Summary
Receptor tyrosinkinaser er ectopically uttrykt i mange kreftformer og har blitt identifisert som terapeutiske mål i akutt leukemi. Denne manuskriptet beskriver en effektiv strategi for preklinisk evaluering av tyrosin kinase inhibitorer for behandling av akutt leukemi.
Abstract
Reseptor-tyrosin-kinaser har vært implisert i utvikling og progresjon av mange kreftformer, inkludert både leukemi og faste tumorer, og er attraktive druggable terapeutiske mål. Her beskriver vi en effektiv fire-trinns strategi for preklinisk evaluering av tyrosinkinase-inhibitorer (TKIs) i behandlingen av akutt leukemi. I utgangspunktet er western blot analyse brukes til å bekrefte målet hemming i dyrkede leukemiceller. Funksjonell aktivitet blir deretter evaluert ved hjelp clonogenic essay i methylcellulose eller myke agar kulturer. Eksperimentelle forbindelser som viser aktivitet i cellekultur analysene er evaluert in vivo ved hjelp av NOD-SCID-gamma (NSG) mus transplantert orthotopically med menneskelig leukemi cellelinjer. Innledende in vivo farmakodynamiske studier evaluere mål hemming i leukemiske blaster isolert fra benmargen. Denne fremgangsmåten brukes til å bestemme den dose og doseringsplan som kreves for effektiv target Sperreion. Senere studier evaluere effekten av TKIs in vivo ved anvendelse av luciferase som uttrykker leukemiceller, og derved åpner for ikke-invasiv bioluminescent overvåking av leukemi belastning og vurdering av terapeutisk respons ved bruk av en in vivo Bioluminescens avbildningssystem. Denne strategien har vært effektiv for evaluering av TKIs in vitro og in vivo og kan brukes for identifisering av molekylært målrettede agenter med terapeutisk potensial eller for direkte sammenligning og prioritering av flere forbindelser.
Introduction
Akutt lymfatisk leukemi (ALL) er den vanligste kreftformen hos barn 1,2. Den totale overlevelsen for pediatrisk B-avstamning ALL (B-ALL) er ca 85%, men bestemte biologiske undergrupper, inkludert T-avstamning ALL (T-ALL), har fortsatt dårligere prognose selv med dagens terapeutiske protokoller. Videre behandling av residiverende ALL fortsatt en utfordring tre. Selv om flertallet av voksne pasienter med akutt leukemi oppnå en remisjon med up-front kjemoterapi, mange pasienter fortsatt lider tilbakefall fire. Omløps kjemoterapeutiske regimer for behandling av akutt leukemi er kjent for å forårsake toksisitet assosiert på kort og lang sikt bivirkninger. Derfor er mindre toksiske terapier som spesifikt er rettet mot kreftceller med minimal effekt på normalt vev stort behov. I de senere årene har det vært lagt vekt på utvikling av romanen, molekylært målrettede agenter med spesifisitet for kreftceller, ofte utnytte iterativ kjemiå generere flere aktive forbindelser som må deretter sammenlignes og prioriterte fem. Denne manuskriptet beskriver en effektiv strategi for preklinisk evaluering av TKIs for behandling av akutt leukemi, som kan anvendes for evaluering av en enkelt forbindelse eller for direkte sammenligning av flere forbindelser for å lette utvikling av legemidler.
Fremgangsmåten presentert her består av fire trinn. Først den biokjemiske (1) og anti-leukemi (2) aktiviteter av forbindelsen (e) er undersøkt i cellekultur, og hemming av målet blir bekreftet i dyremodeller (3), og til slutt terapeutiske effekt av TKI (s) bestemmes i ortotopiske leukemi xenograft modeller (4). For disse studiene, er det viktig å velge relevante cellelinjer, som er representanter for de mest vanlige biologiske subtyper. Cellelinjer bør velges, som begge, uttrykke mål av interesse og mangler mål av interesse, for å undersøke om biologiske effekter er MEDiated ved inhibering av målet. Dette er spesielt relevant for utvikling av små molekyl-hemmere, som har off-target effekter som kan være viktig for anti-tumor aktivitet. Det er også nødvendig å velge en cellelinje som er avhengig av målsettingen for funksjonelle effekter som proliferasjon og overlevelse. Foreløpige validerings target studier (utenfor rammen av denne artikkelen) ved hjelp av RNA-interferens eller andre særskilte midler for å hemme målet kan brukes til å identifisere mål-avhengige cellelinjer. Det er også ønskelig å velge cellelinjer som kan danne murine xenografter, slik at cellekulturresultater kan være mer direkte settes til in vivo eksperimenter.
For evaluering av biokjemisk aktivitet mediert av TKIs i leukemi-celler, kan en reduksjon i receptor phosphorylation bli brukt som en indikator på target-hemming. Western blot analyse eller ELISA-analyser kan anvendes, avhengig av tilgjengelighet og spesifisitet av antistoffer.Hvis antistoffer med tilstrekkelig spesifisitet for målet, er tilgjengelige, ELISA-analyser er å foretrekke fordi de er mer kvantitativ og effektiv. I de tilfeller hvor antistoffer med tilstrekkelig spesifisitet for ELISA ikke er tilgjengelige, kan det være nødvendig med western blot analyse. I dette tilfellet kan immunoutfelling av en stor mengde av lysat være nyttig for deteksjon av mål som befinner seg i lav mengde. Denne tilnærmingen er spesielt relevant for måling av fosfo-proteiner, som kan ha en kort halveringstid, slik at for hurtige endringer i signalisering som respons på miljømessige stimuli. Noen fosforylerte proteiner er ekstremt labile, mest sannsynlig på grunn av kompleksdannelse med fosfataser. For robust og stabil deteksjon av disse fosforylerte proteiner, kan det også være mulig å behandle cellene med pervanadate, en irreversibel protein-tyrosin-fosfatase-inhibitor 6, for å stabilisere fosfo-protein før fremstillingen av hele cellelysater.
