucemia aguda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los experimentos con animales siguen las normas reglamentarias aprobadas por la Universidad de Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Colorado. El protocolo fue aprobado demostrado por la Universidad de Comité de Cuidado de Animales y el empleo Institucional Colorado.
1. Fosfato proteína Western Blot
- Preparación de lisados
- Líneas celulares que expresan la cultura de la tirosina quinasa del receptor de interés. Las células de la cosecha y la placa de 3-5 x 10 6 células / muestra en el medio de cultivo de 400 l en un 48 pocillos placa de cultivo de tejidos. Incubar a 37 ° C en 5% de CO 2 durante 2-3 h.
- Añadir 100 l de solución de 5x TKI en medio de cultivo y se incuba durante 60 min.
- Preparar tampón de lisis con 50 mM de HEPES (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, 10% (v / v) de glicerol, 1% (v / v) de Triton X-100, y los inhibidores de la proteasa. Si los cultivos no serán tratados con pervanadato antes de la cosecha, añadir inhibidores de la fosfatasa (orthova de sodio 1 mMnadate y 0,1 mM de molibdato de sodio) al tampón de lisis.
- Preparar pervanadato (PV) solución de inhibidor de la fosfatasa inmediatamente antes de su uso. Prepare una solución de 0,3% de peróxido de hidrógeno (PRECAUCIÓN) en frío-buffer fosfato salino (PBS) en un tubo oscuro en el hielo (1:100 dilución de una solución madre al 30%). Hervir una alícuota de 0,2 M ortovanadato de sodio (OV, PRECAUCIÓN) solución madre durante 5 min. Diluir 1:10 en PBS para hacer una solución 20 mM de VO a temperatura ambiente (RT). Mezcle de peróxido de hidrógeno 0,3% y 20 mM de VO 1:01 y se incuba en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 min.
- Diluir PV en medio completo (60 l PV + 940 l medio). Añadir 100 l de diluirse PV / pocillo. Se incuba a 37 ° C en 5% de CO 2 durante 3 minutos y luego coloque la placa sobre hielo.
- Recoger las células en tubos de microcentrífuga fríos a 2.500 rpm durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 120 l de tampón de lisis. Incubar en hielo durante 15 min. Aclarar el lisado en una microfuga en frío a 6000 rpm durante 3 min. Traslado supernatant a un tubo frío fresco. Almacenar a -80 ° C.
- La inmunoprecipitación
- Decantar proteína G Sepharose bolas en microcentrífuga a 1000 rpm durante 1 min. Aspirar el sobrenadante y lavar los granos 2X con 1 ml de PBS frío. Añadir un volumen igual de PBS para hacer una suspensión al 50%. Añadir anticuerpo primario y 20 l 50% de proteína G bolas a cada muestra. Incubar durante 2 horas - O / N a 4 ° C en un rotador.
- Pulso por bolas en una microcentrífuga frío a 9.000 rpm. Aspirar el sobrenadante y lavar los granos 2X con 150 l de tampón de lisis frío. Gira en microfuga en frío a 1000 rpm durante 1 min. Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en 20 l de 2X SDS Sample Buffer con 2-mercaptoetanol (PRECAUCIÓN). Utilizar inmediatamente o almacenar a -80 ° C.
- Muestras Hervir durante 5 minutos y se ejecutan en un gel-tris glicina SDS-PAGE. Transferencia de las proteínas a una membrana de nitrocelulosa y detectar fosfato proteína mediante inmunotransferencia de tipo Western.
- Enjuague blot con agua y luego incubar en 2% de SDS, 62,5 mM de Tris (pH 6,8), 0.1 M β-mercaptoetanol (PRECAUCIÓN) durante 30 min a 50 ° C. Enjuague 2x con agua y lavar para 60-90 min en 5-6 cambios de TBS-T para eliminar la solución decapante.
- Detectar total de proteínas por Western blot.
2. Ensayo Methylcellulose
- Alícuota de 4 ml de metilcelulosa medio de base humana en 50 ml tubos cónicos con un gran calibre aguja estéril extremo romo. (Nota:. Metilcelulosa puede ser en alícuotas y se almacenó a -20 º C. Descongelar a temperatura ambiente O / N antes de su uso)
- Añadir 500 l de 10x de TKI o vehículo en el medio de crecimiento a 4 ml de metilcelulosa y la mezcla de vórtice durante 10 segundos.
- Cosecha y celdas de conteo. Preparar una suspensión de células en medio de crecimiento en una concentración, que es 10 veces mayor que la concentración final de células. Añadir suspensión de células 500 l a la mezcla de metilcelulosa. Vortex durante 10 segundos y dejar reposar durante 10 minutos para eliminar las burbujas.
- Elaborar 4 ml de mezcla de metilcelulosa con una jeringa de 5 ml y larg estérile parió aguja punta roma. Evite la elaboración de burbujas. Dispensar 1 ml de la mezcla de metilcelulosa en el centro de tres 35 mm placas de cultivo de tejidos. Agitar los platos hasta que el fondo está completamente cubierto con metilcelulosa.
- Para cada placa de metilcelulosa, preparar una placa de cultivo de tejido estéril de 10 cm con dos de 35 mm de tejido placas adicionales cultura llena de agua estéril para asegurar un ambiente húmedo. Culturas Coloque en agua con camisa incubadora a 37 ° C en 5% de CO2 durante 10 a 14 días.
- Recuento de las colonias después de 1-2 semanas. Las colonias deben ser más de 20 células y no se superponen. Las colonias pueden ser contadas usando un microscopio invertido equipado con una platina de microscopio con una rejilla o utilizando un contador automático de colonias. Los cambios en el tamaño de la colonia o la morfología en respuesta al tratamiento con ITC también deben ser evaluados. Para mejorar la detección por el contador de colonias, las colonias de manchas mediante la adición de 60-100 l de (3 - (4,5-Dimetil-2-tiazolil) -2,5-difenil-2H-tetrazolio bromuro de Sollución (MTT, 5 mg / ml en H2O, se almacena a -20 ° C, proteger de la luz, PRECAUCIÓN) gota a gota sobre la superficie de cada placa e incubar durante 8 horas a 37 ° C en 5% de CO 2.
3. Ensayo en agar blando
- Preparar 1% de agar noble para la capa inferior, el 0,7% de agar noble de la capa superior y medio de crecimiento de 2x. Equilibre medio de crecimiento de 2x en un 42 ° C baño de agua. Calor 1% y 0,7% de agar noble en un horno de microondas (aproximadamente 1 min/100 ml) y equilibrar en un baño de agua de 42 ° C. Mezcle partes iguales de un 1% de agar y medio 2x y por separado 0,7% de agar y medio 2x en 50 ml cónicas. Plan de 10 ml de la mezcla de la placa de agar blando / seis pocillos para cada capa.
- Etiqueta de 6 placas de cultivo de tejidos. Llene cada pocillo con 1,5 ml de 1% de mezcla de agar blando. Evite burbujas durante la siembra. Placas secas con tapas fuera de campana estéril durante 30 minutos.
- Contar las células. Preparar una suspensión de células en medio de crecimiento en una concentración, que es 500x más alto que el concentrati final de célulasen. Añadir suspensión de células a 0,7% mezcla de agar, mezclar bien y dispensar 1,5 ml de la mezcla de células de agar en la parte superior de la capa de agar 1%. Deje que la capa superior se solidifique durante 30 min.
- Preparar el medio de cultivo que contiene 1x TKI o control del vehículo. Añadir 2 ml de medio con la concentración deseada de TKI en la parte superior de la capa de agar superior.
- Incubar los cultivos durante 10 días a 37 ° C en 5% de CO 2. Retire y sustituya el medio superponiendo cada 3 días.
- Cuando las colonias son visibles a simple vista, medio aspirado de superposición y añadir 200 l de solución de azul nitro-tetrazolio (1 mg / ml de NBT en H 2 O, se almacenan a 4 ° C, proteger de la luz, PRECAUCIÓN). Volver a la incubadora durante 24-48 horas. Mover a 4 ° C durante al menos 2 horas antes del recuento. Placas teñidas pueden almacenarse a 4 ° C durante un mes. Recuento de las colonias utilizando un microscopio o un contador de colonias automático.