Åavgjøre om biokjemisk aktivitet resulterer i anti-tumor effekter, kan målet avhengige biologiske prosesser overvåkes i cellebaserte eksperimenter. For leukemi cellelinjer, kan anti-leukemi aktivitet mediert av TKIs vurderes ved hjelp koloni dannelse analyser utført i methylcellulose eller myk agar 7. Myk agar kan være foretrukket, da dette er et fast medium som er mer mottagelig for manipulering om gjentatt behandling med en TKI er nødvendig. Mens mange akutte myloid leukemi (AML)-cellelinjer vil danne kolonier i myk-agar, vil de fleste alle cellelinjer bare danne kolonier i metylcellulose, som er et halvfast medium. Selv om det er mulig å oppdatere medium og / eller TKIs i methylcellulose kulturer, kan bare små mengder anvendes, og med begrenset frekvens. Tilsvarende er det vanskeligere å sette flekker kolonier uten å forstyrre dem i metylcellulose. Foreløpige studier bør definere evnen av passende cellelinjer for å danne kolonier i metylcellulose og / eller myk agar og tHan optimal tetthet av celler i kultur slik at koloniene er ikke-overlappende og i tilstrekkelig antall til å oppnå statistisk relevante data (vanligvis 50 til 200 kolonier per 35 mm plate).
Mens in vitro prøver er robuste og kostnadseffektive, og har færre etiske implikasjoner enn hele dyreforsøk, fremme av terapeutiske forbindelser krever bevis på effekt og sikkerhet i dyremodeller. For in vivo studier, kan menneskelige akutt leukemi cellelinjer bli orthotopically transplantert inn NOD.Cg-Prkdc SCID jeg l2rg tm1Wjl / SzJ (NSG) mus og TKIs kan enkelt administreres ved injeksjon eller oral sonde. Noen cellelinjer krever eksponering av NSG mus til en lav cellelinje-avhengig stråledose for at xenografts å etablere, og i dette tilfellet mus ikke kan tolerere oral gavage uten en 5-10 dagers restitusjonsperiode etter bestråling. Dette manuskriptet beskriver generasjon B-ALL og T-ALLE xenografts hjelpspesifikke cellelinjer (697) og Jurkat som eksempler, men xenografts kan settes i NSG mus ved hjelp av en rekke forskjellige cellelinjer. I det tilfelle at andre cellelinjer er mer anvendelig, kravet for bestråling, optimalt antall celler til transplantasjon, og tidspunktet for sykdommen inntreden og utvikling må bestemmes eksperimentelt. Ideelt sett vil disse modellene har full pene (alle dyr transplantert utvikler leukemi), konsekvent kinetikk (leukemi utvikler seg på samme måte i alle dyr), og en rimelig behandling vindu (ideelt sett 20-30 dager mellom oppstart av behandling og fjerning fra studien på grunn av sykdom) . Antallet celler transplantert kan økes for å forbedre pene og kinetisk konsistens eller redusert for å forbedre behandlingsvinduet om nødvendig.
For å finne ut om TKIs megle target hemming in vivo, er det samlet inn prøver fra mus med leukemi xenografts etter behandling med TKI eller kjøretøy bare. Ideelt sett dosen end doseringsplan for disse eksperimentene er guidet av farmakokinetiske studier, som ofte kan være utført av kommersielle laboratorier og er utenfor omfanget av denne artikkelen. Hvis farmakokinetiske data er tilgjengelige, kan konsentrasjonen av forbindelse som er nødvendig for effektiv target inhibering i cellekultur, og den maksimale serumkonsentrasjon etter en enkelt dose av TKI brukes til å definere en startdose for dyrestudier. Farmakokinetiske studier kan også informere tidspunktet for prøvetaking etter behandling for farmakodynamiske studier og administrasjonsveien. Inhibering av målet kan bli vurdert i alle berørte organ, men vev som er mest lett samles og behandles er å foretrekke. De akutte leukemicellelinjer etablert i lever, benmarg, milt, perifert blod, og det sentrale nervesystemet, selv om de spesifikke organer påvirkes og omfanget av engraftment i disse organer varierer mellom modellene. Protokollen presenteres her vurderer fosfato-protein hemming i benmarg ved hjelp av western blot analyse, men solide organer kan være lettere å konsekvent høste og krever minimalt eller ingen behandling før frysing, slik at mindre mulighet for nedbrytning av fosfor proteiner under prøvetakingen og behandling. Immunhistokjemi kan også brukes til å evaluere solide tumorer eller organer som påvirkes av leukemi.
Endelig er den terapeutiske effekt av den TKI (e) bestemmes i ortotopiske leukemi xenograft-modeller. For disse studiene, kan tidspunktet for behandlingsstart varieres, slik at sykdommen er mer eller mindre fastslått. Behandling kan starte umiddelbart etter transplantasjon for innledende studier og deretter bli forsinket i senere studier til betydelig sykdomsbyrde blir oppdaget til nærmere tilnærmet en diagnostisk behandlingsmodell. Ideelt sett er disse dyremodeller har også kapasitet for ikke-invasiv måling av sykdomsbelastning. Vi har optimalisert metoder for innføring av Firefly luciferase-genet inn i leukemicellelinjer ved hjelp av viruslignende partikler, slik at for ikke-invasiv, langsgående analyse av sykdomsutbruddet og progresjon og vurdering av sykdomsbelastning i benmarg-og organer. Kritisk for denne metode er bruken av monoklonale luciferase-merket cellelinjer for å hindre at variasjon i utviklingen av luciferase-uttrykkende leukemi forbundet med bruk av polyklonale cellelinjer, og er ikke relatert til behandling med et TKI 8..
Til sammen kan disse trinnene brukes til evaluering av en enkelt TKI eller for direkte sammenligning og rangering av flere TKIs. Mens de protokoller som presenteres her fokus på utvikling av TKIs kan disse metodene tilpasses andre mål og betraktninger for analysen utvikling er beskrevet. Således kan denne strategien er mer bredt anvendelig til pre-klinisk evaluering av molekylært målrettede midler for behandlingen av akutt leukemi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøk med dyr fulgt de regulatoriske standarder godkjent av Universitetet i Colorado Institutional Animal Care og bruk komité. Den viste protokollen ble godkjent av Universitetet i Colorado Institutional Animal Care og bruk komité.