4. Evaluación de la inhibición fosfato proteína in vivo
- Recoger cells crecimiento en fase logarítmica por centrifugación en una centrífuga de mesa a 1.500 rpm durante 5 min. Lavar las células una vez con PBS estéril y resuspender en PBS a una concentración apropiada (típicamente 1-5 x 10 7 células / ml). Trasplante de células en un volumen de 100 l en 6-12 semanas de edad ratones GSN por inyección intravenosa en la vena de la cola usando una jeringa de insulina 28 g. Colocar el animal en una inmovilización, calentar la cola en un vaso de agua tibia para dilatar las venas, y limpie la cola con un hisopo de clorhexidina antes de la inyección. Después de la inyección, aplique presión en el sitio de la inyección con una gasa estéril hasta que el sangrado se detenga. Trasplante de al menos 3 animales / grupo. Mantener los ratones en agua que contiene 1 mg / ml de sulfato de gentamicina.
- Catorce días después del trasplante, el tratamiento de los animales con TKI o sólo vehículo y muestras de la cosecha para el análisis de la inhibición de destino. Pesar animales y tratar con una dosis adecuada (mg / kg de peso corporal) de ITC o vehículo. Administrar el tratamiento en un volumen de 5 ml / kg de peso corporal por vía intraperitoneal (ip) inyección o 10 ml / kg de peso corporal por sonda oral. Para la inyección ip, restringir el ratón de forma manual y se inyecta en el cuadrante inferior derecho del abdomen mediante una aguja de 29. Para una sonda nasogástrica, restringir el ratón manualmente y mantener al animal en posición vertical. Colocar el tubo de sonda en la boca sobre la lengua y en la parte posterior de la boca. Aplique ligera presión para pasar el tubo a través del esófago hasta el estómago. Presione el émbolo de la jeringa para administrar el tratamiento. Si el émbolo no deprime fácilmente la aguja de sonda debe ser retirado y colocado de nuevo. Preparar formulaciones TKI inmediatamente antes de su uso.
- Si se desea el tratamiento con pervanadato, preparar la solución PV 20 min antes de la cosecha como se describió anteriormente (etapa 1.1.4) y se diluye en medio con 1 mM de MgCl 2 y 100 U / ml de DNasa (120 l PV + 880 l de medio). Nota: PV es estable durante al menos 1 hora después de la dilución.
- Sacrificio de animales por el CO 2 narcosis en la aptiempo (s) apropiada post-tratamiento. Diseccionar fémures quitando pieles, piel y músculo de la pierna entera para que los huesos están completamente expuestos. Retire los fémures por el recorte con tijeras de disección justo debajo de la articulación de la cadera y de nuevo por encima de la articulación de la rodilla. Transferencia a una placa de Petri y la médula ósea a ras con 1 ml de PBS frío o solución PV diluido mediante una jeringa y una aguja 27. Si el tratamiento con PV, se incuban a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 min.
- Preparar lisados y analizar los niveles de fosfo-proteínas y total de proteínas como se indica anteriormente (pasos 1.1.6-1.2.5).
- Cuantificar relativa fosfato proteína y los niveles totales de proteínas de cada muestra utilizando densitometría. Calcular relativa phospho-protein/total-protein al valor medio phospho-protein/total-protein para los animales tratados con el vehículo.
5. Evaluación de la actividad anti-leucemia de ITC en todos los modelos de xenoinjertos
- Si es necesario, exponer ratones a 200 cGy de radiación en un irradiador RS-2000 un día PRIOr para trasplante. Los ratones trasplantados con líneas celulares de leucemia, como se describe anteriormente (paso 4.1). Trasplante de al menos 6 ratones por grupo. Identificar ratones mediante punch oreja. Alternativamente, un marcador negro se puede utilizar para identificar los ratones con marcas de control en sus colas. Agregar a enriquecimiento jaulas para reducir el potencial de agresión compañero de jaula durante el estudio.
- Tratar a los ratones con un TKI o el vehículo sólo se ha descrito anteriormente (paso 4.2). Supervisar el estado de salud de los ratones diariamente a través de la exploración física y la determinación del peso. Síntomas esperados de la leucemia (reducido nivel de actividad, pérdida de peso, parálisis de las extremidades posteriores, y las infecciones de los ojos). La pérdida de peso superior al 10% y un 15% por lo general se asocia con la muerte del ratón dentro de dos días, y suele ser un criterio indirecto de la muerte, de acuerdo con los requisitos estándar IACUC.
- Monitorear el injerto y el desarrollo de la leucemia a través de un sistema in vivo imágenes de bioluminiscencia en hasta 2 veces por semana. Preparar una solución madre 200X-D luciferina (30 mg / ml) en Steriagua le. Mezclar suavemente por inversión hasta D-luciferina se haya disuelto completamente. Utilizar inmediatamente o alícuota y congelar a -20 ° C. Antes de la formación de imágenes in vivo usando un sistema de imágenes de bioluminiscencia en, descongelar las partes alícuotas de D-luciferina a TA y se diluye 1:02 en PBS a una concentración final de 15 mg / ml y esterilizar por filtración a través de un filtro de 0,2 micras.
- Se anestesia a los ratones antes de formación de imágenes con 1,5% de isoflurano inhalado en oxígeno. Monitorear la anestesia suficiente, que se caracteriza por la relajación muscular, pérdida de movimiento y pérdida de la respuesta a la estimulación del dedo del pie-pinch.
- Inmediatamente antes de formación de imágenes, administrar 150 mg / kg de peso corporal de D-luciferina mediante inyección IP (10 l de 15 mg / ml de luciferina / g de peso corporal).
- Utilice un sistema de imágenes de bioluminiscencia in vivo para capturar 2 serie de imágenes secuenciales con 30, 60 y 90 exposiciones sec y una imagen final con una exposición de 120 seg. Después de las imágenes, vuelva ratones para jaulas y supervisar la recuperación de la anestesia. Dependiendo de laintensidad de bioluminiscencia, tiempos de exposición pueden ser variadas. Tiempos de exposición óptima, deben ser predeterminados para un determinado modelo y de mantener la coherencia de tal manera que las intensidades de señal para los puntos de tiempo individuales son comparables a través de todo el estudio.
- Determinar la intensidad de la bioluminiscencia para cada ratón utilizando viva imagen 3.2 de adquisición y análisis de software. Determinar valores de flujo total medido en fotones / segundo por regiones de interés (ROI) de tamaño idéntico sobre cada ratón dibujo.
- Sacrificio ratones por exposición de CO 2 y dislocación cervical si moribundo, exhibiendo la parálisis, en el caso de la pérdida de peso mayor que 15%, o al final del estudio. Diseccionar ratones y anote observaciones (por ejemplo, la ampliación del bazo, el hígado o los ganglios linfáticos, palidez de la médula ósea). Diseccionar fémures y la médula ósea a nivel con PBS frío utilizando una aguja de 27.
- Recoger las células en una microcentrífuga a 2500 rpm durante 5 min. Resuspender las células en PBS que contenía 2% de FBS y se incuba durante 5 min a TA.Recoger las células y tinción con 20 mg / ml de DAPI (diclorhidrato de 4,6-diamidino-2-fenilindol, 1:1.000) y FITC-conjugado α-hCD45 (1:100) o IgG de ratón anticuerpo de control de isotipo 1 (1:100) . Evaluar el injerto leucemia mediante citometría de flujo. Puerta en la población viable (DAPI negativo) y determinar el porcentaje de células CD45 + (blastos% de médula ósea).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Los ensayos presentados aquí evaluar los efectos bioquímicos y funcionales mediados por TKIs y se pueden utilizar para clasificar nuevos compuestos basados en el grado de inhibición de la diana in vitro e in vivo, la reducción de la formación de colonias, y el retraso en la leucemia en ratones trasplantados con GSN luciferasa- etiquetados células de leucemia.