En. Phospho-protein Western Blot
- Utarbeidelse av lysates
- Kultur-cellelinjer som uttrykker reseptoren tyrosin-kinase av interesse. Høst celler og plate 3-5 x 10 6 celler / prøve i 400 pl vekstmedium i en 48-brønners vevskultur-fatet. Inkuber ved 37 ° C i 5% CO2 i 2-3 timer.
- Tilsett 100 ul 5x TKI løsning i vekstmedium og inkuber i 60 min.
- Forbered lysis buffer med 50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10% (v / v) glycerol, 1% (v / v) Triton X-100, og protease-inhibitorer. Hvis kulturer ikke vil bli behandlet med pervanadate før innhøstingen, legge fosfatase hemmere (1 mM natrium orthovanadate og 0,1 mM natrium-molybdat) som lyseringsbuffer.
- Forbered pervanadate (PV) fosfatase inhibitor løsning umiddelbart før bruk. Tilbered en 0,3% oppløsning av hydrogen peroksid (FORSIKTIG) i kald fosfatbuffret saltoppløsning (PBS) i en mørk rør på is (1:100-fortynning av en 30% stamløsning). Kok en alikvot av 0,2 M natrium-orthovanadate (OV, OBS) stamløsning i 5 min. Fortynn 1:10 i PBS for å sørge 20 mM OV-løsning ved romtemperatur (RT). Bland 0,3% hydrogenperoksid og 20 mM OV 1:1 og inkuberes i mørke ved RT i 20 min.
- Fortynne PV inn komplett medium (60 mL PV + 940 mL medium). Tilsett 100 pl av fortynnet PV / brønn. Inkuber ved 37 ° C i 5% CO 2 i 3 min og deretter plassere plate på is.
- Høste cellene i kalde mikrofugerør ved 2500 rpm i 5 min. Aspirer supernatanten og resuspender celler i 120 mL av lysis buffer. Inkuber på is i 15 min. Klargjøre lysatet i en kald mikrosentrifuge ved 6000 opm i 3 min. Overfør supernatant til en frisk kald tube. Oppbevares ved -80 ° C.
- Immunoutfelling
- Spinn ned Protein G-Sepharose-kuler i mikrosentrifuge ved 1000 opm i 1 min. Fjern supernatanten og vask perler 2x med en ml kald PBS. Til et likt volum PBS for å lage en 50% oppslemning. Legg primære antistoff, og 20 ul 50% Protein G-perler til hver prøve. Inkuber i 2 timer - O / N ved 4 ° C på en rotator.
- Puls ned perler i en kald mikrosentrifuge ved 9000 rpm. Fjern supernatanten og vask perler 2x med 150 mL kald lysis buffer. Spin i kaldt mikrosentrifuge ved 1000 opm i 1 min. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 20 mL 2X SDS Sample Buffer med 2-mercaptoethanol (FORSIKTIG). Brukes umiddelbart eller oppbevar ved -80 ° C.
- Kok prøvene i 5 min og kjørt på en SDS-PAGE-tris-glysin gel. Overfør proteiner til en nitrocellulose membran og oppdage fosfor-protein av vestlige blot.
- Skyll blot med vann og deretter inkuberes i 2% SDS, 62,5 mM Tris (pH 6,8), 0.1 M β-mercaptoethanol (FORSIKTIG) i 30 min ved 50 ° C. Skyll 2x med vann, og deretter vaskes i 60-90 min i 5-6 endringer av TBS-T for å fjerne strippeløsning.
- Detect total-protein av vestlige blot.
2. Methylcellulose analysen
- Delmengde 4 ml methylcellulose human basismedium i 50 ml koniske rør ved hjelp av en steril stor boring butt ende nål. (Merk:. Methylcellulose kan alikvoteres og lagres ved -20 ° C. Thaw ved RT O / N før bruk)
- Til 500 ul av 10 x TKI eller et kjøretøy i vekstmedium til 4 ml av metylcellulose og virvelblanding i 10 sekunder.
- Harvest og telle celler. Tilbered en cellesuspensjon i vekstmediet i en konsentrasjon som er 10 ganger høyere enn den endelige celle-konsentrasjonen. Legg 500 ul cellesuspensjon til-metylcellulose-blandingen. Vortex for 10 sek og la sitte i 10 minutter for å fjerne boblene.
- Utarbeide 4 ml methylcellulose blanding ved hjelp av en 5 ml sprøyte og steril large fødte butte enden nål. Unngå å trekke opp bobler. Tilsett 1 ml av methylcellulose blandingen inn i sentrum av tre 35 mm vevskulturplater. Virvle retter inntil bunnen er fullstendig dekket med methylcellulose.
- For hver methylcellulose plate, forberede en 10 cm sterilt vev kultur plate med to ekstra 35 mm vevskulturplater fylt med sterilt vann for å sikre et fuktig miljø. Plasser kulturer i vannkappe inkubator ved 37 ° C i 5% CO2 i 10-14 dager.
- Telle kolonier etter 1-2 uker. Kolonier bør være mer enn 20 celler og ikke overlappende. Kolonier kan telles ved hjelp av et invertert mikroskop utstyrt med et objektbord med et rutenett, eller ved hjelp av en automatisert koloniteller. Endringer i kolonistørrelse og morfologi i respons til behandling med TKI bør også vurderes. For å forbedre deteksjon av koloniteller, beis kolonier ved å tilsette 60-100 ul av (3 - (4,5-dimetyl-2-tiazolyl) -2,5-difenyl-2H-tetrazolium-bromid solution (MTT, 5 mg / ml i H2O, lagre ved -20 ° C, beskytte mot lys, OBS) dråpevis over overflaten av hver plate, og inkubering i 8 timer ved 37 ° C i 5% CO2.
Tre. Soft Agar analysen
- Forbered en% edel agar for bunnlaget, 0,7% edel agar for topplaget og 2x vekstmedium. Stabil 2x vekstmedium i et 42 ° C vannbad. Varme 1% og 0,7% edel agar i en mikrobølgeovn (ca. 1 min/100 ml) og ekvilibrere i et 42 ° C vannbad. Bland like deler av 1% agar og 2x medium og separat 0,7% agar og 2x medium i 50 ml kuler. Plan 10 ml myk agar blanding / seks-brønns plate for hvert lag.