Se utilizó análisis por inmunotransferencia para determinar la inhibición de la forma fosforilada activa de la proteína diana en células de leucemia después del tratamiento con TKIs. El tratamiento con TKIs resultó en una disminución dependiente de la dosis en la cantidad de proteína fosforilada. Figura 1 muestra la inhibición de la fosforilación de destino por tres TKIs diferentes en una línea celular de leucemia aguda con TKI C es el más potente, TKI B es menos potente, y TKI A que tiene ningún efecto. Por lo tanto, este ensayo permite una clasificación de compuestos en base a la potencia de la actividad bioquímica en un sistema modelo basado en células. En los ejemplos mostrados enLa Figura 1, el enriquecimiento del antígeno mediante inmunoprecipitación y el uso del inhibidor de la fosfatasa pervanadato fuera necesario para lograr resultados interpretables. Motivo de la que podría ser, que la fosforilación de la proteína de esta tirosina quinasa es lábil extrema.
Para estudiar el efecto de TKIs en las propiedades oncogénicas de las células de leucemia aguda, se utilizaron ensayos de formación de colonia. Se investigó la capacidad de las células de leucemia dependiente de la diana para formar colonias en metilcelulosa basado-(ALL) y en medio de agar blando (LMA). En el ejemplo mostrado en la Figura 2A, una reducción estadísticamente significativa en el número de colonias se observó en una línea celular de TODO después del tratamiento con un TKI. Se observaron resultados similares en líneas de células de AML después del tratamiento con TKIs en agar blando. En la Figura 2B, hay una tendencia hacia la disminución en el número de colonias respuesta al tratamiento con TKI y la disminución parece dependiente de la dosis, pero la diferencia no es Statistically significativa como resultado de la variabilidad entre repeticiones. Tenga en cuenta los grandes errores estándar de la Figura 2B respecto a la Figura 2A. Amplio mezcla de las células en el medio semisólido y la distribución equitativa del medio semisólido en los pocillos o placas es fundamental para mantener la coherencia entre las réplicas en ensayos por clonación. Conteo exacto de células viables antes de chapado También es importante garantizar la coherencia entre los experimentos. Figura 2C muestra una placa con una distribución desigual de las colonias, las burbujas en el agar blando, e incompleta difusión del agar blando en la placa (panel derecho) y una placa con el chapado adecuada para la comparación (el panel izquierdo). Para asegurar que la metilcelulosa no se seque durante el período de incubación es también importante incluir placas de agua estéril en cada plato. La deshidratación del medio de metilcelulosa cambia su densidad y por lo tanto reduce la capacidad de las células para formar colonias, potencialmentela prevención de la generación de resultados útiles.
Para determinar si TKIs puede inhibir la proteína diana in vivo, se empleó el análisis de western blot para examinar los niveles de fosfo-proteína y proteína-proteína total de blastos en la médula ósea aisladas de ratones GSN trasplantados con una línea celular de leucemia aguda. En el ejemplo mostrado en la Figura 3, el análisis farmacodinámico reveló una disminución en los niveles de fosfato proteína en blastos leucémicos aisladas de ratones tratados con TKI en relación con los ratones tratados con vehículo sólo. Estos estudios demuestran la inhibición de la auto-fosforilación en células de leucemia después del tratamiento con TKIs in vivo, lo que confirma que estos compuestos alcanzan la médula ósea y efectivamente inhiben el objetivo. TKI D fue menos activa que TKI E en este ensayo. El ejemplo mostrado, la utilización necesaria de pervanadato para estabilizar el fosfato proteína objetivo y permitir la detección.
Un modelo de xenotrasplante de ratón ortotópico de leucemia aguda en NSG millasce inyecta con una se utilizó luciferasa que expresan toda la línea celular para evaluar el efecto del tratamiento con un TKI en el potencial oncogénico in vivo. Como se muestra en la Figura 4, los ratones tratados con TKI tenían un menor nivel significativo de bioluminiscencia, lo que indica una carga leucemia reducido con relación a los ratones tratados con vehículo sólo. Después de 10 días de tratamiento, todos los ratones tenían un bajo nivel de bioluminiscencia que no fue significativamente diferente entre los animales tratados con vehículo y los animales tratados con TKI. En contraste, por 19 días después del tratamiento, los ratones tratados con vehículo tenían intensidad bioluminiscencia significativamente mayor (86,12 ± 19,17 fotones / seg), mientras que los ratones tratados con una dosis alta de TKI tenían una intensidad de señal mucho más baja (29,64 ± 9,04 fotones / seg) .
Figura 1. TKIs inhibir la fosforilación de la proteína diana in vitro. Los cultivos celulares se trataron con las concentraciones indicadas de TKI A, B TKI, o TKI C durante 1 hora. Pervanadato se añadió a los cultivos celulares durante 3 min para estabilizar la forma fosforilada de la proteína diana. La proteína diana se immunoprecipitated de lisados celulares y fosfo-proteínas y el total de la proteína se detectó por Western blot. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. TKI reduce la formación de colonias en líneas celulares de leucemia aguda en metilcelulosa y agar blando. Todas las células se colocaron en placas en metilcelulosa (A) y células de AML se sembraron en smenudo de agar (B) en presencia de un TKI o DMSO (control del vehículo). Se contaron las colonias después de 2 semanas en cultivo. Los valores medios y los errores estándar se derivaron de placas por triplicado. (C) placas de agar blando representativos con una distribución óptima de las colonias (panel izquierdo) o la distribución desigual de las colonias y un agar blando en parte independiente (panel derecho) se muestran. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. El tratamiento con TKI reduce los niveles de fosfato proteína in vivo. GSN A los ratones fueron trasplantados con una línea celular ALL y tratados con una dosis única de TKI D, E TKI, o el vehículo sólo después del desarrollo de la leucemia. Hueso mflecha células se recogieron de los fémures y se trataron con pervanadato antes de la preparación de lisados de células enteras. Se realizó inmunoprecipitación de proteína diana, y detección de fosfo-y el total de proteínas por transferencia de western. La intensidad de la señal B se cuantificó por densitometría y la fracción de se calculó fosforilada proteína diana en relación con los animales tratados con vehículo. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 4. El tratamiento con TKI retrasa la progresión de la enfermedad en los ratones trasplantados con un humano luciferasa que expresan toda la línea celular. GSN ratones fueron trasplantados con una población monoclonal de luciferasa-transducidas TODAS células por inyección en la colavena. D-luciferina se inyectó por vía intraperitoneal e imágenes de bioluminiscencia se tomaron dos veces por semana (Bining: 8, FOV 19.6, f / stop 1, tiempo de exposición de 120 segundos). A las imágenes Pseudocolor se muestran demostrando el aumento de la intensidad de la bioluminiscencia con el tiempo en los ratones trasplantados con células de leucemia y una reducción dependiente de la dosis en la intensidad de la bioluminiscencia en los animales tratados con un TKI. B La cuantificación de la intensidad de la bioluminiscencia media y el error estándar para cada grupo de estudio. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este manuscrito describe una estrategia eficaz para la evaluación de inhibidores de tirosina quinasa nuevos en el tratamiento de la leucemia aguda. Usando este enfoque, las actividades bioquímicas y anti-leucemia se evalúan primero en ensayos basados en células in vitro y luego en modelos de xenoinjerto in vivo. El análisis por inmunotransferencia se utilizó con éxito para demostrar la inhibición de la tirosina quinasa diana en células de leucemia después del tratamiento con TKIs y para comparar directamente la potencia de múltiples compuestos en las células. En el protocolo presentado aquí, se utilizó pervanadato para estabilizar el fosfato proteína y la proteína diana se concentró por inmunoprecipitación. Si estas mediciones fueron insuficientes para permitir la detección por transferencia de western, los niveles de fosfato proteína también se podría aumentar mediante la adición de ligando, ya sea con o sin pervanadato. Del mismo modo, el ligando se puede añadir a la solución utilizada para limpiar la médula ósea para estudios farmacodinámicos. LiGand puede ser purificado o, en algunos casos, se puede proporcionar como un componente de suero fetal bovino. En el caso de que estos métodos no permiten la detección de auto-fosforilada en tirosina quinasa, objetivos de abajo también se pueden utilizar para la evaluación de la inhibición de destino, aunque es preferible para evaluar la actividad de la proteína diana directamente cuando sea posible. Es de destacar que se debe tener precaución al interpretar los resultados de los experimentos utilizando pervanadato, que es un inhibidor de la fosfatasa no selectivo que afecta a muchas proteínas celulares. Por esta razón, pervanadato no debe utilizarse para la detección de cambios en los componentes de señalización corriente abajo.