- Merk 6-brønns vevskulturplater. Fyll hver brønn med 1,5 ml 1% myk agar blanding. Unngå bobler under platekledning. Tørre plater med lokk off i sterile hette for 30 min.
- Telle celler. Tilbered en cellesuspensjon i vekstmediet i en konsentrasjon som er 500x høyere enn den endelige celle concentratipå. Til cellesuspensjonen til 0,7% agar-blanding, bland godt og dispenser 1,5 ml av agar celleblanding på toppen av den 1% agar-lag. La det øverste laget størkne i 30 min.
- Forbered 1x vekstmedium som inneholder TKI eller kjøretøy kontroll. Tilsett 2 ml medium med ønsket konsentrasjon av TKI på toppen av den øverste agar lag.
- Inkuber kulturer for 10 dager ved 37 ° C i 5% CO 2. Ta ut og erstatte den overliggende medium hver 3. dag.
- Når kolonier er synlige for det blotte øye, aspirer overliggende medium og tilsett 200 mL nitro-tetrazolium blå løsning (1 mg / ml NBT i H 2 O, oppbevar ved 4 ° C, beskyttes mot lys, FORSIKTIG). Gå tilbake til inkubator for 24-48 hr. Beveg til 4 ° C i minst 2 timer før telling. Farget platene kan bli lagret ved 4 ° C i en måned. Telle kolonier ved hjelp av et mikroskop eller en automatisert koloni teller.
4. Evaluering av fosfor-protein Hemming In vivo
- Samle calen vokser i log fase ved sentrifugering i en bordsentrifuge ved 1500 rpm i 5 min. Vask cellene én gang med sterilt PBS og resuspender i PBS ved en passende konsentrasjon (typisk 1-5 x 10 7 celler / ml). Transplant celler i et volum på 100 ul i 6-12 uker gamle NSG mus ved intravenøs injeksjon inn i halevenen ved bruk av en 28 G insulinsprøyte. Plasser dyret i en rainer, varme halen i et begerglass med varmt vann for å utvide seg i blodårene, og rengjør halen med klorheksidin pinne før injeksjon. Etter injeksjon, legg press på injeksjonsstedet ved bruk av sterilt gasbind til blødningen stopper. Transplant minst tre dyr / gruppe. Oppretthold musene på vann inneholdende 1 mg / ml gentamycin-sulfat.
- Fjorten dager etter transplantasjonen, behandle dyr med TKI eller kjøretøy bare og høsting prøver for analyse av målet hemming. Vei dyr og behandle med en egnet dose (mg / kg kroppsvekt) av TKI eller kjøretøy. Administrer behandling i et volum på 5 ml / kg kroppsvekt ved intraperitoneal (ip) injeksjon eller 10 ml / kg kroppsvekt ved oral gavage. For ip injeksjon, holde musen manuelt og injisere i nedre høyre kvadrant av magen ved hjelp av en 29 G nål. For oral sonde, holde musen manuelt og hold dyret oppreist. Plasser røret gavage i munnen over tungen og ned i bak i munnen. Trykk lett å passere røret gjennom spiserøret og inn i magen. Trykk ned sprøytestempelet for å administrere behandling. Hvis spolen ikke trykkes lett sonde nål bør fjernes og flyttes. Forbered TKI formuleringer umiddelbart før bruk.
- Hvis pervanadate behandling er ønsket, klarløsningen PV 20 minutter før innhøstning som beskrevet ovenfor (trinn 1.1.4) og fortynn i medium med 1 mM MgCl2 og 100 U / ml DNase (120 mL PV + 880 pl medium). Merk: PV er stabil i minst 1 time etter fortynning.
- Ofre dyr av CO 2 narkose på appropriate tid (s) etter behandling. Dissekere lårben ved å fjerne pels, hud og muskler fra hele benet slik at knoklene er fullstendig eksponert. Fjern lårben ved å klippe med dissekere saks like under hofteleddet og igjen over kneleddet. Overføring til en petriskål og flush benmarg med en ml kald PBS eller fortynnet PV-løsning ved hjelp av en sprøyte og en 27 G nål. Ved behandling med PV, inkuber ved romtemperatur i mørke i 10 min.
- Forbered lysates og analysere fosfor-protein og total-protein nivåer som angitt ovenfor (trinn 1.1.6-1.2.5).
- Kvantifisere relative fosfo-protein og total-proteinnivåer for hver prøve ved hjelp av densitometry. Beregn phospho-protein/total-protein i forhold til den gjennomsnittlige phospho-protein/total-protein verdi for placebobehandlede dyr.
5. Evaluering av Anti-leukemi aktivitet av TKIs i ALLE xenograft modeller
- Hvis det er nødvendig, utsett mus til 200 CGY av stråling i en RS-2000 irradiator en dag PRIOr til transplantasjon. Transplant mus med leukemi-cellelinjer som er beskrevet ovenfor (trinn 4.1). Transplant minst seks mus per gruppe. Identifiser mus ved øret punch. Alternativt kan en sort tusj brukes til å identifisere mus med hash merker på halene. Legg berikelse til bur for å redusere potensialet for buret kompis aggresjon i løpet av studien.
- Behandle mus med en TKI eller et kjøretøy som beskrevet ovenfor (trinn 4.2). Overvåke helsetilstanden til mus daglig via fysisk undersøkelse og vekt besluttsomhet. Forventede symptomer på leukemi (redusert aktivitetsnivå, vekttap, hind lem lammelse, og øyeinfeksjoner). Vekttap mer enn 10% -15% er vanligvis forbundet med død mus i løpet av to dager, og er vanligvis et surrogat endepunkt for døden i henhold til standard IACUC krav.
- Overvåk engraftment og utvikling av leukemi via en in vivo Bioluminescens imaging system opp til 2x ukentlig. Tilbered en 200x D-luciferin stamløsning (30 mg / ml) i klorle vann. Bland forsiktig ved å vende til D-luciferin er fullstendig oppløst. Bruk umiddelbart, eller delmengde og fryse ved -20 ° C. Forut for avbildning ved hjelp av en in vivo Bioluminescens avbildningssystem, tine alikvoter av D-luciferin ved RT og fortynnet 1:02 i PBS til en sluttkonsentrasjon på 15 mg / ml og filtersteriliser gjennom et 0,2 mikrometer filter.
- Anesthetize mus før bildebehandling med 1,5% inhalert isofluran i oksygen. Overvåk tilstrekkelig anestesi, karakterisert ved muskelrelaksasjon, tap av bevegelse, og tap av respons på tå-klemme stimulering.
- Umiddelbart før avbildning, administreres 150 mg / kg kroppsvekt D-luciferin ved ip injeksjon (10 ul av 15 mg / ml luciferin / g kroppsvekt).
- Bruk en in vivo Bioluminescens imaging system for å fange to bildeserier med sekvensielle 30, 60 og 90 sek eksponeringer og et endelig bilde med en 120 sek eksponering. Etter bildebehandling, returnere mus til bur og overvåke for utvinning fra anestesi. AvhengigIntensiteten av bioluminescens, kan eksponeringstider varieres. Optimale eksponeringstider bør være forhåndsbestemt for en gitt modell, og holdes konsekvent slik at signalintensitetene for de enkelte tidspunkter er sammenlignbare på tvers av hele studien.
- Bestem Bioluminescens intensitet for hver mus ved hjelp av levende bilde 3.2 oppkjøp og analyse programvare. Bestem totale fluks verdier målt i fotoner / andre ved å tegne regioner av interesse (ROI) av identisk størrelse over hver mus.
- Blot mus av CO 2-eksponering og cervical dislokasjon hvis døende, oppviser lammelse, i tilfelle større enn 15% vekttap, eller ved slutten av studien. Dissekere mus og rekord observasjoner (f.eks utvidelse av milt, lever, eller lymfeknuter, blek benmarg). Dissekere lårben og flush benmarg med kald PBS med en 27 G nål.
- Samle-celler i en mikrosentrifuge ved 2500 rpm i 5 min. Suspender celler i PBS inneholdende 2% FBS og inkuberes i 5 minutter ved RT.Samle celler og flekken med 20 mg / ml DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole dihydroklorid, 1:1.000) og FITC-konjugert α-hCD45 (1:100), eller muse-IgG 1 isotype kontroll-antistoff (1:100) . Vurdere leukemi engraftment ved hjelp av flowcytometri. Gate på levedyktige bestand (DAPI negativ) og bestemme prosentandel av CD45 +-celler (% blaster i benmarg).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Assayene er presentert her evaluere de biokjemiske og funksjonelle virkninger som medieres av TKIs og kan benyttes for å plassere nye forbindelser basert på graden av target inhibering in vitro og in vivo, reduksjon av koloni-formasjon, og forsinkelse i leukemogenesis i NSG mus transplantert med luciferase- tagged leukemiceller.
Immunoblot-analyse ble benyttet for å bestemme hemming av den aktive fosforylerte form av målproteinet i leukemiceller etter behandling med TKIs. Behandling med TKIs resulterte i en doseavhengig reduksjon i mengden av fosforylert protein. Figur 1 viser hemming av target fosforylering av tre forskjellige TKIs i en akutt leukemi-cellelinje med TKI C å være det mest potente, TKI B er mindre kraftig og TKI En har ingen effekt. Således tillater denne analysen rangering av forbindelser basert på styrken av biokjemiske aktivitet i et cellebasert modellsystem. I de vist i eksempleneFigur 1, anrikning av antigenet ved immunoutfelling og bruken av fosfatase-inhibitor pervanadate var nødvendig for å oppnå tolkbare resultater. Grunnen til det kan være, at protein fosforylering av denne tyrosin kinase er ekstrem labil.
For å studere effekten av TKIs på onkogene egenskaper av akutte leukemiceller, ble kolonidannelse assays anvendes. Vi undersøkte muligheten for fangstavhengige leukemicellene til å danne kolonier i methylcellulose-basert (ALL) medium og i myk agar (AML). I eksempelet vist i figur 2A, en statistisk signifikant reduksjon i antallet koloni ble observert i en cellelinje ALL etter behandling med en TKI. Lignende resultater ble observert i AML-cellelinjer etter behandling med TKIs i myk agar. På figur 2B er det en tendens mot redusert koloni nummer i respons til behandling med TKI og reduksjonen vises doseavhengig, men forskjellen er ikke statistically betydelig som følge av variasjon mellom replikater. Legg merke til de store standardavvik i figur 2B i forhold til figur 2A. Rikelig blanding av cellene inn i det semi-fast medium, og en jevn fordeling av den semi-fast medium i brønnene eller plater er kritisk for samsvar mellom replikater i clonogenic assays. Nøyaktig telling av levedyktige celler før plettering er også viktig for å sikre overensstemmelse mellom eksperimentene. Figur 2C viser en plate med en ujevn fordeling av kolonier, bobler i myk agar, og ufullstendig spredning av myk agar i platen (høyre panel), og en plate med tilfredsstillende plettering for sammenligning (venstre panel). For å sikre at methylcellulose ikke tørke ut i løpet av inkubasjonsperioden er det også viktig å ta med plater av sterilt vann i hver tallerken. Dehydrering av methylcellulose medium forandrer tetthet og derved reduserer muligheten for cellene til å danne kolonier, potensielthindre generasjon av nyttige resultater.
For å avgjøre om TKIs kan hemme målet protein in vivo, ble western blot analyse ansatt for å undersøke fosfor-protein og total-protein nivåer i blaster i benmarg isolert fra NSG mus transplantert med en akutt leukemi cellelinje. I eksemplet vist i figur 3, farmakodynamisk analyse avslørte en reduksjon i fosfo-protein-nivåer i leukemiske blastceller isolert fra mus behandlet med TKI i forhold til mus behandlet med kjøretøyet bare. Disse studiene demonstrerer hemming av auto-fosforylering i leukemiceller etter behandling med TKIs in vivo, noe som bekrefter at disse forbindelsene kommer til benmarg og effektivt hemmer målet. TKI D var mindre aktive enn TKI E i denne analysen. Den viste eksemplet kreves utnyttelse av pervanadate å stabilisere target fosfo-protein og gir mulighet for deteksjon.