Antes de estudiar en modelos animales, es deseable para confirmar la actividad anti-leucemia mediada por TKIs en células de leucemia. Para estos estudios nos apoyamos en ensayos por clonación en metilcelulosa o medio de agar blando. Mientras que otros ensayos también se pueden usar para evaluar los efectos anti-tumorales en cultivo, los ensayos de formación de colonias son a menudo más predictive de eficacia in vivo en relación con ensayos más tradicionales que evalúan la proliferación y / o supervivencia en cultivo líquido. Sin embargo, estos ensayos se pueden usar junto con los ensayos de formación de colonias para evaluar los mecanismos de la actividad anti-leucemia mediada por TKIs y también puede ser útil en el caso de que una línea celular de interés no forma colonias. Específicamente, puede ser útil para evaluar la inducción de la apoptosis en respuesta al tratamiento con TKIs usando ensayos de citometría de flujo para determinar los niveles de las caspasas escindidos / activadas, aumento de la unión de anexina V a la superficie celular, o diferencial de absorción de YOPRO-1-yoduro . Del mismo modo, disminución de la proliferación o de inducción de la diferenciación también puede contribuir a la actividad anti-leucemia. Como tal, las curvas de crecimiento se pueden generar en presencia y ausencia de TKI para evaluar la proliferación y la morfología celular y cambios en la expresión de marcadores de superficie celular pueden ser examinados para determinar la etapa de diferenciación. El uso de clonigénicasensayos está bien establecida en el campo del desarrollo de fármacos y sirve como una herramienta rentable para la evaluación de la ITC. Sin embargo, se sabe que las alteraciones sistemáticas en las condiciones de cultivo (incluyendo la adición de factores de crecimiento y otros suplementos, variaciones en la composición de suero, y las diferencias en el pH de la solución de TKI) pueden influir tanto en el crecimiento de colonias y la quimiosensibilidad 9,10. Por lo tanto, la consistencia en condiciones de cultivo es fundamental para la reproducibilidad en este ensayo. La distribución desigual de las células o TKI también puede conducir a la mala caracterización de la eficacia de las terapias experimentales (Figura 2C). En la evaluación, además de más de un punto en el tiempo para el recuento de colonias o de chapado después de la exposición al fármaco pueda ayudar a distinguir entre las drogas que median los efectos antiproliferativos, pero no tienen potencial curativo 7.
Los estudios in vivo descritos aquí representan un paso crítico en el camino hacia la clinicaL aplicación de un TKI. Los estudios farmacodinámicos para demostrar la inhibición de destino son importantes para definir la dosis y frecuencia de administración relevante para los estudios posteriores para evaluar la eficacia. En la mayoría de los casos es preferible para alcanzar una inhibición completa y continua de la proteína diana y esto puede requerir un tratamiento más de una vez al día. Además, la inhibición de la leucemia y el aumento de la supervivencia en modelos de xenoinjerto puede requerir una dosis mayor de TKI del que se requiere para la inhibición bioquímica completa y continua en la médula ósea. Esto puede ocurrir porque la leucemia establece en múltiples sitios y la exposición a TKIs puede ser heterogénea en diferentes localizaciones anatómicas, incluyendo el cerebro, o podría reflejar las limitaciones en la sensibilidad del ensayo resultante en un fracaso para detectar cantidades restantes limitadas de proteína diana activa ( es decir, la inhibición de destino incompleto). Sin embargo, a diferencia de las terapias citotóxicas tradicionales que se administran en su máximodosis tolerada, las más agentes dirigidos molecularmente selectivos de tumor pueden ser igualmente eficaces a dosis más bajas que son suficientes para la inhibición bioquímica de la proteína diana pero no están asociados con toxicidades significativas. Por lo tanto, para esta clase de agentes, los estudios iniciales para evaluar los efectos de un TKI sobre la progresión de la leucemia en los modelos de xenoinjerto a menudo utilizan la dosis mínima requerida para obtener una inhibición completa y continua de la diana. Si no se observan efectos sobre la progresión de la leucemia o la supervivencia, la dosis se puede aumentar hasta que se observa toxicidad. Estos modelos también pueden usarse para investigar los efectos de un TKI se administra en combinación con terapias de leucemia estándar, informando así el desarrollo posteriores protocolos clínicos.