En orthotopic mus xenograft modell av akutt leukemi i NSG mice injisert med en luciferase-uttrykk ALL cellelinje ble brukt for å vurdere effekten av behandling med et TKI på onkogene potensiale in vivo. Som vist i figur 4, mus behandlet med TKI hadde et betydelig lavere nivå av bioluminescens, noe som indikerer en redusert leukemi belastning i forhold til mus behandlet med kjøretøyet bare. Etter 10 dager med behandling, alle mus hadde et lavt nivå av bioluminescens som ikke var signifikant forskjellig mellom dyr behandlet med kjøretøyet, og dyr behandlet med TKI. I motsetning, ved 19 dager etter behandling, bærer-behandlede mus hadde signifikant høyere Bioluminescens intensitet (86,12 ± 19,17 fotoner / sekund), mens mus som ble behandlet med en høy dose av TKI hadde mye lavere signalintensitet (29.64 ± 9.04 fotoner / sek) .
Figur 1. TKIs inhiberer fosforylering av målproteinet in vitro. Cellekulturer ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av TKI A, B TKI eller TKI C i 1 time. Pervanadate ble tilsatt til cellekulturer i 3 min for å stabilisere den fosforylerte form av målproteinet. Målproteinet immunoutfelt fra cellelysater og fosfor-protein og total-protein ble oppdaget av vestlige blot. Klikk her for å se større bilde .
Figur 2. TKI reduserer kolonidannelse i akutt leukemi-cellelinjer i metylcellulose og myk agar. ALL-celler ble sådd ut i metylcellulose (A) og AML-celler ble sådd ut i soft agar (B) i nærvær av en TKI eller DMSO (kontroll over kjøretøyet). Koloniene ble tellet etter 2 uker i kultur. Gjennomsnittlige verdier og standardfeil ble avledet fra tredoble platene. (C) Representative myke agar plater med optimal fordeling av kolonier (venstre panel) eller ulik fordeling av kolonier og en delvis løsrevet myk agar (høyre panel) er vist. Klikk her for å se større bilde .
Figur 3. Behandling med TKI reduserer fosfo-protein-nivåer in vivo. A NSG mus ble transplantert med et ALL-cellelinje og behandles med en enkelt dose av TKI D, E TKI eller kjøretøyet først etter utvikling av leukemi. Bone marrow celler ble samlet inn fra lårben og behandlet med pervanadate før utarbeidelse av hele cellelysater. Immunoutfelling av målproteinet, og påvisning av fosfo-og total-protein ved Western blot ble utført. B Signal intensitet, ble beregnet ved densitometry og brøkdel av fosforylert mål protein i forhold til kjøretøy behandlede dyr ble beregnet. Klikk her for å se større bilde .
Figur 4. Behandling med TKI forsinker sykdomsutvikling i mus transplantert med en luciferase-uttrykkende human ALL cellelinje. NSG mus ble transplantert med et monoklonalt populasjon av luciferase-transduced alle celler ved injeksjon i halenvene. D-luciferin ble injisert intraperitonealt og Bioluminescens bildene ble tatt to ganger ukentlig (Bining: 8, FOV 19.6, f / stopp 1, eksponeringstid 120 sek). A Pseudo bilder blir vist som viser økt Bioluminescens intensitet over tid på mus transplantert med leukemiceller og en doseavhengig reduksjon i bioluminesens intensitet hos dyr behandlet med en TKI. B Kvanitifisering av gjennomsnittlig bioluminescence intensitet og standard feil for hver studiegruppe. Klikk her for å se større bilde .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne manuskriptet beskriver en effektiv strategi for evaluering av nye tyrosin kinase inhibitorer for behandling av akutt leukemi. Ved hjelp av denne metode, er biokjemiske og antileukemi aktiviteter beregnes først i celle-baserte analyser in vitro og in xenograft-modeller in vivo. Immunoblotanalyse ble med hell anvendt for å demonstrere inhibering av target-tyrosinkinase hos leukemiceller etter behandling med TKIs og å direkte sammenligne styrken av flere forbindelser i celler. I den protokoll som presenteres her, ble pervanadate brukt til å stabilisere fosfo-protein og målproteinet ble konsentrert ved immunoutfelling. Hvis disse målingene var tilstrekkelig til å tillate deteksjon ved western blot, ble nivåene av fosfo-protein også økes ved tilsetning av liganden, enten med eller uten pervanadate. På samme måte kan liganden bli tilsatt til oppløsningen som brukes til å spyle benmargen for farmakodynamiske studier. Ligand kan renses eller, i noen tilfeller, kan tilveiebringes som en komponent av føtalt bovint serum. I det tilfelle at disse metodene ikke gir mulighet for detektering av auto-fosforylert tyrosin-kinase, kan nedstrøms mål også brukes for vurdering av target-hemming, selv om det er å foretrekke for å vurdere aktiviteten av målproteinet direkte når det er mulig. Av notatet, bør det utvises forsiktighet ved tolkning av resultatene av forsøk med pervanadate, som er en ikke-selektiv fosfatase inhibitor som rammer mange cellulære proteiner. Av denne grunn bør pervanadate ikke benyttes til påvisning av forandringer i nedstrøms signalkomponentene.
Før å studere i dyremodeller, er det ønskelig å bekrefte anti-leukemi-aktivitet mediert av TKIs i leukemiceller. For disse studiene vi stole på clonogenic essay i methylcellulose eller myk agar medium. Mens andre assays kan også bli brukt for å evaluere anti-tumoreffekter i kultur, kolonidannelse analyser er ofte mer predictive av in vivo-effektiviteten i forhold til mer tradisjonelle analyser som vurderer proliferasjon og / eller overlevelse i flytende kultur. Imidlertid kan disse assays anvendes sammen med kolonidannelse analyser for å evaluere mekanismene for anti-leukemi-aktivitet formidlet av TKIs, og kan også være nyttig i det tilfelle at en cellelinje av interesse ikke danner kolonier. Nærmere bestemt, kan det være nyttig å vurdere induksjon av apoptose i respons til behandling med TKIs hjelp flowcytometrisk assays for å bestemme nivåene av de spaltede / aktiverte kaspaser, økt binding av Annexin V til celleoverflaten, eller differensial opptak av YOPRO-1-jodid . Tilsvarende redusert proliferasjon eller indusere differensiering kan også bidra til anti-leukemi-aktivitet. Som sådan, kan vekstkurver genereres i nærvær og fravær av TKI å vurdere proliferasjon og cellulær morfologi og endringer i ekspresjonen av celleoverflatemarkører kan bli undersøkt for å bestemme differensieringsstadiet. Bruken av clonogenicanalysene er godt etablert innen legemiddelutvikling og fungerer som et kostnadseffektivt verktøy for evaluering av TKIs. Imidlertid er det kjent at systematiske endringer i forholdene kultur (inkludert tilsetning av vekstfaktorer og andre tilskudd, variasjoner i serum sammensetning, og forskjeller i pH-verdien i oppløsningen TKI) kan påvirke både kolonivekst og kjemosensitivitet 9,10. Derfor er konsistens i dyrkningsbetingelser kritisk for reproduserbarhet i denne analysen. Ujevn fordeling av celler eller TKI kan også føre til feiltolkning av effekt av eksperimentelle behandling (Figur 2C). I tillegg til evaluering av mer enn ett tidspunkt for kolonitelling eller plette etter legemiddeleksponering kan bidra til å skille mellom stoffene som formidler anti-proliferative virkninger, men har ingen kureringspotensiale 7..
In vivo studier beskrevet her representerer et viktig skritt på veien mot Clinical anvendelsen av et TKI. Farmakodynamiske studier som viser målet hemming er viktig å definere relevante dose og hyppigheten av administrasjonen for senere studier for å evaluere effekten. I de fleste tilfeller er det å foretrekke å oppnå fullstendig og kontinuerlig hemming av målproteinet, og dette kan kreve behandling mer enn en gang om dagen. I tillegg kan inhibering av leukemogenesis og økt overlevelse ved xenograft-modeller krever en høyere dose av TKI enn det som kreves for fullstendig og kontinuerlig biokjemiske inhibering i benmargen. Dette kan skje fordi leukemi etablerer på flere steder, og eksponering for TKIs kan være heterogene i ulike anatomiske steder, inkludert hjernen, eller det kan reflektere begrensninger i sensitivitet som resulterer i en manglende evne til å påvise begrensede gjenværende mengder av aktiv målprotein ( dvs. ufullstendig mål hemming). Ikke desto mindre, i motsetning til tradisjonelle cytotoksiske terapier som administreres på sitt maksimaletolererte dose, kan flere tumorselektiv molecularly målrettede midler være like effektive ved lavere doser som er tilstrekkelige for biokjemisk inhibering av målproteinet, men er ikke forbundet med betydelige toksisiteter. Således, for denne klassen av stoffer, innledende studier for å evaluere effekten av en TKI på leukemi progresjon i xenograft-modeller ofte benytte den minimale dose som er nødvendig for å oppnå fullstendig og kontinuerlig inhibering av målet. Hvis ingen effekt på leukemi progresjon eller overlevelse er observert, kan dosen økes til toksisitet er observert. Disse modellene kan også brukes for å undersøke virkningene av en TKI administreres i kombinasjon med standard leukemi terapier, for derved å informere utvikling senere kliniske protokoller.
Etableringen av xenograft modeller av akutt leukemi som bruker luciferase-uttrykke celler representerer et stort fremskritt i forhold til mer tradisjonelle xenograft modeller og har potensial til betydelig akselerereprosessen med medisiner og utvikling 11. Bioluminescence avbildning muliggjør ikke-invasiv bestemmelse av langsgående leukemi belastning, og dermed redusere antall dyr er nødvendig for undersøkelser, og kan også gi informasjon om den anatomiske stedet for sykdom. I tillegg, i et forsøk på å utvide på potensielle kliniske verktøy av TKIs, Bioluminescens imaging kan være reproduserbart oppnås etter transplantasjon av primære humane luciferase-merket pasientprøver 12. Men, kan tolkningen av Bioluminescens bildene være utfordrende på grunn av posisjons usikkerheten i light-emitting celler og dermed in vivo Bioluminescens bildebehandling bør bare brukes som en semikvantitativ verktøy for å følge samme dyret under identiske forhold 13.
I den heldige tilfelle at flere forbindelser har betydelig og sammenlignbar aktivitet i de analysene som er beskrevet her, tilleggskriterier som kan brukes for videre Ranking-forbindelser inkluderer relativt enkelt av forbindelse syntese, løselighet, graden av oral biotilgjengelighet, farmakokinetiske egenskaper, og toksikologiske studier. Til sammen skal disse dataene gir mulighet for identifikasjon av et optimalt sammensatt for progresjon til klinisk undersøkelse og er nødvendig for å støtte innlevering av en eksperimentell nytt legemiddel (IND) søknad med Food and Drug Administration (FDA) for å muliggjøre kliniske studier. Når du har generert disse kritiske pre-kliniske data som er nødvendige for fremme av disse nye midler inn i klinikken, bør utnyttelse av National Institute of Health i Cancer Therapy Evaluering Program (CTEP) vurderes. I dette programmet kliniske studier er sponset for å evaluere nye anti-kreft agenter, med særlig vekt på translasjonsforskning. Forsiktighet bør utvises for å samordne offentlig presentasjon av pre-kliniske data, herunder beskrivelse av strukturer og syntese av nye forbindelser, med innlevering av patentsøknader til vernt immaterielle rettigheter. Generelt sett data skal ikke offentliggjort før patentsøknader beskyttende sammensetning av stoff og fremgangsmåter for anvendelse er blitt inngitt.