El establecimiento de modelos de xenoinjertos de leucemia aguda utilizando células que expresan luciferasa representa un gran avance respecto a los modelos más tradicionales de xenoinjertos y tiene el potencial de acelerar considerablementeel proceso de descubrimiento y desarrollo de drogas 11. Imágenes de bioluminiscencia permite la determinación no invasiva longitudinal de la carga de la leucemia, disminuyendo de ese modo el número de animales necesarios para los estudios, y también puede proporcionar información acerca de la localización anatómica de la enfermedad. Además, en un esfuerzo por ampliar potenciales utilidades clínicas de TKIs, imágenes de bioluminiscencia se puede conseguir de forma reproducible después del trasplante de las muestras primarias de luciferasa-etiquetados humanos de pacientes 12. Sin embargo, la interpretación de imágenes de bioluminiscencia puede ser difícil debido a la incertidumbre posicional de las células emisores de luz y por lo tanto en imágenes de bioluminiscencia in vivo sólo debe ser utilizado como una herramienta semicuantitativo para seguir el mismo animal bajo condiciones idénticas 13.
En el caso de la suerte de que varios compuestos tienen una actividad significativa y comparable en los ensayos descritos aquí, los criterios adicionales que pueden ser usados para su posterior ranking de compuestos incluyen relativa facilidad de la síntesis de compuesto, solubilidad, grado de biodisponibilidad oral, propiedades farmacocinéticas, y estudios de toxicología. En conjunto, estos datos deben permitir la identificación de un compuesto óptimo para la progresión a la investigación clínica y son necesarias para fomentar la presentación de un nuevo fármaco en investigación (IND) con la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para que los estudios clínicos. Después de la generación de estos datos preclínicos críticas necesarias para el avance de estos nuevos agentes a la clínica, la utilización del Instituto Nacional de Cancer Therapy Evaluation Program de la Salud (CTEP) debe ser considerado. En este programa son patrocinados ensayos clínicos para evaluar nuevos agentes contra el cáncer, con un énfasis particular en la investigación translacional. Se debe tener cuidado para coordinar la presentación pública de los datos pre-clínicos, incluyendo la descripción de las estructuras y la síntesis de nuevos compuestos, con la presentación de solicitudes de patentes a la protecciónt los derechos de propiedad intelectual. En general, los datos no deben ser presentados públicamente hasta que se hayan presentado solicitudes de patente protegen la composición de la materia y los métodos de uso.
En conclusión, hemos demostrado una estrategia eficiente para investigar y evaluar el potencial de nuevos TKIs como agentes terapéuticos para el tratamiento de la leucemia aguda. La inhibición de destino en células de leucemia, tanto en cultivo como aislado de la médula ósea de ratones con xenoinjertos de leucemia humana, se puede evaluar por inmunoblot. La importancia funcional de la inhibición de destino se puede evaluar usando ensayos clonogénicos y modelos de xenoinjerto murino ortotópico con bioluminiscente de imágenes. En conjunto, estos estudios aportan datos preclínicos críticas necesarias para el avance de estos agentes de traslación novedosos en la clínica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Imágenes in vivo se realizó con el recurso compartido IVIS en la Universidad de Colorado Cancer Center (con el apoyo de subvención P30-CA046934). Citometría de flujo se realizó en la citometría de flujo de recursos compartidos de la Universidad de Colorado Cancer Center (apoyado por P30CA046934 subvención). Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud (RO1CA137078 a DKG). ABLS es miembro del Programa de Desarrollo Pediátrico científico, apoyado por becas de la Academia Americana de Pediatría, la Sociedad Americana de Pediatría y el Instituto Nacional Eunice Kennedy Shriver de Salud Infantil y Desarrollo Humano (K12-HD000850).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
- Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
- Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there? Blood. 120, 1165-1174 (2012).
- Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
- Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
- Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
- Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
- Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
- Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
- Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
- Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
- Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
- Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