I konklusjonen, har vi demonstrert en effektiv strategi for å undersøke og vurdere potensialet i romanen TKIs som terapeutiske midler for behandling av akutt leukemi. Target inhibering i leukemiceller, både i kultur, og isolert fra benmarg hos mus med humane leukemi-xenografter, kan vurderes ved immunoblot. Den funksjonelle betydningen av målet hemming kan evalueres ved hjelp clonogenic analyser og ortotopiske murine xenograft modeller med selvlysende bildebehandling. Sammen disse analysene gi kritisk pre-kliniske data som er nødvendige for fremme av disse romanen translasjonsforskning agenter inn i klinikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
In vivo avbildning ble utført ved hjelp av IVIS Shared Resource ved University of Colorado Cancer Center (støttet av stipend P30-CA046934). Flowcytometri ble utført ved flowcytometri Shared Resource, University of Colorado Cancer Center (støttet av stipend P30CA046934). Dette arbeidet ble støttet delvis av National Institutes of Health (RO1CA137078 til DKG). ABLS er Fellow Pediatric Scientist Development Program, støttet med tilskudd fra American Academy of Pediatrics, American Pediatric Society, og Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (K12-HD000850).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Hydrogen Peroxide | MP Biomedicals | #02194057 | GHS05, GHS07, H302-H318 |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | #S6508 | GHS07, H302+ H312+H332 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | #M7522 | GHS05, GHS06, GHS08, GHS09, H301 + H331-H310-H315-H317-H318-H373-H410 |
| ColonyGel Human Base Medium | ReachBio | #1101 | |
| 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) | Sigma | #M5655 | GHS07, GHS08, H315-H319-H335-H341 |
| Difco Noble Agar | BD Biosciences | #214883 | |
| Nitrotetrazolium Blue Chloride | Sigma | #N6639 | GHS07, H302 |
| D-Luciferin Firefly, Potassium Salt | PerkinElmer | #122796 | |
| 4',6- Diamidino-2-phenylindole dihydochloride | Sigma | #D9542 | |
| FITC CD45 | BD Bioscience | #347463 | |
| FITC Mouse IgG1 Isotype control | BD Bioscience | #51-35404X-2 | |
| Gentamycin Sulfate | Sparhawk | #NDC58005-633-04 | |
| Protease Inhibitors | Roche | #11836153001 | |
| DNase | Sigma | #D4263 | |
| Protein G Beads | Invitrogen | #10-1242 | |
| Isofluran | VETONE | #NDC13985-030-60 | |
| Equipment | |||
| Cell culture dishes, diam. 35 mm × H 10 mm | Nunclon | #D7804-500EA | |
| Cell culture dishes, diam. 100 mm x H 20 mm | Nunclon | #D8429-1CS | |
| 6-well plates | BD Bioscience | #353046 | |
| 14 gauge x 4 inch blunt-end needles | Cadence science | #7956 | |
| 5 ml syringe with luer-lok | BD Bioscience | #309646 | |
| GelCount automated colony counter | Oxford Optronix | ||
| In vivo bioluminescence imaging system | PerkinElmer | #IVIS200 | |
| Scout pro portable balances, scale | Ohaus | #SP202 | |
| Broome style rodent restrainer | Plas-labs | #551-BSRR | |
| Ear punch, punch diameter: 2 mm | FST | #24210-02 | |
| Chlorhexidine swabs, Prevantics | PDI | #B10800 | |
| Insulin syringe 1 mL (40 Units) 29 G x 1/2 | Monoject | #8881500042 | |
| Plastic feeding needles for rodents (disposable) 20 ga x 38 mm, sterile | Instech | #FTP-20-38 | |
| 1 mL Luer-Lok disposable syringe | BD Bioscience | #309628 | |
| Lo-Dose U-100 insulin syringe with 28 G x ½, permanently attached needle | BD Bioscience | #329465 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | #14084-08 | |
| Student fine scissors | FST | #91460-11 | |
| Moria ultra fine forceps | FST | #11370-40 | |
| Extra fine graefe forceps | FST | #11150-10 | |
| Scalpel handle | FST | #10003-12 | |
| Scalpel blades | FST | #10011-00 |
References
- Jemal, A., Siegel, R., Xu, J. Cancer Statistics. 2010. CA Cancer J. Clin. 60, 277-300 (2010).
- Kaatsch, P. Epidemiology of childhood cancer. Cancer Treat Rev. 36, 277-285 (2010).
- Pui, C., Mullighan, C., Evans, W., Relling, M. Pediatric acute lymphoblastic leukemia: where are we going and how do we get there? Blood. 120, 1165-1174 (2012).
- Forman, S., Rowe, J. M. The myth of the second remission of acute leukemia in the adult. Blood. 121, 1077-1082 (2013).
- Ohanian, M., Cortes, J., Kantarjian, H., Jabbour, E. Tyrosine kinase inhibitors in acute and chronic leukemias. Expert Opin Pharmacother. 13, 927-938 (2012).
- Mikalsen, S., Kaalhus, O. Properties of pervanadate and permolybdate. Connexin43, phosphatase inhibition, and thiol reactivity as model systems. J. Biol. Chem. 273, 10036-10045 (1998).
- Zips, D., Thames, H., Baumann, M. New anticancer agents: in vitro and in vivo evaluation. In Vivo. 19, 1-7 (2005).
- Christoph, S., et al. Bioluminescence imaging of leukemia cell lines in vitro and in mouse xenografts: Effects of monoclonal and polyclonal cell populations on intensity and kinetics of photon emission. J. Hematol. Oncol. 6, 10 (2013).
- Endresen, L., Tveit, K., Rugstad, H., Pihl, A. Chemosensitivity measurements of human tumour cells by soft agar assays are influenced by the culture conditions. Br. J. Cancer. 51, 843-852 (1985).
- Tveit, K., Endresen, L., Rugstad, H., Fodstad, O., Pihl, A. Comparison of two soft-agar methods for assaying chemosensitivity of human tumours in vitro: malignant melanomas. Br. J. Cancer. 44, 539-544 (1981).
- Rudin, M., Weissleder, R. Molecular imaging in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 2, 123-131 (2003).
- Barrett, D., et al. Noninvasive bioluminescent imaging of primary patient acute lymphoblastic leukemia: a strategy for preclinical modeling. Blood. 118, 112-117 (2011).
- Rice, B., Cable, M., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J. Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
